実験方法

3.2.1 材料

FBS，penicillin（10,000 units/mL）-streptomycin（10,000 µg/mL），High-Capacity RNA-to-cDNA^TM Kit，TaqMan^® Gene Expression Master Mix，TaqMan^® Gene Expression Assay，SYBR™ Select Master Mix は Thermo Fisher Scientific Inc.

（Waltham，MA，USA）から購入した．DMSO は富士フイルム和光純薬株式会 社（Osaka，Japan）から購入した．RM101 medium及びCell-able^® 24-well plates は東洋合成工業株式会社（Tokyo，Japan）から購入した．Collagen I-coated 24-well

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platesはAGCテクノグラス株式会社（Shizuoka，Japan）から購入した．RNeasy Mini Kit及びQIAshredderはQIAGEN（Hilden，Germany）から購入した．3T3 Swiss albino

（3T3）cellsはJapan Collection of Research Bioresources Cell Bank（JCRB9019， Osaka，Japan）から購入した．その他の試薬は全て特級品を使用した．

3.2.2 動物

雄10頭及び雌2頭のフィリピン産カニクイザル（2～6歳）を使用した．本実 験は，AAALAC完全認証を取得している株式会社イナリサーチにおける動物実 験審査のもとで行われた．

3.2.3 カニクイザル肝細胞の調製及び凍結保存

カニクイザル肝細胞の調製方法及び凍結方法は 2.2.3 項及び 2.2.4 項に従い実 施した．6頭のカニクイザル（3 頭を新鮮肝細胞用，3頭を凍結肝細胞用）をオ メプラゾール及びリファンピシン曝露試験に使用した．さらに別の 6 頭のカニ クイザル（3頭を新鮮肝細胞用，3頭を凍結肝細胞用）をフェノバルビタール曝 露試験に使用した．

3.2.4 フィーダー細胞の培養

フィーダー細胞（Swiss 3T3細胞）は10%FBSとペニシリン・ストレプトマイ シン含有 DMEM 培地で培養し，24 ウェルコラーゲン I コートプレート及び Cell-able^®プレートに4×10⁴ cells/wellになるよう播種し，カニクイザル肝細胞を 播種するまでの3日間，5%CO2濃度，37°C条件で培養した．

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3.2.5 新鮮及び凍結肝細胞の培養

新鮮及び凍結肝細胞の培養については 2.2.6 項及び 2.2.7 項に記載した方法で 行った．

新鮮肝細胞及び凍結肝細胞は，単層培養用には 2.5×10⁵ 生細胞/ウェルとなる よう24 ウェルコラーゲン Iコートプレートに播種した．共培養及び 3Dスフェ ロイド培養用にはフィーダー細胞上に 1×10⁵ 生細胞/ウェルとなるよう 24 ウェ ルコラーゲンI コートプレートまたはCell-able^® プレートにそれぞれ播種した．

RM101を培養培地とし，5%CO2濃度，37°C条件で培養した．培養期間は，一般

的な短期培養として3日間，長期培養として28日間を選択し，推移を検証する ために7日間と14日間の培養も行った．

3.2.6 酵素誘導剤の曝露

リファンピシン，オメプラゾール及びフェノバルビタールはDMSOに溶解し，

それぞれ50 mM，50 mM，1000 mMのストック溶液を調製した．使用時に，ス

トック溶液をRM101培地で1000倍希釈し，それぞれ50 μM，50 μM，1000 μM

（最終DMSO濃度は0.1%）とした．0.1%DMSO含有RM101培地を媒体コント

ロールとした．

培養2日目，4日目，11 日目，25日目に誘導剤を含む培地に交換し，短期培 養では24時間，それ以外は3日間n=3で曝露した．

3.2.7 Total RNAの調製及びリアルタイムPCR解析

培養3日目，7日目，14日目，28日目に細胞を回収し，Total RNA調製に使用 した．Total RNAはQIAshredder及びRNeasy Mini Kitを用いて調製した．Total

RNA濃度をNanoDropで測定し，純度を確認した．

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High-Capacity RNA-to-cDNA^TM Kitを用いて，Total RNAから一本鎖cDNAを合 成した．各cDNAはNuclease-free waterで25倍希釈しリアルタイムPCR測定に 使用した．HPRTをリファレンス遺伝子として補正に用いた．CYP1A1，CYP3A8 及びHPRTの発現解析にはTaqMan^® Gene Expression Master Mix，300 nMフォワ ードプライマー及びリバースプライマー，200 nM TaqMan^®プローブの混合液に cDNA テンプレートを加えた．PXR，AHR 及び CAR の発現解析には SYBR™

Select Master Mix，300 nMフォワードプライマー及びリバースプライマーの混合

液にcDNAテンプレートを加えた（プライマーの塩基配列はTable 7に示した）． CYP2B6，CYP2C43 及び CYP2C75 の発現解析には TaqMan^® Gene Expression Master Mix 及 び TaqMan^® Gene Expression Assay（ そ れ ぞ れ Assay ID:

Mf03043065_m1，MF04363679_m1，Mf04363854_m1）の混合液にcDNAテンプ レートを加えた．測定はViiA7を用いて行い，データ解析はViiA7ソフトウェア を用いた検量線法により行った．平均と S.D.は 3 頭のカニクイザルから算出し た．

Table 7. Primers of the nuclear receptor for real-time PCR analysis.

Target genes Primer sequences (5'→3')

AHR

Forward primer AAAATGAAGCATATGCAAGTTAATGG

Reverse primer TCTTGCCGTGGACAACTGAA

CAR

Forward primer GCAAGTCATCAAGTTTACCAAGGA

Reverse primer TGAGAAGGGAGATCTGGTCTTCA

PXR

Forward primer ACGCTCAGATGAAAACCTTTGAC

Reverse primer GGCATCTCACAGCCACTGCTA

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