第 3 章 高感度融解曲線解析（ HRMA ）を用いた ヒスタミン生成菌の迅速同定法の検討
3.2. 実験方法
3.2.1 供試菌株
本実験では、供試菌株として、中温性Hm生成菌はM. morganii 3株 （ATCC 35200、
JCM 1672、AP28）、R. planticola 3株 （ATCC 43176、4131、8433）、E. aerogenes 3 株 （ATCC 43175、8D29、5-6-3011）、P. damselae subsp. damselae 3株 （ATCC 33539、
JCM8968、6J29-1）、P. vulgaris 3株（AU34、AU33、AU36）、Erwinia spp. 1株（MB31） を用い、低温性Hm生成菌はP. phosphoreum 4株（IAM 12085、MB 36、2-8-1510、
5-4-1520）、P. iliopiscarium 6C1521株、P. kishitanii 4株（ATCC BAA-1194、4D152、
7I1524、7-9-157）およびP. aquimaris 2株（N14、8I156）を用いた。
上記供試菌株のうちATCC株はThe American Type Culture Collectionより、JCM 株は The Japan collection of Microorganisms より、IAM 株は Institure of Applied Microbiologyより譲渡された。その他の株はTakahashi et al.（2003）および第1章 で行った分離実験において鮮魚より分離された菌株を用いた。さらに、本実験の対 照として、Klebsiella pneumonia 5A15株（鮮魚由来分離菌株）を用いた。
3.2.2. DNA抽出
供試菌株を1.5％ NaCl添加 Trypticase Soy broth（BD）に接種し、中温性Hm生 成菌は30ºCで24時間、低温性Hm生成菌は15ºCで48時間培養した。培養後、1 mL の菌液を8,000×g、5分、4ºCで集菌した。得られたペレットからNucleoSpin® Tissue
（タカラバイオ株式会社、滋賀）を用いて説明書の指示に従ってDNA抽出を行っ
た。DNA抽出物は-20ºCで保存し、使用時に 5 ng/μLに希釈したものをPCR 及び
PCR-HRMAに供した。
3.2.3. プライマー設計
本実験でプライマー作成に用いたhdc遺伝子配列M. morganii 10株（ATCC 25830、
ATCC 35200、JCM 1672、AP28、BO249、BO25、BR119、HPP301、HPP309、87411）
（accession number AB083200、AB083201、AB083202、FJ469557、FJ469558、FJ469559、 FJ469560、FJ469561、FJ469562、FJ469563）、R. planticola 3株（ATCC 43176、4131、
8433）（AB083205、AB083206、FJ469564）、 R. ornithinolytica 2株（HPP15、HPP19）
（FJ469565、FJ469566）、P. damselae subsp. damselae 7株（ATCC 33539、JCM 8968、
BR100、BR107、BR132、BR147、BR165）（AB084251、AB084252、FJ469569、FJ469570、
FJ469571、FJ469572、FJ469573）、P. vulgaris 1株（AU34）（AB083204）、Erwinia spp.
1株（MB31）（AB083208）およびP. phosphoreum 3株（NBRC 13896、MB36、YS4-7）
トをとり、得られたアライメントの4-137部位134 bpを増幅するようにプライマー を作成した（Fig. 6）。Forward primer（hdcH-f）：5’-ATY AVY AAC TGB GGT GAY TGG-3’及びreverse primer（hdcH-r）：5’-TTV GTN ACR TAV CCC CAG C-3’はファス マック（FASMAC Co. Ltd., 神奈川）に依頼して作成した。
3.2.4. hdc特異的プライマーを用いたPCRおよびHRMA
作成したプライマーの特異性を確認するために、M. morganii ATCC 35200、R.
planticola ATCC 43176、E. aerogenes ATCC 43175、P. damselae subsp. damselae ATCC 33539、P. vulgaris AU34、Erwinia spp. MB31、P. phosphoreum IAM 12085およびK.
pneumoniae 5A15株をPCRに供した。PCR反応にはLightCycler® 480 High resolution melting Master（Roche Applied Science, Penzberg, Upper Bavaria）を用い、反応組成は Table 8に示した。PCR反応にはVeriti thermal cycler（Life Technologies Corp.）を用 い、PCR条件は95ºC 5分、45cycle（95ºC 10秒-56ºC 50秒-72ºC 10秒）で行った。
PCR反応後、増幅産物は3% NuSieveTM 3:1 agarose（タカラ）を用いて100 bp ladder
（GE Healthcare Bio-Science Corp.）と共に100 V、40分で電気泳動を供した。電気 泳動後はエチジウムブロマイドで5分間染色後、特異的なバンドの確認を行った。
PCRおよびHRMA（PCR-HRMA）をM. morganii 3株（ATCC 35200、JCM 1672、 AP28）、R. planticola 3株（ATCC 43176、4131、8433）、E. aerogenes 3株（ATCC 43175、
8D29、5-6-3011）、P. damselae subsp. damselae 3株（ATCC 33539、JCM8968、6J29-1）、 P. vulgaris 3株（AU34、AU33、AU36）、Erwinia spp. 1株（MB31）、P. phosphoreum 4株（IAM 12085、MB 36、2-8-1510、5-4-1520）、P. iliopiscarium 1株（6C1521）、P.
kishitanii 4株（ATCC BAA-1194、4D152、7I1524、7-9-157）およびP. aquimaris 2株
（N14、8I156）を用いた。PCR-HRMAはLightCycler ® Nano（Roche）を用いて行 った。反応条件はPCR反応後、95ºC 60秒及び 40ºC 60秒のプレヒーティングを行 い、1秒間につき0.1ºCの温度上昇で70ºCから85ºCまで加熱融解変性を行った後
に、40ºC 10分の加熱とした。HRMA条件のプログラミングおよび得られたデータ
の解析はLightcycler® Nano Software version 1.1（Roche）を用いて行い、融解曲線及 び Tm値を求めた。融解曲線は、蛍光強度の減少に対する温度推移の変化（dF/dT）
によって求められた。さらに中温性Hm生成菌6菌種、低温性Hm生成菌4菌種お よびErwinia spp.、P. phosphoreumおよびP.kishitaniiのDifference melting curveを作 成した。Difference melting curveを作成するにあたって、融解曲線の直線回帰を行 った。融解曲線の直線回帰においては、蛍光強度推移領域の前後領域において正規 化を行った。その後、標準となる菌株を選択し、標準株の融解曲線に対する Difference melting curveを求めた。本実験は3回繰り返して行った。