図

図2

図2 4NQOによる化学発がん誘導メカニズムの概要

4-ニトロキノリン-1-オキサイド（4-nitroquinoline-1-oxide；4NQO）の発がん機序は、

Nqo1 に よ っ て代謝 さ れ た 4-ヒ ド ロ キ シア ミノ キ ノ リ ン-1-オ キ サ イ ド （

4-hydroxyaminoquinoline-1-oxide; 4HAQO）のDNA付加と、活性酸素種の発生によ

る酸化的DNA障害に分けられる。

図3 図3

Esophagus

A

Human K5 promoter CreERT2 PolyA Intron

300 μm

Tongue Stomach Skin

(–)

(+) 1 week24 weeks

C

(+)

(–) Tam x3

fore hind

Stop td Tomato

loxP loxP

K5CreERT2

Rosa26

R26-tdTomato

✕

kidney liver

1 week

D

Tam x3 1 W 24 W

B

Tam x3 (+)

300 μm

図3 扁平上皮特異的かつ誘導的遺伝子改変マウスの発現解析

（A）K5CreERT2の構造。ヒトKeratin5のプロモーター下に発現する誘導的な Creタンパク質。Rosa26-tdTomatoレポーターマウスとの交配。（B）タモキシフェ

ン（Tam）3日間投与後の解析スケジュール（C）K5CreERT2::TdTomatoマウスの

扁平上皮組織における蛍光の発現。Tamあるいは溶媒投与後、1週後と24週後を解

析。白い矢印は前胃と後胃の境界を示す。（D）K5CreERT2::TdTomatoマウスの組

織における蛍光の発現。Tam投与後1週後の解析。

図4

K5CreERT2-Keap1^FB/FB

Nrf2Keap1HE

Keap1^FB/FB

g-H2A.X B

Cell layer Keratinous layer

G

Nqo1

図4 A

Tam x3 1W

I

200 μm

50 μm 20 μm

□Keap1^FB/FB

■K5CreERT2-Keap1^FB/FB

50 μm

0 10 20 30 40

1

**

g-H2AX⁺cells (%) K

D

0 200 400 600 800

1

The number of basal layer cells

*

0 25 50 75

1w

F

*

Keratinous layer (μm) E Cell layer (μm)

**

0 20 40 60 80 100 120

1w

C

H

J

図4 食道上皮における誘導的なKeap1欠失は上皮の異形成を生じる

（A）実験スケジュール。（B）（C）HE染色像。食道の横断面を示す。黄色い点線

は基底膜を示す。白い点線はKeap1欠失細胞とKeap1陽性細胞の境界線を示す。

黄色い矢印と黒い矢印はそれぞれ細胞層の厚さと角層の厚さを示す。黒枠で囲んだ

領域は（B）においては同パネル右上の拡大部分を（C）においては右パネルへの拡

大部分を示す。（D）4Bと4Cにおける基底細胞の数。一横断面の総数を数えたも

の。N=5-6。（E）4Bと4Cにおける細胞層の厚さ。1組織あたり3箇所の厚さを測

定し、平均値を評価。N=5-7。（F）4Bと4Cにおける角層の厚さ。N=5-7。（G）

（H）Keap1、Nrf2、Nqo1の免疫組織化学染色。（J）（I）γH2A.Xの免疫組織化

学染色（K）4Jと4Iにおける基底細胞に対するgH2A.X陽性細胞の割合。N=5-6。

グラフのデータは平均値±標準偏差を表示している。*, P<0.05, **, P<0.01。

図5 図5

A

Tam x3 2 W 4 W 12 W

B

□Keap1^FB/FB ■K5CreERT2-Keap1^FB/FB Keap1^FB/FB

2 W

Nrf2Keap1HEg-H2A.X

C

D C

Keratinous layer Cell layerKeratinous layer

Cell layer

Nqo1

K5CreERT2-Keap1^FB/FB

200 μm

50 μm

2 W 4 W 12 W

0 20 40 60

2w 4w 12w

0 50 100 150

2w 4w 12w G

F E Keratinous layer

(μm)

2 W 4 W 12 W

Cell layer (μm)

** *

2 W 4 W 12 W

The number of basal layer cells

n.s. n.s.

n.s. n.s.

0 500 1000 1500

1 2 3

2 W 4 W 12 W

n.s. n.s. * **

0 5 10 15 20 25

1 2 3

2 W 4 W 12 W g-H2AX⁺cells (%) H

**

** ^n.s.

**

図5 Keap1欠失により誘導された食道異形成は経時的変化を伴う

（A） 実験スケジュール。（B）HE染色像。食道の横断面を示す。黒枠で囲んだ領

域は下パネルへの拡大部分を示す。黄色い矢印と黒い矢印はそれぞれ細胞層の厚さ

と角層の厚さを示す。（C）Keap1、Nrf2、Nqo1の免疫組織化学染色（D）gH2A.X

の免疫組織化学染色（E）5Bにおける角層の厚さ。1組織あたり3箇所の厚さを測

定し、平均値を評価。N=3-5。（F）5Bにおける基底細胞の数。一横断面の総数を数

えたもの。N=3-5。(G) 5Bにおける細胞層の厚さ。N=3-5。（H）5Dにおける基底

細胞に対するγH2A.X陽性細胞の割合。N=3-5。グラフのデータは平均値±標準偏

差を表示している。*, P<0.05, **, P<0.01。

図6

図6 誘導的Keap1欠失によるNrf2の活性化と経時的なNrf2活性の減弱

（A） 実験スケジュール。（B）食道上皮におけるKeap1遺伝子の組換え効率。残

存したKeap1遺伝子を評価している。N=3-5。（C）Keap1^のmRNA発現レベル。

N=4-6。rRNAの発現レベルを内部標準とする。Keap1^FB/FBマウスの発現レベルを

1とする。（D）Nqo1、Gclc、Nrf2^のmRNA発現レベル。N=4-6。グラフのデータ

は平均値±標準偏差を表示している。*, P<0.05, **, P<0.01。

0 30 60 90 120

1w 2w 4w 12w

0.59 0.63

0.82

0.44 0

0.3 0.6 0.9 1.2 1.5

1w 2w 4w 12w B

D

0.64 0.72

0 0.5 1 1.5

1W 12W

** **

n.s.

* * ^n.s.

Nrf2 Nqo1

Keap1 mRNA

Gclc

Remaining Keap1 DNA (fold) Keap1 DNA

Relative mRNA level

□Keap1^FB/FB

■K5CreERT2-Keap1^FB/FB

**

1 W 2 W 4 W 12 W

0 5 10 15 20

1w 2w 4w 12w

**

n.s.

**

**

Relative mRNA level

*

n.s.

**

**

1 W 2 W 4 W 12 W 1 W 2 W 4 W 12 W

n.s.

n.s.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

1 w^{1 W} 2w^{2 W} 4w^{4 W} 12w^{12 W}

n.s.

n.s. n.s. n.s.

**

A

Tam x3

1 W 2 W 4 W 12 W

C 図6

図7

図7 誘導的Keap1欠失は分化障害と増殖促進を引き起こす

（A）Keratin5^のmRNA発現レベル。N=4-6。rRNAの発現レベルを内部標準とす

る。Keap1^FB/FBマウスの発現レベルを1とする。（B）Loricrin^のmRNA発現レベ

ル。N=4-6。（C）Keratin6^のmRNA発現レベル。N=4-6。（D）Ki67^のmRNA発

現レベル。N=4-6。グラフのデータは平均値±標準偏差を表示している。*, P<0.05,

0 2 4 6 8 10

1w 2w 4w 12w

*

n.s. n.s.

Ki67

0 25 50 75 100 125

1w 2w 4w 12w

A

n.s.

**

**

Keratin5

n.s.

n.s.

図７

Relative mRNA level

Relative mRNA level

D

*

**

□Keap1^FB/FB ■K5CreERT2-Keap1^FB/FB

0 0.5 1 1.5 2

1w 2w 4w 12w

**

n.s.

*

Loricrin

n.s.

Relative mRNA level

B

**

1 W 2 W 4 W 12 W

Relative mRNA level

0 100 200 300 400

1w 2w 4w 12w

**

n.s.

**

Keratin6

n.s.

C

**

1 W 2 W 4 W 12 W 1 W 2 W 4 W 12 W

1 W 2 W 4 W 12 W

図8

0 0.5 1 1.5

1

0 20 40 60

C 1

Keap1^FB/FB Keap1^FA/FA

Keratinous layer Cell layer

D A

HE

Keratinous layer (μm)

Cell layer (μm)

0 20 40 60

1

**

n.s.

B

50μm 200μm

Keratin5

*

0 0.5 1 1.5 2 2.5

1

Loricrin

n.s.

Relative mRNA level

図8

□Keap1^FB/FB ■Keap1^FA/FA

Keratin6

*

0 1 2 3 4

1

図8 誘導的Keap1欠失マウスとKeap1低発現マウスは食道の表現型が異なる

（A）HE染色。食道の横断面を示す。黒枠で囲まれた領域は下パネルへの拡大部分

を示す。黄色い矢印と黒い矢印はそれぞれ細胞層の厚さと角層の厚さを示す。（B） 8Aにおける角層の厚さ。1組織あたり3箇所の厚さを測定し、平均値を評価。

N=5-6。（C）8Aにおける細胞層の厚さ。N=5-6。（D）Keratin5、Loricrin、Keratin6^の

mRNA発現レベル。N=4-6。rRNAの発現レベルを内部標準とする。Keap1^FB/FBマ

ウスの発現レベルを1とする。グラフのデータは平均値±標準偏差を表示してい

る。*, P<0.05, **, P<0.01。

図9 図9

FB/FB

FB/FB::Cre 0

1 2 3

maximum tumor size

mm

Tam x3 Analyses

4NQO 12W Water 12W

0 10 20

60 80 100 120 140

post 4NQO-administration week

rate of change

body weight

FB/FB FB/FB:Cre

4NQO 12W Water 12W

Tumor number (>1 mm)

Maximum tumor size (mm) Body weight (%)

Week after 4NQO administration

A

C

D

K5CreERT2-Keap1^FB/FB Keap1^FB/FB

Invasive cancer G

100 µm

**

-1

0 12 24

■Keap1^FB/FB

■K5CreERT2-Keap1^FB/FB

B

F

H

Remaining Keap1DNA (fold)

0.0 0.3 0.6 0.9 1.2

FBFB FBFBCRE 1

W FBFBCRE … Keap1^FB/FB K5CreERT2 -Keap1^FB/FB

0 W 24 W

** **

0 W

K

Keap1^FB/FB K5CreERT2-Keap1^FB/FB 24 W

– 4NQO 4NQO

J HEKeap1

Non-tumors

FB/FB

FB/FB::Cre 0

2 4 6

tumor number

tumor (>1mm)

*

Keap1FB/FB

Keap1FB/FB::K5-C re 0

1 2 3 4 5

number

invasive cancer

*

Keap1 DNA

100 µm

E

I _Tumors

Keap1

6

4

2

0

3

2

1

0

3 2 1 0 4 5

100 µm

Tumors Keap1

High Low Null

Keap1 ^FB/FB

(n = 17) 17

(100%) 0

(0%) 0

(0%) K5Cre-Keap1^FB/FB

(n = 27) 26

(96%) 1

(4%) 0

(0%) K5CreERT2-Keap1^FB/FB

Keap1^FB/FB

図9 発がんpre-protocolにおけるKeap1の欠失はがん形成を促す

（A）タモキシフェン（Tam）と4NQOの投与を行うpre-protocolの実験スケジュ

ール（B）体重変化。4NQO投与開始時を100%の体重として計算。N=11-12。

（C）4NQO pre-protocol完遂時の食道粘膜肉眼所見と同週齢で4NQOを投与して

いない食道粘膜肉眼所見。赤い矢印は腫瘍を示す。（D）1 mm径以上の腫瘍の数。

N=11-12。（E）腫瘍の最大径。N=11-12。（F）浸潤がん部を含むHE染色像。（G）

浸潤がん部の数。N=11-12。（H）非腫瘍部におけるKeap1の免疫組織化学染色。

（I）腫瘍部におけるKeap1の免疫組織化学染色。（J）4NQOで誘導された腫瘍の Keap1発現。（K）食道上皮におけるKeap1の組換え効率。残存したKeap1^遺伝子

を評価している。N=4-6。グラフのデータは平均値±標準偏差を表示している。*, P<0.05, **, P<0.01。

図10

Tam x3 Analyses 4NQO 12W Water 12W

K5CreERT2 -Keap1^F/F

A

F

J

0 12 24

■Keap1^F/F

■K5CreERT2-Keap1^F/F

0 10 20

60 80 100 120 140

post 4NQO-administration week

rate of change

body weight

FB/FB FB/FB:Cre

Body weight (%)

Week after 4NQO administration

C

4NQO 12W Water 12W

**

Tumor number (>1 mm) G

FB/FB

FB/FB::Cre 0

1 2 3 4 5

tumor (>1mm)

tumor number

n.s.

0 1 2 3 5 4

Maximum tumor size (mm)

FB/FB

FB/FB::C re 0

2 4 6 8

maximum tumor size

mm

n.s.

H

0 2 4 6 8

Invasive cancer

Keap1FB/FB

1FB/FB::K5-C re 0

1 2 3

number

invasive cancer

n.s.

0 3

2

1

Keap1^FB/FB

HE

図10

B

Keratin5

4NQO-induced tumor (Wt)

I K5CreERT2-Keap1^FB/FB

Non-tumors

Invasive cancer Keap1^FB/FB

0.00 0.50 1.00 1.50

Keap1FB/FB

Keap1FB/FB::K5-Cre

Keap1 DNA 1W after Tam K5CreERT2-Keap1^FB/FB

1W after Tam

HE **

E D

Keap1^FB/FB K5CreERT2 -Keap1^FB/FB

図10 発がんpost-protocolにおけるKeap1の欠失はがん形成に影響を与えない

（A）4NQOとタモキシフェン（Tam）の投与を行うpost-protocolの実験スケジュ

ール。（B）4NQOにより誘導された食道腫瘍におけるKeratin5の免疫組織化学染

色。（C）体重変化。4NQO投与開始時を100%の体重として計算。N=11-17。（D） post-protocolにおけるTam投与後1週間の食道組織切片。（E）食道上皮における

Keap1の組み換え効率。残存したKeap1遺伝子を評価している。N=4-6。（F）

4NQO post-protocol完遂時の食道粘膜肉眼所見。赤い矢印は腫瘍を示す。（G）1

mm径以上の腫瘍の数。N=11-17。（H）腫瘍の最大径。N=11-17。（I）非腫瘍部と

浸潤がん部を含むHE染色像。（J）浸潤がん部の数。N=11-17。グラフのデータは

平均値±標準偏差を表示している。*, P<0.05, **, P<0.01。

図11

0 0.5 1 1.5

1 2

**

Remaining Nrf2DNA (fold)

E

12 W 1 W

A 図11

D

C

Relative mRNA level

■Nrf2^F/F

■K5CreERT2-Nrf2^F/F

F

Cell layer (μm) Keratinous layer (μm)

B

Nrf2^F/F

Nrf2

K5CreERT2-Nrf2^F/F Nrf2DNA

HE

Tam x3 1 W 12 W

12 W 1 W

200 μm

g-H2A.X

0 0.5 1 1.5

1 2

**

Nrf2

**

0 0.5 1 1.5 2

1 2

* Nqo1

** *

0 20 40 60 80

1 2

0 10 20 30 40

1 2

0 2 4 6 8 10

1 2

g-H2AX⁺cells (%)

1 W 12 W 1 W 12 W 1 W 12 W

30 μm

50 μm

G H I

n.s. n.s.

n.s. n.s. n.s.

n.s.

1 W 12 W 1 W 12 W 1 W 12 W

図11 食道上皮における誘導的なNrf2の欠失は特異的な表現型を示さない

（A）実験スケジュール（B）食道上皮におけるNrf2の組換え効率。残存したNrf2

遺伝子を評価している。N=4-6。（C）Nrf2^とNqo1^のmRNA発現レベル。 N=4-6。rRNAの発現レベルを内部標準とする。Nrf2^F/Fマウスの発現レベルを1とす

る。（D）HE染色。食道の横断面を示す。（E）Nrf2の免疫組織化学染色。（F）γ H2A.Xの免疫組織化学染色。（G）11Dにおける角層の厚さ。1組織あたり3箇所の

厚さを測定し、平均値を評価。N=5。(H) 11Dにおける細胞層の厚さ。N=5。（I） 11Fにおける基底細胞に対するgH2A.X陽性細胞の割合。N=4-5。グラフのデータは

平均値±標準偏差を表示している。*, P<0.05, **, P<0.01。

図12

0 10 20

60 80 100 120 140

post 4NQO-administration week

rate of change

body weight

Nrf2F/F Nrf2F/F:Cre

4NQO 12W Water 12W

図１2

Tumor number (>1 mm)

Maximum tumor size (mm) Body weight (%)

Week after 4NQO administration

A

C

B D

E

Invasive cancer

F

K5CreERT2-Nrrf2^F/F

Tam x3 Analyses

4NQO 12W Water 12W

-1

0 12 24

■Nrf2^F/F

■K5CreERT2-Nrf2^F/F

Nrf2F/F

Nrf2F/F:Cre 0

2 4 6 8

tumor (>1mm)

tumor number

n.s.

6 4 2 0 8

Nrf2F/F

Nrf2F/F:C re 0

1 2 3 4 5

maximum tumor size

mm

n.s.

0 4 3 2 1 5

Nrf2F/F

Nrf2F/F:Cre 0

1 2 3

number

invasive cancer 3 n.s.

2 1

K5CreERT2::Nrf2^F/F 0

Nrf2^F/F

HE

50 µm

Nrf2^F/F K5CreERT2-Nrf2^F/F Nrf2^F/F

G

図12 発がんpre-protocolにおけるNrf2の欠失はがん形成に影響を与えない

（A）タモキシフェン（Tam）と4NQOの投与を行うpre-protocolの実験スケジュ

ール（B）体重変化。4NQO投与開始時を100%の体重として計算。N=11-15。

（C）4NQO pre-protocol完遂24週の食道粘膜肉眼所見。赤い矢印は腫瘍を示す。

（D）1 mm径以上の腫瘍の数。N=11-15。（E）腫瘍の最大径。N=11-15。（F）浸

潤がん部を含むHE染色像。（G）浸潤がん部の数。N=8-12。グラフのデータは平均

値±標準偏差を表示している。*, P<0.05, **, P<0.01。

図^図１13 ³

F

K5CreERT2-Nrrf2^F/F Nrf2^F/F

E G

Tam x3 Analyses 4NQO 12W

-1

0 12

0 0.5 1 1.5

Nrf2F/F Nrf2F/F::K5-Cre

Nrf2F^{0 W}/F::K5-Cr_4NQO^{12 W}e

n.s.

**

Nrf2^F/F K5CreERT2-Nrf2^F/F

Remaining Nrf2DNA (fold)

Nrf2DNA Tumors

Nrf2

Non-tumors

K5CreERT2-Nrf2^F/Fwith 4NQO Nrf2^F/Fwith 4NQO

Non-tumors Tumors

100 μm

100 μm 200 μm 200 μm

50 μm

B A

Tam x3 Analyses

4NQO 12W Water 12W

-1

0 12 24

Tumors Nqo1

Positive Negative Nrf2^F/F

(n=15) 15

(100 %) 0

(0 %) K5CreERT2-Nrf2^F/F

(n=24) 21

(88 %) 3

(12 %)

Nqo1

Nrf2^F/Fwith 4NQO K5CreERT2-Nrf2^F/Fwith 4NQO

C D

200 μm

図13 Nrf2欠失細胞は4NQO投与環境下で消失する

（A）タモキシフェン（Tam）と4NQOの投与を行うpre-protocolの実験スケジュ

ール（B）非腫瘍部と腫瘍部におけるNrf2の免疫組織化学染色。黒枠で囲まれた領

域は下パネルへの拡大部分を示す。（C）Nqo1の免疫組織化学染色。（D）4NQOで

誘導された腫瘍のNqo1発現。（E）4NQO投与終了直後に解析する実験スケジュー

ル（F）4NQO12週投与終了直後の食道粘膜肉眼所見。（G）食道上皮におけるNrf2

の組み換え効率。残存したNrf2遺伝子を評価している。N=4-6。グラフのデータは

平均値±標準偏差を表示している。*, P<0.05, **, P<0.01。

図14

Nrf2F/F

Nrf2F/F:C re 0

2 4 6 8

tumor (>1mm)

tumor number

Nrf2^F/F

0 10 20

60 80 100 120 140

post 4NQO-administration week

rate of change

body weight

Nrf2F/F Nrf2F/F:Cre

Tam x3 Analyses 4NQO 12W Water 12W

A Tumor number (>1 mm)

Maximum tumor size (mm) Body weight (%)

Week after 4NQO administration

A

C B

D

F

4NQO 12W Water 12W

図１4

K5CreERT2-Nrf2^F/F

Control K5CreERT2 -Nrrf2^F/F

0 12 24

■Nrf2^F/F

■K5CreERT2-Nrf2^F/F

Invasive cancer

G

100 μm

n.s.

0 2 4 6 8

Nrf2F/F

Nrf2F/F:Cre 0

1 2 3 4

maximum tumor size

mm

n.s.

3 2 1 0 4

Nrf2F/F

Nrf2F/F:Cre 0

1 2 3 4

number

invasive cancer n.s.

0 4 3 2 1

E

図14 発がんpost-protocolにおけるNrf2欠失はがん形成に影響を与えない

（A）4NQOとタモキシフェン（Tam）の投与を行うpost-protocolの実験スケジュ

ール（B）体重変化。4NQO投与開始時を100%の体重として計算。N=13-14。

（C）4NQO post-protocol完遂24週の食道粘膜肉眼所見。赤い矢印は腫瘍を示す。

（D）1 mm径以上の腫瘍の数。N=13-14。（E）腫瘍の最大径。N=13-14。（F）非

腫瘍部と浸潤がん部を含むHE染色像。（G）浸潤がん部の数。N=13-14。グラフの

データは平均値±標準偏差を表示している。*, P<0.05, **, P<0.01。

ドキュメント内 Nrf2の活性状態は食道異形成を引き起こし食道の発がんにおける細胞選択性を誘導する (ページ 53-78)