各種細胞の培養

10.1 KB, Colon-26, Colon-26-luc 細胞の培養: ヒト口腔がん細胞由来の株化細胞であ る KB 細胞, マウス結腸がん細胞由来の株化細胞である Colon-26 細胞およびその ルシフェラーゼ安定発現細胞株である Colon-26-luc 細胞 (8 × 10⁵ 個) を 10% (v/v)

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FBS 含有 RPMI 1640 (Folic acid-free) 培地 (L-グルタミン 300 mg/L、NaHCO3 2,000 mg/L、ペニシリン 1 × 10⁵ U/L、ストレプトマイシン 0.1 g/L) 10 mL に懸濁し、プラ スティックディッシュ (100 mm) に播種して、37ºC、5% CO₂ 濃度下で培養した。セ ミコンフルエントに達した細胞をディッシュから剥離し、3,000 rpm (885 × g) で 3 分 間遠心分離後、上清を取り除き、得られたペレットを 10% (v/v) FBS 含有 RPMI 1640 (Folic acid-free) 培地に 1 × 10⁵ 個/mL の密度で分散した。この細胞懸濁液を 24

well-plate に 5 × 10⁴ 個/well になるように播種し、24 時間培養した細胞をトランスフェ

クション実験および細胞障害性の実験に用いた。

10.2 A549 細胞の培養: ヒト肺上皮癌由来の株化細胞である A549 細胞 8 × 10⁵ 個を 10% (v/v) FBS 含有 DMEM 培地 (L-グルタミン 300 mg/L、NaHCO3 2,000 mg/L、ペニ シリン 1 × 10⁵ U/L、ストレプトマイシン 0.1 g/L) 10 mL に懸濁し、プラスティックデ

ィッシュ (100 mm) に播種して、37ºC、5% CO2 濃度下で培養した。セミコンフルエ

ントに達した細胞をトリプシン-EDTA 法によりディッシュから剥離し、3,000 rpm

(885 × g) で 3 分間遠心分離後、上清を取り除き、得られたペレットを 10% (v/v) FBS

含有 DMEM培地に 1 × 10⁵ 個/mL の密度で分散した。この細胞懸濁液を 24 well plate

に 5 × 10⁴ 個/well になるように播種し、24 時間培養した細胞をトランスフェクショ

ン実験および細胞障害性の実験に用いた。

11. 培養細胞への細胞障害性およびトランスフェクション 11.1 複合体の調製

11.1.1 キャリア/siRNA 複合体の調製: 1.5 mL エッペンドルフチューブに各種培地を

加え、RNase-free water に溶解した siRNA 1.5 L (20 M) を添加した後、HBSS に溶 解した各種濃度のキャリアを添加し、10 秒間ボルテックス後、15 分間室温でインキ ュベートし、複合体とした。

11.1.2 三元複合体 (Carrier/siRNA/Sacran) の調製: 1.5 mL エッペンドルフチューブ に各種培地を加え、RNase-free water に溶解した siRNA 1.5 L (20 M) を添加した後、

HBSS に溶解した各種濃度のキャリアを添加し、10 秒間ボルテックス後、15 分間室

温でインキュベートした。その後、低分子サクラン溶液 (0.1 mg/mL) を加え、10 秒

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間ボルテックス処理後、15 分間室温でインキュベートすることにより三元複合体を 調製した。

11.2 細胞障害性および殺細胞効果の検討: WST-1 法により評価した。各種細胞を 24

well plate に 5 × 10⁴ 個/well になるように播種し、10% (v/v) FBS 含有培地で 24 時 間培養した。細胞を無血清培地 300 L で 2 回洗浄した後、キャリア/siRNA 複合体 含有無血清培地を 270 L 添加し、37ºC、5% CO2 濃度下で 1 時間インキュベートし た。その後、FBS 30 L を添加し (最終濃度; 10% (v/v))、さらに 23 または 47 時間 培養した。HBSS 300 L で 2 回洗浄した後、HBSS 270 L および WST-1 試薬 30 L の混和液を添加し、37ºC、5% CO₂ 濃度下で 30 分間インキュベートした後、吸光度 を測定した (測定波長: 450 nm、参照波長: 620 nm)。なお、細胞生存率はキャリア非添 加時を 100% として算出した。

11.3 トランスフェクション: 細胞を 24 well plate に 5 × 10⁴ 個/well になるように播 種し、10% (v/v) FBS 含有培地で 24 時間培養した。細胞を無血清培地 300 L で 2 回洗浄後、キャリア/siRNA 複合体を含む無血清培地 270 L を添加し、37ºC、5% CO2

濃度下で 1 時間インキュベートした。その後、FBS 30 L を添加し (最終濃度; 10%

(v/v))、さらに 23 時間培養した。

11.4 キャリア/siRNA 複合体のポストトランスフェクション: 細胞を 24 well plate に 5 × 10⁴ 個/well になるように播種し、10% (v/v) FBS 含有培地で 24 時間培養した。

無血清培地 200 L を添加後、dendrimer (G3)/pGL3 複合体溶液 (pGL3 2 g, チャージ 比 (dendrimer (G3)/pGL3) 50) 200 L を添加し、37ºC、5% CO₂ 濃度下で 1 時間イン キュベートした。細胞を無血清培地 400 L で 1 回洗浄した後、無血清培地 200 L を添加し、37ºC、5% CO2 濃度下で 1 時間インキュベートした。キャリア/siRNA 複 合体含有 RPMI 1640 (Folic acid-free) 培地 70 L を添加し、37ºC、5% CO₂ 濃度下で 1 時間インキュベートした。その後、FBS 30 L を添加し (最終濃度; 10% (v/v))、さ らに 23 時間培養した。

11.5 細胞抽出液の調製: トランスフェクション終了後の各種細胞を PBS (-) 300 L

で 2 回洗浄後、PBS (-) で 5 倍希釈した細胞溶解剤 200 L を添加し、15 分間室温

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でインキュベートし、さらに凍結 (-80˚C) および融解 (37˚C) を 3 回繰り返した。得 られた細胞溶解液を10,000 rpm で 5 分間遠心分離し、その上清を細胞抽出液とした。

11.6 ルシフェラーゼ活性の測定: 細胞抽出液 20 L をルミノメーター用試験管

(Röhren Tubes、SARSTEDT) に採取し、これに Luciferase Assay Substrate 100 L を添 加後、ルミノメーター (EG&G BERHTOLD 製 Lumat LB 9507) で 10 秒間の発光量 を測定した。

11.7 細胞抽出液中のタンパク質の定量: 細胞抽出液 20 L に BCA Protein Assay kit 溶液を 200 L 添加し、37˚C、30 分間インキュベートした。その後、マイクロプレー トリーダーにて 570 nm における吸光度を測定した。細胞溶解剤で BSA を希釈した ものを標準液に用いて検量線を作成し、上記ルシフェラーゼ活性およびタンパク質濃 度より relative light unit (RLU) を算出した。

11.8 細胞内 mRNA の検出 (Total RNA の抽出): フェノールクロロホルム抽出法に

より total mRNA の抽出を行った。トランスフェクション終了後の各種細胞に

TRIzol^® Reagent 400 L を添加し、ピペッティングにより細胞を溶解させた。その後、

5 分間インキュベートを行い、80 L のクロロホルムを添加し、15 秒間ボルテックス 後、室温で 2~3 分間インキュベーションした。遠心 (4ºC、12,000 × g、15 min) 後、

水層 (上層) を別のエッペンチューブに移し、200 L の isopropanol を添加後、室温 で 10 分間インキュベートした。さらに遠心 (4ºC、12,000 × g、10 min) 後、上清を除 き、500 L の 75% EtOH を添加後、ボルテックス処理し、遠心 (4ºC、7,500 × g、5

min) を行った。上清を除去後、風乾し、ペレットを RNase Free Water で溶解させた。

抽出した Total mRNA の濃度は、分光光度計 (GEヘルスケア・ジャパン製、NanoVue

With Printer G) を用いて、260 nm の吸光度を測定し求めた。なお、調製した RNA は

OD260/280 1.8 以上のものを用いた。

11.9 Reverse transcription (RT) 反応: total RNA (0.5 g) に対して、ReverTra Ace^® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover を用いて cDNA を得た。

11.10 Real Time Polymerase chain reaction (Q-PCR) 反応: THUNDERBIRD^® qPCR Mix

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5 L、PCR Forward Primer 0.3 L (10 M)、PCR Reversed Primer 0.3 L (10 M)、template (cDNA) 1 L (<100 ng) および dH₂O 3.4 L を混合後、Applied Biosystems 7500 を用 い、95ºC (30 s、20 ºC/s、1 サイクル) の条件下、初期変性後、さらに 95ºC (5 s、20 ºC/s)、

55ºC (30 s、20ºC/s)、72ºC (30 s、20ºC/s) の条件下 40 サイクルの PCR 反応を行い、

cDNA を増幅させた。その後、95ºC (0 s、20ºC/s)、65ºC (15 s、20ºC/s)、95ºC (0 s、20ºC/s) の条件下、融解曲線分析を行い、増幅産物の確認を行った。