謝 辞
12. タンパク質レベルの検出 (Western blot)
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5 L、PCR Forward Primer 0.3 L (10 M)、PCR Reversed Primer 0.3 L (10 M)、template (cDNA) 1 L (<100 ng) および dH2O 3.4 L を混合後、Applied Biosystems 7500 を用 い、95ºC (30 s、20 ºC/s、1 サイクル) の条件下、初期変性後、さらに 95ºC (5 s、20 ºC/s)、
55ºC (30 s、20ºC/s)、72ºC (30 s、20ºC/s) の条件下 40 サイクルの PCR 反応を行い、
cDNA を増幅させた。その後、95ºC (0 s、20ºC/s)、65ºC (15 s、20ºC/s)、95ºC (0 s、20ºC/s) の条件下、融解曲線分析を行い、増幅産物の確認を行った。
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インキュベートした。その後、細胞を PBS (-) 400 L で 2 回洗浄後、250 L の PBS (-) で懸濁し、Millipore 製 Guava easyCyteTM により蛍光強度を測定した。
14. キャリア/siRNA 複合体の細胞内分布
KB 細胞を 35 mm glass bottom dish に 1 × 105 個/well になるように播種し、10%
(v/v) FBS 含有 RPMI 1640 (Folic acid-free) 培地で 24 時間培養した。細胞を無血清培 地 1 mL で 2 回洗浄後、TRITC ラベル化キャリア/FITC-siRNA 複合体を含む無血清 培地 200 L を添加し、37ºC、5% CO2 濃度下で 24 時間インキュベートした。その 後、細胞を無血清 RPMI 1640 (Folic acid-free) 培地で 2 回洗浄し、10% (v/v) FBS 含 有 RPMI 1640 (Folic acid-free) 培地を添加後、共焦点レーザー走査型顕微鏡 (オリン パ ス 製 FLUOVIEW FV500BX, ア ル ゴ ン イ オ ン レ ー ザ ー) に よ り FITC お よ び
TRITC の蛍光を観察した。
15. キャリア/siRNA 複合体の細胞外排出
KB 細胞を 24 well plate に 1 × 105 個/well になるように播種し、10% (v/v) FBS 含 有培地で 24 時間培養した。細胞を無血清培地 400 L で 2 回洗浄後、TRITC-キャ リア/FITC-siRNA 複合体を含む RPMI 1640 (Folic acid-free) 300 L を添加し、37ºC、
5% CO2 濃度下で 6 時間インキュベートした。その後、細胞を RPMI 1640 (Folic acid-free) 培地 300 L で 2 回洗浄し、300 L の RPMI 1640 (Folic acid-free) 培地 300 L を添加した。その後、経時的 (1, 3, 6, 12, 24, 48, 96 時間) に培養上清を採取し、3,000 rpm (885 × g) で 3 分間遠心分離後、上清200 L を回収し、上清中の TRITC および
FITC の蛍光を蛍光プレートリーダー (TECAN 社製 Infinite M1000) にて測定し、細
胞外へ排出された キャリアおよび siRNA 量を算出した。
16. In vivo 実験
16.1 担がんマウスの作製: BALB/c 雄性マウスの後肢に、2 日前から RPMI 1640 (Folic acid-free) で 培 養 し た Colon-26-luc ま た は Colon-26 細 胞 懸 濁 液 (5 × 105
cells/100 L) を後肢に接種した。約 10 日後、マウスの腫瘍長径が 10 mm に到達し
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たマウスを in vivo 実験に用いた。なお、抗腫瘍効果の実験にはマウスの腫瘍長径が
8 mm に到達したマウスを用いた。
16.2 in vivo RNAi 効果: キャリア/siRNA 複合体 (siRNA 10 g) を含む 5% マンニト
ール溶液100 L をマウス腫瘍内に直接投与またはキャリア/siRNA 複合体 (siRNA 50
g) を含む 5% マンニトール溶液 500 L をマウス尾静脈内に投与した。24 時間後、
腫瘍を回収し、5 倍希釈した lysis buffer 2 mL に溶解させ、24,000 rpm (ULTRA-TURRAX® T-25) でホモジナイズした。その後、凍結 (-80˚C) および融解 (37˚C) を 3 回繰り返し、遠心分離 (4˚C, 10,000 rpm, 5 min) 後、上清を細胞抽出液とし、前述の条 件でルシフェラーゼ活性およびタンパク質濃度を測定し、RLU を算出した。
16.3 TRITC-キャリアおよび FITC-siRNA の血中濃度: TRITC-キャリア/FITC-siRNA 複合体 (siRNA 10 g) を含む 5% マンニトール溶液 500 L をマウス尾静脈内に投 与した。5 分、10 分、30 分、1 時間、3 時間、5 時間後、エーテル麻酔下、腹部下 大静脈より採血し、3,000 rpm で 10 分間遠心分離を行った。上清 100 L を分取し、
蛍光プレートリーダーにて TRITC および FITC の蛍光強度を測定した。また、血清
中に TRITC-キャリアおよび FITC-siRNA を溶解して段階希釈することにより検量
線を作成し、蛍光強度から血中濃度を算出した。
16.4 腫瘍および各臓器中 TRITC-キャリアおよび FITC-siRNA の定量: TRITC-キャ リア/FITC-siRNA 複合体 (siRNA 10 g) を含む 5% マンニトール溶液 500 L をマ ウス尾静脈内に投与した。5 分、10 分、30 分、1 時間、3 時間、5 時間後、灌流を 行い、腫瘍および各臓器 (心臓、肺、脾臓、肝臓、腎臓) を摘出した。摘出した腫瘍 および臓器は、細胞溶解液 (20 mM Tris HCl, 0.05% Triton X-100, 2 mM EDTA, pH7.5) に溶解させ、24,000 rpm (ULTRA-TURRAX® T-25) でホモジナイズした。その後、5,000 rpm で 10 分間遠心分離を行い、上清 200 L を分取し、さらに 5,000 rpm で 10 分 間遠心分離を行った後、上清 100 L を分取し、蛍光プレートリーダーにて TRITC および FITC の蛍光強度を測定した。また、腫瘍および各臓器のライセート中に
TRITC-キャリアおよび FITC-siRNA を溶解して段階希釈することにより検量線を作
成し、蛍光強度から腫瘍および各臓器中の存在量を算出した。
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16.5 In vivo イメージング: キャリア/FITC-siRNA 複合体 (siRNA 10 g) を含む 5%
マンニトール溶液 500 L を 30 秒間かけて担がんマウス尾静脈内に投与した。5 分、
10 分、30 分、1 時間、3 時間、5 時間後、下大静脈から血管内を灌流し、各臓器お よび腫瘍を回収した後、MaestroTM imaging system を用いて TRITC および FITC の蛍 光を経時的に観察した。
16.6 抗腫瘍効果
16.6.1 Fol-PC (G4, DSF2)/siPLK1 複合体の抗腫瘍効果: Fol-PC (G4, DSF2)/siPLK1 複合体 (siPLK1 50 g) を含む 5% マンニトール溶液 500 L を週 2 回マウス尾静 脈内より投与した。投与後 1 ヶ月間、腫瘍体積、体重を経時的に測定した。なお、腫 瘍体積は、Corbett らの方法133) に従い、腫瘍の長径および短径を測定し、Fig. 84 に 示す計算式を用いて算出した。
16.6.2 腫瘍中 PLK1 mRNA 発現抑制効果: 実験終了時に腫瘍を回収し、液体窒素に
て急速凍結させた。凍結させた腫瘍に TRIzol® Reagent 1 mL を加え、24,000 rpm (ULTRA-TURRAX® T-25) でホモジナイズした。遠心 (4ºC、12,000 rpm、5 min) 後、腫 瘍細胞が溶解した TRIzol® Reagent 500 μL を別のエッペンチューブに移した。その後 は、上記の total mRNA の抽出法と同様の操作を行い、Q-PCR により解析を行った。
16.7 血液生化学的パラメータの測定: 担がんマウスをエーテル麻酔下、各種キャリア
/siRNA 複合体 (siRNA 50 g) を含む 5% マンニトール溶液 500 L を尾静脈より投 与した。24 時間後エーテル麻酔下、腹部大動脈より採血し、血清 200 L を分取し定 量時まで凍結保存した。各種血液生化学検査値は生化学自動分析装置により定量した。
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17. 統計処理: データは平均値±標準誤差で示した。本研究での統計学的な有意差は、
2 群間の比較においては、Student の t-検定、他群間の比較においては、ANOVA を 用いて、Scheffe 検定を行った。すべての実験において危険率 5% 未満で統計学的な 有意な差があると判定した。なお、全ての統計解析は、「Statview」ソフトウェアを用 いた。
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