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電 極 間
図3.8:顕 微 鏡 画 像
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(a)酵 母 の誘 電 泳 動 軌 跡
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(b)位 置 特 性 図3.9:解 析 時 の 画 像 例
3.3.2蛍 光 染 色 に よ る 膜 生 理 状 態 計 測
菌 体 の 生 化 学 的 評 価 法 と して,LIVE/DEAD⑭ 染 色 キ ッ ト(L13152,Invitrogen)を 用 い て 菌 染 色 を 行 っ た.本 キ ッ トは,propidiumiodide(PI,C27H3412N4)及 びSYTO⑬9(以 下,Syto9)の 核 酸 染 色 剤 か ら な る.PIは 膜 透 過 性 が な く,赤 色 蛍 光 を 示 す.一 方,Syto9 は 膜 透 過 性 が あ り,緑 色 蛍 光 を 呈 す る.一 般 に は,こ れ ら の 染 色 剤 を 同 時 に 使 用 す る こ と で 生 死 菌 判 別 を 行 う[10].本 キ ッ トに よ る 生 死 菌 判 別 の 原 理 を 図3.10に 示 す.菌 に 膜 損 傷 が な い 場 合,膜 透 過 性 の あ るSyto9の み が 菌 体 内 部 に 取 り込 ま れ,核 酸 が 緑 染 色 さ れ る.
膜 損 傷 が あ る 場 合,膜 透 過 性 の な いPIも 菌 体 内 部 に 同 時 に 取 り込 ま れ,核 酸 が 榿 色 ま た は 赤 色 の 蛍 光 を 発 す る.本 実 験 で は,2つ の 試 薬 の 蛍 光 ス ペ ク トル 強 度 を個 別 に 測 定 し,そ の 膜 透 過 特 性 の 違 い か ら菌 体 の 膜 生 理 状 態 を 推 定 し た.
具 体 的 な 手 順 と し て は,分 注 し た 懸 濁 液1mLに 加 熱 処 理 を5min施 した 後,染 色 剤 を 20μL加 え,遮 光 し た28。Cの 暗 室 で5min放 置 した.そ の 後,マ イ ク ロ プ レ ー ト リー ダ ー (MicroplateReader:MPR,SH‑9000,日 立 ハ イ テ ク サ イ エ ン ス)を 用 い て,各 波 長 の 蛍 光 ス ペ ク トル 強 度 を 測 定 し た.測 定 結 果 の 一 例 を 図3.11に 示 す.PI及 びSyto9の 蛍 光 色 に 対 応 し た 特 定 波 長(PI:620‑650nm,Syto9:510‑540nm)に お け る 蛍 光 ス ペ ク トル 強 度 の 積 算 値(以 下,PI強 度 及 びSyto9強 度 と 表 記)を,そ れ ぞ れ の 試 薬 に よ る 最 終 的 な 蛍 光 強 度 と した.
緑 色 蛍 光
膜損傷なし
濫 庫優
、
謙 韮う謬
④
Pl
●
PI
17匹
赤 色 蛍 光
図3.10:染 色 過 程 模 式 図
0 2 1 0 0 1 80 60 40 20 0
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未 処 理 37。C 370C‑2h 47。COmin
5min 47。ClOmin
60。C
恕
550600650
Wavelength[nm]
(a)蛍 光 ス ペ ク ト ル 強 度:PI
700
O肩のの肩d日①ΦOd︻①OのΦ勘Oづ︻
0 5 3 0 0 3 0 5 2 0 0 2 0 5 1 0 0 1 0 5 0
未 処 理 37。C 37。C‑2h 470COmin 470C5min 47。ClOmin 60。C
‑一一一一一800C
550600650
Wavelength[nm]
(b)蛍 光 ス ペ ク トル 強 度:Syto9 図3.11:蛍 光 ス ペ ク ト ル 強 度 の 画 像 例
700
3.3.3コ ロ ニ ー カ ウ ン ト計 測 法 に よ る 生 育 活 性 計 測 一 般 的 に
,培 地 上 の 微 生 物1単 体 は,35。C程 度 の 生 育 が 可 能 な 温 度 環 境 下 に お い て 一 日 程 度 培 養 す る と,108個 ま で 増 殖 さ れ る.本 増 菌 に よ っ て,寒 天 培 地 で は 集 落(コ ロ ニ ー) が 形 成 さ れ,肉 眼 で の 判 定 が 可 能 と な る[11].寒 天 培 地 を 用 い て 形 成 コ ロ ニ ー 数 を 計 測 す る 手 法 を,コ ロ ニ ー カ ウ ン ト計 測 法 とい う.単 位 と し て は,あ る 一 定 の 培 養 条 件 に お い て1 つ の コ ロ ニ ー を形 成 す る 最 小 菌 単 位(ColonyFormingUnit:CFU)を 用 い る.す な わ ち, 1CFUは 少 な く と も1つ の 生 菌 か ら形 成 さ れ た こ と を 意 味 す る.以 上 よ り,コ ロ ニ ー カ ウ ン ト計 測 法 で は,分 裂 増 殖 し コ ロ ニ ー を 形 成 し た 細 胞 は,生 細 胞 で あ る と判 断 す る こ と が で き る.し か し な が ら,培 地 の 種 類 や 菌 体 の 状 態 に よ っ て は 生 細 胞 で あ っ て も 増 殖 及 び コ ロ ニ ー 形 成 が 困 難 な 場 合 が あ る.故 に,本 結 果 か ら生 菌 の 存 在 を 完 全 に 否 定 す る こ と は で き ず,い わ ゆ る 偽 陰 性 と な る[12].こ の よ う に 、 細 胞 が 生 き て は い る が 培 養 す る こ と は で き な い 状 態 をVNC(viablebutnon‑culturable)と 呼 ぶ.つ ま り コ ロ ニ ー カ ウ ン ト計 測 法 は,検 体 中 に 存 在 す る 菌 体 の 生 育 活 性 の 有 無 を評 価 す る た め の 手 法 に 過 ぎ ず,コ ロ ニ ー 形 成 の 元 と な る 菌 体 の 厳 密 な 生 死 判 別 や 代 謝 状 態 の 詳 細 な 検 証 を 行 う こ と は 困 難 で あ る[13].
た だ し,生 育 活 性 を 有 す る 菌 体 に お い て は,一 定 時 間 培 養 後 に 形 成 さ れ る コ ロ ニ ー 数 の 差 異 か ら,菌 体 の 生 育 活 性 の 大 小 を 簡 易 的 に 推 定 す る こ とが 可 能 で あ る と 考 え られ る.
本 実 験 で は,加 熱 処 理 に よ る 酵 母 の 生 育 活 性 変 化 量 を調 査 す る た め,直 接 塗 布 法 に よ っ て 平 板 培 地 表 面 上 に コ ロ ニ ー を 形 成 し,そ の 数 か ら菌 体 の 生 育 活 性 を計 測 し た.具 体 的 な 手 順 と して は,加 熱 処 理 済 み の 懸 濁 液 を 計 測 に 適 し た 濃 度(2.0×103CFU/mL)に 希 釈 し, PDA培 地 上 に10μLず つ 塗 布 した 後,280Cで72h増 菌 培 養 し た.そ の 後,培 地 表 面 に 生 じ た コ ロ ニ ー 数 を計 測 し た.計 測 し た コ ロ ニ ー 数 に 希 釈 倍 率 を 掛 け た 値 を,元 の 懸 濁 液 に お け る 生 育 活 性 を 有 す る 菌(生 菌)数 と し て 導 出 し た.各 処 理 条 件 に 対 し て3サ ン プ ル の 平 均 値 を 取 り,独 立 し た 測 定 を3回 行 っ て 再 現 性 を 確 認 し た.
PDA培 地 に よ る 酵 母 の 生 育 例 を 図3.12に 示 す.加 熱 処 理 条 件 に よ っ て,形 成 コ ロ ニ ー の 大 き さ や 数 が 変 化 す る こ と が わ か る.
2忽'
暫
織 嚢 灘i瀞一磯舞
図3.12:PDA培 地 に よ る 酵 母(JCM7255)の 生 育 例
参考文献
[1]五 十 君 静 信 ・江 崎 孝 行 ・高 鳥 浩 介 ・土 戸 哲 明:「 微 生 物 の 簡 易 迅 速 検 査 法 」,テ ク ノ シ
ス テ ム(2013)
[2]P.V.Att丘eld,:"Stresstolerance:thekey七 〇effectivestrainsofindustrialbaker,s yeast",Nat.Biotechno1,Vol.15,No.13,pp.1351‑1357(1997).
[3]Randez‑Gil,F.,Sallz,P.andPrieto,J.A.:"Engineeringbaker,syeast:roomfor improvement",TrendsBiotechnol,Vol.17,No.6,pp.237‑244(1999)
囚 島 純:「 環 境 ス ト レ ス 耐 性=酵 母 の 発 酵 生 産 に お け る 重 要 特 性 」,日 本 食 品 微 生 物 学
会 雑 誌,Vol.22,No.3,pp.81‑88(2004)
[5】 今 中 忠 行:「 微 生 物 利 用 の 大 展 開 」,エ ヌ ・ テ ィ ー ・ エ ス(2002)
[6】 東 京 医 科 歯 科 大 学WEBサ イ ト:http://www.tmd.ac.jp/artsci/bio1/textbook/cellm‑
emb.htm(2016/1/13ア ク セ ス)
国 大 隈 良 典 ・下 田 親:「 酵 母 の す べ て 系 統,細 胞 か ら 分 子 ま で 」,シ ュ プ リ ン ガ ー ・ジ ャ
パ ン(2007)
[8]N.Kedersha,S.Chen,N.Gilks,1.J.Miller,J.StahlandP.Anderson:,,Evidence
thatternarycomplex(eIF2‑GTP一 七RNAiMe七)‑deficientpreinitiationcomplexesare coreconstituentsofmammalianstressgranules,,,Mol.Bio1.Ce11,VbL13,pp.195‑
210(2002)
[9]N.Kedersha,G.Stoecklin,M.Ayodele,P.Yacono,J.L.Andersen,M.J.Fritzler, D.Scheuner,R.J.Kaufman,D.E.GolanandPAnderson:"Stressgranulesand processingbodiesaredynamicallylinkedsitesofmRNPremodeling",J.CellBioL, Vo1.169,pp.871‑884(2005)
[10]同 仁 化 学 研 究 所 一DOJINDO‑:http://www.dojindo.co.jp(2016/1/25ア ク セ ス)
[11]土 戸 哲 明 ・松 村 吉 信:「 殺 菌 ・静 菌 に お け る"ス ト レ ス バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー"と そ の 概 念 」,生 物 工 学 会 誌,Vbl.77,No.6,pp.225‑228(1999)
[12]斉 藤 正 行 ・丹 波 正 治:「 改 訂 基 礎 生 化 学 」,講 談 社(1990)
[13]円 城 寺 隆 治:「 平 成23年 度 首 都 大 学 東 京 電 気 電 子 工 学 専 攻 学 位 論 文 」,(2012)