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^{1.1  0.8  5.3  2.2} 

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6‑Hydroxy‑naphthalene‑2‑carboxylic acid 

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4‑Amino cinnamic acid 

叩 一 、 r ‑ ¥

"‑‑COOH  4‑Nitro cinnamic acid 

HO一¥ / ¥ ‑ C O O H Tyrosine  NH~

。

、

^‑COOH

21.9  10.2  19.7  2.8 

2.7  0.3  N.T  N.T 

0.5  N.D  N.T  N.T. 

0.5  N.T.  N.T.  N.T 

N.D.  N.D.  N.T.  N.T 

N.D.  N.D.  N.D.  N.T. 

N.D.  N.D.  N.D.  N.T 

ように F位 に ヒ ド ロキシル基をもっ化 合物の変換率が高か っ た 。 し か し 、

Numerical values in  the table was conversion rate (%). 

  ， +

detected  one new peak other than substrate; N.D.， detected no peaks other than  substrate; N.T.，  Not tested. 

Ferulic acid (変換率0.5)や σCoumaricacid (変換率0)ではほとんど反応が 進行しなかったことから、 Phenyl基の σ位と m‑位が結合する酵素の基質結合

97 

部位の空聞が狭く、 mイ立が結合する空間はヒドロキシル基は入れるがメトキシ ル基の大きさになると立体的に入りこめない程度の空間しかなく、 σ位当たりの 空間はヒドロキシル基も入ることができない大きさであると推測した。

また、 F位に結合した置換基の種類を検討した結果、ヒドロキシル基以外にア ミノ基が結合した 4‑Amino cinnamic acidでも縮合反応が進行し、変換率は低 いが新たな生成物を確認することができた(Table15)。しかし、4‑Nitrocinnamic acidでは新たな生成物を検出することができなかったことから、アミノ基とニ

トロ基の求核反応力の差が反映した結果と考えられる。

一方、Cinnamicacidより 3・Phenylpropionic acidが(Table14)、またCaffeic acidより 3‑(3

，

4‑dihydroxyphenyI)propionic acidが圧倒的に高い変換率を示し た (Table15)。この結果は、 3・Phenylpropionic acid骨格をもっ基質が酵素の 活性中心に到達するためには、 Phenyl基に対して炭素鎖が自由に回転できる構 造(三重結合より一重結合)をもった化合物が活性中心に到達しやすいためと 考えられる。また、6‑Hydroxynaphthalene‑2‑carboxylic acidのように 3・Phenyl propionic acid骨格をもたないべンゼ、ン環が2つ結合した化合物でも反応が進行

したのに対して、 2種類のアミノ酸では酵素反応が進行しなかったことから、酵 素の活性中心はフェニル基の幅ほどの狭くて平面的な構造を持ち、フェニル基 とプロパノイド基の炭素鎖と接する酵素側の部分には疎水性アミノ酸残基が配 置され、疎水結合で酵素と基質を固定していると推測している。これらの結果 から、 p位にヒドロキシル基が結合した3・Phenylpropionic acid骨格をもっ化 合物が CQAesteraseの基質結合部位に入り、酵素のアミノ酸残基と p位のヒド ロキシル基が水素結合を形成するとともに、フェニル基とプロパノイド基の炭 素鎖が疎水結合で酵素タンパクに固定化されて、安定した酵素基質複合体を形 成していると考えている。一方、受容体であるアルコールや臭化物も酵素のも う一つの基質結合部位に入る。酵素の活性中心で 3・Phenylpropionic acidのカ

ルボ、キシル基が活性化されるとともに、すぐ近くにある受容体の OH基との聞 に新たにエステル結合を形成させていると考えている(Fig.48)。

Fig. 48. Model of active center in CQA esterase  combined with CA and 2・PA.

99 

3‑3‑1・16.PEBrを受容体とした臭素置換反応と縮合反応

CQAとPEBr、CAとPEBrからなる二基質の濃度を変えて酵素反応をおこ ない、 Lineweaver‑Burk plotを描いたところ、ラインが一点に収束した。本反

7  PEBr O.27M 

PEBrl.12

、

^I

PEBrl.50M  PEBr2.2SM  PEBr2.99M 

PEBr O.7SM 

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PEBr 2.2S:vI 

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ーと

‑0.03  0.07  0.17  II( CQA] (IImM) 

‑0.05  0.05  0.15  l/lCAI (t/mM) 

Fig. 49.  Lineweaver‑Burk  plot  Fig.  50.  Lineweaver‑Burk  plot  against  CQA  and  PEBr  as  against  CA  and  PEBr  as  substrates.  substrates. 

H₂0 

CQA  PEBr  HBr 

QA  CAPE 

E 

E‑CQA‑PEBr→ E‑CAPE‑HBr 

H₂0  CQA  PEBr 

CAPE  HBr  QA 

Fig. 51. Reaction mechanism of CQA esterase with CQA and PEBr as substrates. 

応では二基質のいずれを先に添加しても反応が進行したことから、高速平衡ラ ンダム BiBiメカニズム (Fig.49， Fig. 50.)で反応が進行していると考えてい る。本酵素の 2つの基質結合部位(ポケット)に CQA(あるいは CA)とPEBr が結合して、酵素基質複合体を形成する (Fig.48)。このとき先行基質と後続基 質は互いに無関係に酵素と平衡にあると考えられる。次に活性部位で CQAある いは CAのカルボ、ニル基を活性化させるとともに 別のポケットに結合してい るPEBrのBrを解離させて活性化した PEとCAを結合させて反応が進行して いると推測している (Fig.51.)。

3^・3^・1^・17.メタノールを用いたエステル置換反応

3種類の供与体 (CQA、Cinnamicacid ethyl ester、Cinnamicacid benzyl  ester) とメタノールを受容体とした二基質の濃度を変えて Linweaver‑Burk  plotを描いて、 Km、わ刀ax、Vmax/Kmを算出した。これらの反応は供与体が エステル化合物で、あるため、供与体を加水分解する反応と、供与体と受容体の 間で、エステル置換する 2種類の反応が同時に進行することになる。エステル置 換反応の Vmax/Km値が加水分解反応の値よりも大きかったことから、エステ ル置換反応が加水分解反応よりも優先的に進行していると考えられる(Table 16)。

Table 16. Ester substitution reaction with methanol. 

CQA 

Cinnamic acid ethyl ester 

Cinnamic acid benzyl ester 

Ester substitution reaction 

Vmax  (M/min) 

Km  Vmax/Km  (M)  (min ‑1)  1.0 X 10‑² 7.0 X 10‑³  1.4  Hydrolytic reaction  1.7 x 10‑³ 5.2 X 10‑³ 3.3 X 10‑¹  Ester substitution reaction  3.1 x 10‑⁴ 2.6 X 10‑² 1.4 X 10‑²  Hydrolytic reaction  5.8 X 10‑⁵ 1.2 X 10‑² 4.8 X 10‑³  Ester substitution reaction  4.0 x 10‑⁴ 4.4 X 10‑² 9.1 X 10‑³  Hydrolytic reaction  4.1 X 10‑⁵ 1.0 X 10‑² 4.1 X 10‑³ 

101 

3‑3‑1・18.CQAを供与体とした置換反応

3種類の受容体(メタノール， 2‑PA， PEBr) とCQAを供与体とした二基質 問で置換反応を行わせ、 Lineweaver‑Burk plotを描いたところ、陥1axlKm値 はメタノール>2‑PA>PEBrの1)顕であった (Table17)。また、 CQAとメタノー

T'able 17.  Ester substitution reaction with CQA. 

Ester substitution reaction  MeOH 

Hydrolytic reaction  Ester substitution reaction  2‑PA 

Hydrolytic reaction 

PEBr  Halogen substitution reaction 

Vmax  Km  (M/min)  (M)  1.0 X 10‑² 7.0 X 10 

VmaxlKm  (min‑¹) 

1.4  1.7X10‑³ 5.2x10‑³ 3.3x10‑¹  9.1 xlO‑⁴ 7.5x10‑² 1.2x10‑²  28 X 10‑² 8.2 X 10‑¹  2.2  9.0 x 10‑⁶ 4.4 x 10‑³ 2.0 x 10‑³ 

ルの組み合わせで、はエステル置換反応の VmaxlKm値が加水分解反応よりも圧 倒的に高かったが、 CQAと2・PAの組み合わせでは逆にエステル置換反応より

も加水分解反応が高かった。これは受容体の水への溶解度の違いによると考え られる。メタノールは緩衝液と‑相系を形成するが、 2‑PAとPEBrは緩衝液と 混ざらず二相系をつくる。メタノールを受容体とする一相系では、エステル置 換反応が優先的に進行し、三相系を形成した反応液では、酵素と受容体との接 触回数が少なく、緩衝液に溶けている CQAとの接触が多いため、 CQAの加水 分解反応が優先的に進行したと考えられる。 CQAesteraseは加水分解酵素とし て報告されたが、条件が整えば加水分解反応よりもエステル置換反応が優先的 に進行することを明らかにすることができた。

25 

3 ‑ 3

・

1

・

1 9 .

カフェー酸フェネチルエステル の生理活性

a)抗酸化活性の測定 20 

15  (2

ミ

) O田

O‑

2‑CAPE

では

μM

、

ドキュメント内 コーヒー(Coffea arabica, Coffea canephola var. robusta)の機能性食品素材としての利用に関する研究 (ページ 97-103)