ラクトフェリン関連物質と抗真菌剤との相乗的抗カンジダ作用

H・kk・C…T・ky・）・1t・i・・1・⑩C・p・・1・・50（Ky・w・H・kk・）、Din・…⑧C・p・・1・・（Pfi…

2−3．酵母状発育条件下での抗Cma肋活性の測定

抗真菌剤とラクトフェリン関連物質の酵母状発育条件下でのCα伽。m∫

ラクトフェリン関連物質と抗真菌剤との相乗的抗 カンジダ作用

1．はじめに

アゾール系抗真菌剤は表在性および深在性の真菌症の化学療法に最も広く使 われる、主として静菌的に働く薬剤である。イミダゾール環を有する薬剤、イ

フルコナジールによる断続的な治療がこれらの薬剤に耐性のCαn〃αを出現さ

せている（RexeC〃．，1995）。ある種の抗真菌剤はアゾール耐性C o伽。m∫に有効

性を示すことが報告されているが、これらの研究は主として酵母状に発育する 条件下で得られた結果である（Martinez−Suarez and Rodriguez−Tude1a，1996；

Ruhnkeec〃．，1997）。菌糸状に発育する細胞に焦点を当てた研究が、この形態の 病原性における重要性から必要と考えられる。

ドと、各種抗真菌剤との間のinvitro併用効果を調べた（Wakabayashie〃．，1996b）。

（Wakabayashie〃．，1998）。

2．材料と方法

2−1．ラクトフェリシン関連物質

り返しラクトフェリシンBを除去することで得た。全てのラクトフェリン関連 物質は滅菌水に溶解させた。

アンホテリシンBとクロトリマゾールはSigma Chemica1Co．より購入した。

ナイスタチンとフルシトシンはNaka1aiTesque Co．（Kyoto）より購入した。ケトコ ナジール、イドラゴナジール、フルコナジールはそれぞれNizora1⑩Crcam（Kyowa

Pha㎜aceutica1Japan，Tokyo）から抽出した。フルシトシン、イドラゴナジール、

フルコナジールはそれぞれ滅菌水、O．1NHC1添加DMSO，PBSに溶解させた。

他の抗真菌剤は、DMSOに溶解させた。

2−2．C．α伽。舳∫株

アゾール感受性菌として次の菌株を用いた。ATCCgO028（Nationa1Committee forC1inical LaboratoryStandards documentM27一工1995による推奨株）、TIMM1768

Bactopeptone，2％glucose，1．5％agar）に移し28℃で培養した。それぞれの株の抗 真菌剤に対する感受性はdocument M27−Tにしたがって確認した（Nationa1

Committee for C1inica1Laboratory Standards document M27一丁1995）。

TIMM1768に対する発育阻止活性は微量液体希釈法により測定した（Uchida，

1991）。C o伽。m∫の酵母状細胞をサブロー・グルコース寒天スラントから分取し、

生理食塩水で洗浄、サブロー・グルコース・ブロス（1％Bactopeptone，2％g1ucose，

pH6．5）に105細胞／m1の菌数で懸濁した。20μ1のC舳〃α懸濁液、10μ1のラク トフェリン関連物質ストック液、2μ1の抗真菌剤ストック液、168μ1のサブロー・

その差をCma肋発育量とした。Cα伽。舳sの発育阻止％は次のように計算し た：［（1一薬剤存在下でのCαめた伽s吸光度／Cα伽。舳∫単独での吸光度）×100］

（％）。80％発育阻止濃度を最小発育阻止濃度（MIC）とした。

2−4．菌糸状発育条件下での抗C伽〃α活性の測定

トック液・168μ1のRPmediumを加え、5％CO、大気中、37℃で、15時間培養し た。C．α伽。伽の菌糸状発育量を測定するために、文献に示す方法でクリスタル・

バイオレット（CV）染色法を行った（Abe e〃．，1994；Okutomi ecαZ．，1997）。そ

の方法を略記すると、ウェル中の培地を除去し、接着しているCma肋の菌糸

を70％エタノールで固定する。菌糸をO．02％CVで染色し、水で洗浄する。マ

イクロプレートを乾燥し、O．04NHC1入りイソプロパノール150μ1とO，25％SDS

50μ1をウェルに添加し、混合する。n＝3のサンプルで550−630nmの吸光度を測

2−5．チェッカーボード法による解析

併用効果の評価のために、標準法にしたがってチェッカーボード法を使用し た（E1iopou1os and Moe11ering，1991）。併用した薬剤それぞれのMIC値を算術ス ケール上にプロットした。fractiona1inhibitoryc㎝centration（FIC）indexは次のよう

に計算した：（併用下での薬剤Aの最小阻止濃度／薬剤A単独でのMIC＋併用 下での薬剤Bの最小阻止濃度／薬剤B単独でのMIC）。FICindex値がく1，1．4、

＞4をそれぞれ相乗的、相加的、拮抗的とした。

3．結果

ミダゾール類（クロトリマゾール、ケトコナジール）、2種類のトリアソール類

（フルコナジール、イドラゴナジール）の抗Cm〃α活性を調べた（表5−1）。

アンホテリシンB、ナイスタチン、フルシトシンのMICはラクトフェリンを加

えても変化しなかった。一方、ケトコナジールのMICはラクトフェリン存在下

で非存在下での1／16に低下した。また他の3種のアゾール剤のMICもラクトフ ェリンによって1／4に低下した。

表5−1．各種抗真菌剤の抗Cm〃α活性へ及ぼすラクトフェリンの影響

MIC（ng／m1）

Antifunga1agent

アゾール系抗真菌剤は表在性および深在性の真菌症の化学療法に最も広く使われる、主として静菌的に働く薬剤である。イミダゾール環を有する薬剤、イ

性を示すことが報告されているが、これらの研究は主として酵母状に発育する条件下で得られた結果である（Martinez−Suarez and Rodriguez−Tude1a，1996；

Ruhnkeec〃．，1997）。菌糸状に発育する細胞に焦点を当てた研究が、この形態の病原性における重要性から必要と考えられる。

り返しラクトフェリシンBを除去することで得た。全てのラクトフェリン関連物質は滅菌水に溶解させた。

ナイスタチンとフルシトシンはNaka1aiTesque Co．（Kyoto）より購入した。ケトコナジール、イドラゴナジール、フルコナジールはそれぞれNizora1⑩Crcam（Kyowa

Bactopeptone，2％glucose，1．5％agar）に移し28℃で培養した。それぞれの株の抗真菌剤に対する感受性はdocument M27−Tにしたがって確認した（Nationa1

pH6．5）に105細胞／m1の菌数で懸濁した。20μ1のC舳〃α懸濁液、10μ1のラクトフェリン関連物質ストック液、2μ1の抗真菌剤ストック液、168μ1のサブロー・

その差をCma肋発育量とした。Cα伽。舳sの発育阻止％は次のように計算した：［（1一薬剤存在下でのCαめた伽s吸光度／Cα伽。舳∫単独での吸光度）×100］

トック液・168μ1のRPmediumを加え、5％CO、大気中、37℃で、15時間培養した。C．α伽。伽の菌糸状発育量を測定するために、文献に示す方法でクリスタル・

併用効果の評価のために、標準法にしたがってチェッカーボード法を使用した（E1iopou1os and Moe11ering，1991）。併用した薬剤それぞれのMIC値を算術スケール上にプロットした。fractiona1inhibitoryc㎝centration（FIC）indexは次のよう

に計算した：（併用下での薬剤Aの最小阻止濃度／薬剤A単独でのMIC＋併用下での薬剤Bの最小阻止濃度／薬剤B単独でのMIC）。FICindex値がく1，1．4、

で非存在下での1／16に低下した。また他の3種のアゾール剤のMICもラクトフェリンによって1／4に低下した。