40     60     80     100    120       ヤ Fracuon Number(5 my fraction)

1.0

０               ０             ０               ０ ５

４

３

２

︵口□︶︵聖るＯ

Φ Ｏく石⊇Ｏ０Ｅｃ﹂︶①∽ｏ﹃

︵●︶ ｒＣＣ Ｏ∞ 劇

︹Ｘ︶⊂

Ｏσ

﹂０∽ ｎ＜

８         ６         ４ ０         ０         ０

0.2

   40     60     80     100    120      

ヤ

Table ll.Effects of enzyme treatments of syno alttuid(SD On Oxidative response of neutroph‖ s

Oす release(nmole/106 ce‖^S)

Expettment Enzyme      +pooled fracuon[Ratio]°

  

‐pooled frac∬on lb)    No addition 22.8±0.5   11.431        15.9±0.9 2C'     No addition

Trypsin Actinase

21.8±07 [1.3コ

12.2± 0.5   [0.83〕

14.1 ±1.0   〔^0.831

15.9±0.8 14.7±0.8 17.0± 2.1

3d)    No addition 195±0,7   [1.231

Chondroninase AC   24.7± 0.6  [1.331 Hyaluronidase        22.1  ±0.9   [1.26〕

鮮Glycanase

OぃGlycanase

21.2±0.1   [1.28〕

13.3± 0.4   [0.87]

15.9± 0.8 18.6± 0.4 17.6± 0.5 16.6± 0.3 15.3± 0.8 12.5± 0.5 GlycOpeptidase A     2刊 .5±0.4   [1.721

Neutrophil activating pooled fraction of SF aRer filtration chromatography on Sephacryl

S‐500 was treated with various enzymes,and then used for coatings ofigG‐ precoated surfaces.Control experiments were carried out in the absence ofthe pooled fraction.

Neutrophils(3.6× 1 0SceWs)on the surface were incubated for 60 min at37°C,and O」

release was measured.Values are the rnean tt S.D.ofthree separate experiments, where each was performed in tttplicate.Negat e control(plastic surface)value was 5.0

±0 3 nmole′1 06ce‖S.a)Each value in square parenthesis expresses the relative ratio to each control(withOut pooled fraction).POOled fractions were incubated at 37° C forb)Oh,

C1l h andd)24 hinthe presence or absence of enzymes.

ヒアル ロ ン酸 に よ る表 面処 理 が 好 中球 の^02‐ 産生 及 び 接 着 に及 ぼ す影 響

ヒアル ロン酸 によ リプ レー トを前処理 した場合,IgGまたは関節液に よるプ レー トのコー ト処 理 時 に ヒアル ロン酸 を共存 させ た場合,及^びIgGをコー トしたプ レー トをさ らに ヒアル ロン酸 で処理 した場合 の好 中球の

02産

生 挙動 と接着細胞 数 を検討 した.IgGをコー トす る前 に ヒアル ロン酸で プ レー トを処 理 す る と

,好

^{中球 の}

02産

生 に対 して分 子量^{2.0× 106の} ヒアル ロン酸は

01〜 20

mg/mlの範 囲で影響 しなか ったが,分^子量

95x105及

び2.8×10Sのヒアル ロン酸 は促進す る傾 向が 認 め られ た(Table 1 2)。 一方

,予

め ヒア ル ロン酸 処理 したプ レー トをIsG,次い で関節液で コー ト す る と,高分子量 ヒアル ロン酸(猛 ^2.0×106)の みが02 産生 を抑制 した。しか しなが ら濃度依存性 は見 られなか った

.プ

レー トをIgGコー トす る際 に ヒアル ロン酸(2.O mg/ml)を 共存 させ た場 合,

弱 く

02産

生 が抑制 され たが

,分

子量依 存 性 は認め られ なか った。IgGコ ー トプ レー トを関節液で さ らにコー ト処理 す る際 に ヒアル ロ ン酸 を共存 させ た場合 に も,ヒ アル ロ ン酸は 02 産 生 を抑制 し た 。しか しな が ら濃度及び分子 量依存性 とも認め られなか った。IgGコ ー ト後)ヒアル ロン酸で処 理 した プ レー ト上で の好 中球 の^02‐産生 は

,分

^子量

95x105及

び2.8× 105の ヒ アル ロン酸(20 mg/ml)で は影響 され なか ったが,高分子量 ヒアル ロ ン酸(猛 ^2.0×106)は 01〜 20 mg/mlの_{範 囲で}

Table 1 2. Effect of hyaluronan(HAltreatment of biongical surfaces on Of release by settled neutrophils

Surface treatment HA Oゴ release

2nd    M「

  Concentrauon (nmOle/1o6celに)[RaJol→

Experiment  Pre‐    l st lgG

lgG+HA

2,8× 105   2.O mg/ml 9.5x105  2.O nlg/ml 2.0× 106   2.O mg/ml

18.9± 0.3     [1.001 13.6± 0.5     [0.72〕

13.3± 0.6     10.73〕

15.4±0.5     「_0.81i

Ｇ Ｇ

ｇ  

Ａ ｇ

Ｈ

2,8× 105

9.5×105

2.0×106

HA    2.8× 105 9.5×105 2.0×106

0.l mg/hi O.5 mg/mI 2.O mgん￢^I O,l mg/hl O.5 mg/hl 2.O mg/ml O.l mg/mi O.5 mg/mI 2.O mglrnI 2.O mglhi 2.O mgん￢l

O.l mgれコl

O.5 mg/ml 2.O mg/ml

O.l mgれ￢^￨ 0.5 mg狩￢￨

2.O mg/ml O.l mgれ￢￨

0.5 mg/ml 2.O mg/ml O.l mg/mI O.5 mgんⅥ^I 2.O mg狩￢^l O.l mg狩￢^l O.5 mg狩￢￨

2.O mgん￢^￨ 0.l mg/ml O.5 mgん￢^￨ 2.O mg/ml O.l mgん￢^￨ 0.5 mg狩コ￨

2.O mglrnI

15,9± 0.8 18.3± 0,4 19.7± 1.2 20.0±0.1 20.2±0.3 21.1±0.5 20.7±1.0 17.5■ 0.9 17.1± 0.5 16.0± 0.2 16.5± 0.9 16.8± 0.8 13.6± 0.5 13.4± 0.9 1■2±0.4 39.3±0.8 40.2±0.9 36.9±1.8 38.1 ±0.9 39.4±0.1

37.8±0,6 36.8±0.5 26.2±1.1

25.6±1.3 27.2±0.4 27.3±0.9 25.5±0.5 26.6主1.2 26.3±1.8 24.8±0.1

25,9±0.5 27.5±0.5 24.3±1.4 26.4±1.0

[1.001 [1.151 [1.241

[1.26〕

[1.27〕

[1.331 [1.301 [1,101 [1.08]

[1.011

[1.04〕

[1.061 [0.861 [0,841 [0.701

[1.001

11.02〕

〔^0,941

〔^0.971

[1.001 [0,961 [0.941

[0.67〕

[0.65〕

[0.691 [0.711 [0.651 [0.681 [0.67]

[0.63〕

[0.66〕

[0.701 10.621 [0.671 lgG

̀IgG   SF

HA   lgG   SF    2.8×

105

9.5×105

2.0× 106

1gG  SF+HA  2.8× 10S

9.5×10S

2.0× 106

Neutrophils(3.6× 1 0Sce‖s)on the suttaces treated under various conditions were incubated at37°_C for 60 min,and Of release was measured.PIastic surfaces were pretreated at 37° C forl h wКh HA ofd‖ ferent molecular weights(M「 2.8× 105,9.5× 105,and 2.0× 106)at O.1,0.5,and 2.O mg/mI.lsttreatment wRh lgG was cartted out at 4°C overnight and 2nd whh syno al‖uid(SD waS37°C for l hinthe presence or absence of卜 →A of different molecular weights atthe indicated concentrations. Values are the mean tts.D.

ofthree separate experiments, where each was performed in triplicate.a)Each value in squareparenthesis

:と 現 憔 q尉

当吊甲 略 錦 ΣК淀請ゴ需 呈ぢ?汗X!l:汗♂ 雉 響肥 と

・

ゴ詔 ‖穐 馴 撃 七

8♂

^鯰

respectively.

好 中球の接 着 に対 しては,分子量 20× 106の ヒアル ロン酸 (20 mg/ml)を 用い て検討 した。好 中 球の接着数 は,プレー トの ヒアル ロン酸 に よる前 処理 によ り増加す る傾 向が認め られたが,そ^{の 他} の処理では全 く影響 を受けなか った(Table 13)。

Table 1 3. Effect of hyaluronan(HAl treatment of bio gical surfaces on neutroph‖  adhesion

Suttace treatment Number of adherent neutrophils (CelIS/mm2)  ^「Ratioi°

l st    2nd lgG

lgG+HA lgG    HA HA   lgG

1197±83    [1.001 1231 ±42    [1.031 1124± 102   [0.94〕

1502± 129   [1.25]

Ｇ Ｇ Ｇ

ｇ   ｇ  

Ａ ｇ

Ｈ

SF

SF+HA

SF

1095± 239   [1.001 1046± 164   [0.961 1203±49    11.101

Neutrophils(1800 ceWs/mm2)added On the surfaces treated under various conditions were incubated at 37° C for 60 min.Aner gentle washing,adherent ce‖s was counted. PIastic surface was pretreated wnh 2.O mg/ml HA(Aガ r2.0×^106)at 37°C forl h.lsttreatment wRh igG was carHed out at4°C overnight and 2nd wnh synO alttuid(SD was 37°C for l hin the presence or absence of 2.O mg/mI HA(Aガ 「 2.0× 106).values are the mean tt S.D.ofthree separate experiments, where each was performed in trip‖ cate,a)Each Value in square parenthesis expresses the relative ratio to the appropriate control (wnhOut HA treatment).

考 察

好 中球接着表面の関節液 に よる処 理が)好中球の

02産

生挙動に及 ぼす影響 を検討 した。IgGコー ト表面を関節液 で さ らにコー ト処理す ると

,IgGコ

ー ト表面に比較 して 好 中球の^Oゲ 産生が増強 さ

れた(Table 8).プ ラスチ ック表面 を関節液 で処理 して も,IgGコ ー ト表面 を関節液 で処理すること

により増加 した量に相当する^{02 産}生は認め られなか った。また IgG/関 節液コー ト表面上の接着細 胞数は

,IgGコ

ー ト表面 と比較 してやや少ないことが示された(Flg.27)。 従つて 関節液の

02産

生 増強作用は

,予

め表面に結合 したIgGと共働的であ り

,好

中球の

02産

生機構が直接 活性化された 結果 と考え られ る。

関節液 中には好 中球の活性酸素 産生 を刺激す る因子の存在が報 告 されてい る[116‑121].こ の因子 に対 する好 中球 の応答 性 は熱 凝集IgGと類 似 す る こ と[116,118],関 節液 を遠心(11600×

g,2〜

5 min)し た上清では刺激活性が低下 してい ること[118,120],さ らに関節液 中の刺激活性 は^{prOtein A―}

アフイニテイー クロマ トグラフィーに よ りほぼ完全に除去で きるこ と[117,120]が示 されてい る。従 つ て関節液 中の好 中球刺激 因子は,分子サイズの大 きな,粒子性 のIgG複_{合体及 び可溶性}IgG凝_集物 であ ると結論 されている。また好 中球の活性酸素 産生 を刺激す る作用の弱い熱凝集IsGも_{,リ ュー} マチ因子で前処理す ることに よ り刺激活性が顕著 に増大す る ことが示 されてい る[116]。 これ らの こ とか ら,IBGコー ト表 面 を関節液 に よ りさ らに処理す ることによ り,用いた関節液 中に存在 す る 可能性 のあ る免 疫複合体が表面 に付着 し

,好

中球 の

02産

生 を促進す るこ とが考 え られ る 。しか し なが ら用い た関節液 は遠心 (11000× g,20 min)に よ り粒 子性 のIgG複合体 が除かれ てお り,また Am Gel protein Aで 関節液 を処 理 して も大部分のIgG共_働性02 産生促進活性は保持 された_(Table

8)。 さ らに IgGコ ー ト表面 を 斑猟erum存在下 または 非存在下

,熱

^{凝集 ヒ トIgGで}二 次処理 して も 02 産生増強効果はわずかであった。これは無処理 ヒ トIgGを 用いて も同様 であった。従 つて,関節 液 中に存在 す るIgG共_働性

02産

生促進物質は免疫 グロブ リンタイプの ものではない と推定 され る。

慢性 関節 リューマチ や変形性 膝 関節 症患者 の関節 液 中には

CRPが

存在 す るこ とが 示 され てい る

[135]。 また関節組織への

CRP沈

着 も報告 されてい る[136].CRPは 熱凝集 させた場合

,CRP単

^{独 では}

作用 を示 さないが,熱凝集IgGによる好 中球の細胞 内活性酸素産生 を増強す るこ とが報告 されてい

る[137,138]。 そ こでIgGコー ト表面 を熱凝集化及 び比較のための無処理

CRPに

よ り二次処理 したが,

いずれの場合 も好 中球か らの^{02 遊}離 は促進 され なか った 。従 つて IgG/関 節液 コー ト表面上での好 中球の

02産

生 に

CRPが

関与 す る可能性 も低い と考 え られ る。

IsGコー ト表面 を関節液で さ らにコー トす る ことによ り,そこへ接着 した好 中球の

02産

_生が増

強 され る とい う報告例 はない 。しか しなが ら未知 または既知 を問わず,関節液 中の何 らかの成分が IgG結合表面上 に沈着 した結 果 と考 え られ る。この成分の物質的特徴 を調べ るため,先ず関節液 中 のIgG共働性02 産生促進物質の分子量分布 をSephacryI S‑500カ ラムを用いて検討 した.こ の結果,

関節液 中の

02産

_{生促進活 性は}

Vo領

域 にやや遅れて 回収 され

,活

性成分 は 大 きな分子サ イズ を持 つ ことがわか った(Fig,28)。 一般 的に 巨大分子は糖 とタ ンパ ク質の複合体で あ る場合が多 いので,

カ ラムか ら溶出された活性成分 をプール し,糖質分解酵素及び プロ

>ア

ーゼ に対 す る感受性 を検討 した 。この結果 ,trypsin及 び^actinaseによ り

02産

生促進活性が 失われた(Table ll)。 従 って活性成 分 の構 成 要 素 と して タ ンパ ク質 の存 在 が 示 され た 。糖 質分 解 酵 素 で は

,用

い た酵 素 の 中で 0‑glycanaseの みが失活 させた。これ らの ことよ りIgG共_働性02 産生促 進物質は,タ ンパ ク質骨格

のserineまたは^threonineに galactose(β l→3)丼acetylgalactosalnine残基が 0‑グ リコシ ド結合 した ムチン型糖鎖 を持 つglycoconJugatesで あることが示唆された。^{02 産}生促進物質 の表面沈着状態 と

してぅIgGが糖鎖 を認識 して結合 し,外部ヘタンパク質部分 を露出 させ るものぅまたは逆にIgGと タンパク質部分の相互作用によ り結合 しぅ外部へ糖鎖 を露出させ るものが考えられ る.い ずれの場 合でも活性成分中の精鎖 とタンパク質部分 が結合 して いることが活性発現 に必須であ ると考え ら れる。

IsGコ ー ト表面 とIgG/関節液コー ト表面での好 中球の

02産

生は 飩aurosPorine及びH‑7に よ り強 力に抑制された(Table 9)。 しか しなが ら表面上への接着細胞数 は影響 を受けなかった(Table 10)。

従 つて表面接着後の好 中球の^{02 産}生経路にはprotein kinase Cが関与す ることが示された。カルモ ジュ リン拮抗剤である

W7も

_強力に

02産

生を抑制 したが,こ れは

W7添

加によ り好中球の接着が ほぼ完全に抑制された ことと関連 するもの と考えられ る。Phosphatase阻 害剤の影響 を検討 した と

ころ,okadaic acidは IgGコー ト表面 とIgG/関節液 コー ト表面のいずれに対 して も接着細胞数に影

響 しなかつた。一方calyculin Aに は強い細胞接着抑制作用が認 め られ,こ れ らの現象は^Oゲ産生量 と相関 していた。Caluculin Aと okadaic acidは phosphatase type‑2Aに 対 する阻害力 は同程度だが,

phosphatase type‑1に対 してはokadaic acidの阻害作用は弱 く,calyculin Aは よ り強力な阻害作用を 示す[139].従つて好 中球の接着に対 してphOsPhttase type‑1が重要な働 きを していると考えられ る。

また calyculin Aに よる細胞 接 着 抑制 はIgG/関節 液 コ ー ト表 面 で強 く見 られ るこ とよ り,

phosphataseの 関与 の程度 も表面 コー トの違いに よって異なるもの と考 えられ る。Okad ^c acidは

IgG/関 節液コー ト表面での好中球 の

02産

生を弱 く阻害 したがぅNADPH oxidaseの_{活性化に必要な} タンパク質であるp47?ん οχとp67?ん 餌ぅ及びprOtein kinase Cの細胞質か ら細胞膜への移行を部分 的に抑制 している可台旨陛もある[140].

種々のタ ンパ ク質性 細胞外マ トリックスでコー トされた表面上での接着好中球の活性酸素産生 に対 して,好中球表面上に発現されているβ2イ ン

>グ

リンが重要な役割を果た すことが報告され

ている[141,142]。 本研究においてもβ2イ ンテ グ リンに共通 のサブユニ ッ トであるβ鎖の抗体^allti̲

O剪

8は_{好中球の接着及び}

02産

_{生を抑制 し,そ}の作用は特にIgG/関 節液コー ト表面 で顕著であつ た(Table̲9及び^‑10)。 一方

,LFA‑1(CDHa/CD18)α

鎖 を認識するanti̲CDllaは 細胞接着を全 く抑 制 しなかつたことよ り

,関

節液中の

IgG共

働性 02 産 生促進物 質はMac̲1(CDllb/α剪8)ま たは P150,95(CDllc/CD18)の リガン ドであ る可能性が示唆される。^Anti―

CDllaは

_{好 中球の接着性には}

影響 しないが

,02産

生に対 しては抑制作用を示 した。細胞上のLFA‑1がぅ接着性 とは無関係に接 着表面上での

02産

生に影響 しているか も知れない。

細 胞 膜 透 過 性 の

cAMPア

ゴ ニス トで あ る^di―Bt―

cAMPと ,ア

クチ ン重 合 阻害 剤 で あ る^cyto―

chalasin B[93]は ,好中球 の接着数 と^{02 産}生量 に対 して同 じ抑制挙動 を示 した。Cytochalasinは,好 中球の基 質表面 へ の接 着 に影 響 す るこ とな く接着表面での細胞 の伸展性 を阻害 し,02 産 生 を抑 制 す るこ とが報告 され てい る [143‑145].cAMPも 細胞骨格 の再構 成 と好 中球の接着 表面上での伸展性 に阻害的であ ること[143,1窮],ま た

cAMPは

好 中球 の^{02 産}生 をprOtein kinase Cの 作用 位 置 よ り下 流 で抑制 す るこ とが報告 されてい る[147]。 これ らの報告 と)cytochalasin B及 び^di―Bt―

cAMPが

IgG コー ト表面で好 中球 の接着数 に影響す るこ とな く

02産

生 を阻害す る結果 とは良 く一致す る。しか

しなが らIgG/関 節液 コー ト表面では接着好 中球数 を減 少させ,、 それ に応 じた02 産生量 の低下が認 め られ た(Table̲9及び^‑10)。 関節液 でコー トす るこ とに よ り,好中球の接着 しに くい表面状態 になっ た もの と推定 され る 。好 中球 の活性 酸素産 生や伸 展性 を抑制す るこ とが報告 されて い る^tyrOsine kinase阻害剤^genisteinの作用様 式 も,cytochalasin Bや ^di―Bt―

cAMPと

比較的類 似 していた 。また百 日咳毒素 は アクチ ン再 構成 に影響 しない と報 告 されて い るが[1縄],そ の作 用は^genisteinと近似 し ていた 。

異な る22例の忠者 の関節液 を用いてIgG共_働性

02産

生促進活性 を調べた。用い る関節液 によ り 全 く活性 を示 さないも のか ら

,IgGコ

ー ト表面に比べて約

22倍

の

02産

生促進 活性 を示す もの ま で個人差が認め られ た (Fig 26).忠 者の病態 との関連^j陛に興味が持 たれ る。

最後 にぅ好 中球接 着表面 の ヒアル ロン酸 処理が好 中球の

02産

生 に及 ぼ す影響 を検討 した。この 結果

,IgG及

び関節 液 で表 面 コー トする際に

01〜

20 mg/mlの分 子量 の 異 なる ヒアル ロン酸(猛 20× 106,95× 105及び28×105)を 共存 させ ると)好中球 の

02産

_{生 が抑制 され た}(Table 12).ヒ ア ル ロン酸処理表面を

IgG,引

き続 いて関節液でコー トす る場合,及^びIgGコ ー ト表面 をヒアル ロン 酸で後処理 す る場合 には 高分子量 ヒアル ロン酸(猛 ^2.0×106)の み抑 制作用 を示 した。好 中球の接 着 に対 しては,いず れ の場 合で も分子 量20× 106の ヒアル ロン酸(20 mg/ml)は影響 しなか った

(Table 13)。 これ らの こ とよ り,先ず ヒアル ロン酸はIgG,及_{び関節液 中の}IgG共_{働性好 中球活性化}

物質の沈着 を抑制す る可能性があ る。この作用に対 して,検討 した範 囲では ヒアル ロン酸分子量 の 影響はない と考 え られ る。第2の可能性 として

,好

中球接着表面上 に固定化 され た ヒアル ロン酸 と 好 中球上 の ヒアル ロ ン酸 レセ プター との結 合 によ り,直接 的に好 中球 の

02産

生 が抑制 され ること が考 え られ る。ヒアル ロン酸 レセ プ ターは細胞 骨格 と会 合 してい る ことが報 告 されてい る[57‑59].

従 つて,巨大分子で あ るヒアル ロン酸が複数の レセ プター と結合 す ることによ り,複数 のアクチ ン フィラメ ン トが クラスター状態 を形成 す ることが推測 され る(Schema IH参 照)。 この ような状態は アクチ ンの再 構成 に影響 を与 え

,好

中球の

02産

生 を抑制 す ることが考 え られ る。この場合

,1分

ドキュメント内 ヒアルロン酸の細胞機能修飾作用に関する研究 (ページ 58-78)