0.25
1 2 3 4
(ー)
(+)
Fig.2・9 Native-PAGE ofPPO and hemolymph
Crude hemolymph was subjected to native PAGE on a
10 % separating gel， and proteins were visualized by silver staining (Lane 1). Purified PPO (Lane 2) and crude
hemolymph (Lane 3) were subjected to native-P AGE on 10 % separating gel， and PPO were detected by activity staining.
Crude hemolymph was subjected to native PAGE on 4.75 % separating gel， and PO and/or PPO were detected by activity staining (Lane 4).
25
第三章プロフェノールオキシダーゼイソフォームの分隊、 精製およびその 性質
第一節緒言
カイコa80系統の体液中には3種のPPOイソフォームが存在することが前 章の実験より明らかとなった。 PPOの生化学的および生理学的性質を調べる ためには、 まずこれらのイソフォームを分離、 精製しその諸性質を調べるこ とが必要不可欠である。 本章では、 カイコa80系統よりPPOイソフォームを 分離精製し、 その諸性質について検討した。
第二節実験材料
第一項 カイコ系統および体液採取法 前章の方法により、 体液を採取した。
第二項 試薬
Q-セフアロースは、 ファルマシア社製を用いた。 その他の試薬は、 市販 の特級のものを用いた。
第三節 実験方法
第一項 プロフェノールオキシダーゼの検出(活性測定法)
前章の方法に従い、 フロフェノールオキシダーゼをDBMAにより活性化し た後に生じるフェノールオキシダーゼ活性を利用し、 検出した。
第二項 分子サイズ
SDS-P AGEは、 前章の方法に従って行った。 ゲル瀦過は、 Andrewsの方 法1)に準じてSuperose 12HR 10/30カラムを用いて行った。 すなわち、
0.15 M塩化カリウムを含む10mMリン酸カリウム緩衝液(pH 6.5)で平衡 化し、 同緩衝液でタンパク質を溶出した。 標準タンパク質は、 カタラーゼ
(240 kDa)、 アルドラーゼ(158 kDa)、 牛血清アルブミン(68
kDa)、 卵白アルブミン(45 kDa)そしてキモトリプシノーゲンA(25 kDa)を用いた。
第三項 等電点
等電点は、 Svenss on の方法2)�こ従って等電点電気泳動を用いて測定し た。 すなわち、 pH 3.5-
10の2%アンフォラインを含む5%ポリアクリルアミ
ドゲルを用い、 40C、 200 Vで12時間泳動し、 さらに400 Vで1時間泳動し た。 PPOは、 活性染色法にて検出した。 ゲ、jレのpHは、 ゲルを2mmごとにス ライスし、 蒸留水(1ml)でアンフォラインを抽出し、 pHメーターを用い て測定した。
第四項 基質特異性(ミカエリス定数、 最大速度および触媒効率の測 定)
速度論的特性(ミカエリス定数、 最大速度そして触媒効率)を
Lineweaver-Burk plotを用いて求めた。 基質は、 L-ドーパ、 ドーパミン、
N-アセチルドーパミン、 Lーチロシンそしてヒドロキノンを0.476-3.810 mMの濃度範囲で使用した。 また、 L-ドーパ、 ドーパミンそしてLーチロシン
は475nm 、 N-アセチルドーパミンは400nrn そしてヒドロキノンは440 nrn の吸光度で前章第三節の方法で、活性測定を行った。
第四節 実験結果
第一項 プロフェノールオキシダーゼイソフォームの分離、 精製
プロフェノールオキシダーゼは、 以下の操作によって精製した。 特に断ら ない限り、 精製操作はすべて4'Cで行った。 凍結乾燥した体液3gを1M硫酸 アンモニウムおよび0.1mMPMSFを含む10mMリン酸カリウム緩衝液 (pH 6.5) 200 rnlに溶解した。その後5，600X gで30分間遠心分離を行い上 清を粗抽出液とし、 同緩衝液で平衡化したブチルトヨパール650Mカ ラム
(2.5 X 23.5 cm)に供与した。 同緩衝液でカラムを洗浄後、硫酸アンモニ ウム濃度を 1 MからOMに直線的に下げ、吸着した蛋白質を溶出し、活性画分
(0.4 M付近)を集めた(Fig.3-1)。 この活性国分を塩析により濃縮後、0.5 M KClを含む10mMリン酸カリウム緩衝液 (pH 6.5)で平衡化したセ フアクリルS-200カラム(2.2
X
140 cm)に供与した(Fig. 3-2)。 得られ た活性画分を塩析により濃縮し、 平衡化緩衝液に対して透析後、 再び同条件 にて同カラムに供与した(Fig. 3-3)。 得られた活性画分を10mMリン酸カリウム緩衝液(pH 6.5)に対して透析を行い、 同緩衝液で平衡化したQ
セフアロースカラム(0.8
X
28.5 cm)に供与し、 I(Cl濃度をOMから0.3 Mに直線的に増加させることにより溶出を行った(Fig. 3-4) 0 KCl濃度 0.25 M付近に活性画分が溶出された。 このタンパク質の溶出と活性の溶出パ ターンは一致していなかったので、 各フラクションをNative-PAGEにて分 析した。 活性染色および銀染色を行ったところ、 単一な成分を含む画分を得 ることが可能であり、 溶出JII貢にフラクション200-202をQ1，フラクション 210をQ2そしてフラクション226をQ3とした(Fig. 3-4， inset)。Q1、 Q2そしてQ3画分をNative-PAGEに供与し、
活性染色および、銀染色を行った結果をFig. 3-5に示した。 それぞれQ1，Q2そしてQ3は、 それぞれ 移動度の異なる1本のバンドを示した。 これらのバンドの移動度は、 カイコ 体液を泳動した時に生じる3本のバンドの移動度に相当していた。 この結果 より、 体液中の3種のプロフェノールオキシダーゼイソフォームが単一に精 製されたことが示された. これらの精製過程の各段階における酵素活性、 タ ンパク量および比活性を測定し、 Table 3-1にまとめる。 PPOイソフォー ム、 Q1，Q2そしてQ3は、 それぞれ粗抽出液より24.8，69.0 そして150倍ま で精製できた。 また、 比活性は5.2，14.5 そして31.4U/A280であった。
第二項 プロフェノールオキシダーゼ の性質 (1)分子サイズ
精製したそれぞれのイソフォームをSDS-PAGEに供与した結果を、 Fig.
3-6 に示す。 それぞれのイソフォームQ1， Q2そしてQ3は、 いずれも73kDa および74kDaの2本のポリペプチドより補成されていた。 Native�犬態の分子 サイズをSuperose 12HRカラムを用いたFPLC により推定した。 その結果、
Q3の分子サイズは、 122kDaと推定された(Fig. 3-7)。
(2)等電点
等電点電気泳動を用いて精製されたPPOイソフォームの等電点を調べた結 果をFig. 3-8 に示すo PPOイソフォームQ1、 Q2そしてQ3は、 それぞれ単一 のバンドを示し、 pH勾配によりその等電点は、 Q1が5.55、
Q2が5.63そし
てQ3が5.58であった。 分離されたそれぞれのイソフォームを再び混合し、等電点電気泳動に供与したところ、 それぞれ等電点5.55、 5.58そして5.63の ところ に移動した。
(3) pH安定性および、至適pH
Q1， Q2そしてQ3を異なるpHで40C、 24時間放置後、 残存活性を測定し た。 結果を、 Fig.3-9に示す。 いずれのイソフォームもpH6-10の範囲で安 定であり、 pH 6以下およびpH 10以上で不安定であった。 DBMAによる PPOの活性化反応の至適pHの結果をFig.3-10 (A)に示す。 いずれのイソフ ォームもpH 6.5付近で最大活性を示した。 また、 活性化されたPPOの触媒 反応における至適pHを測定した結果をFig. 3-10 (B)に示す。 至適pHは、
Q1が5.5から7.5、 Q2が5.5から7.5そしてQ3が5.5から6.5であった。
(4)基質特異性(ミカエリス定数、 最大速度および触媒効率の測
定)
L-ドーパ、 ドーパミン、 Nーアセチルドーパミン、 Lーチロシンそしてヒド ロキノンを基質としてQ1、 Q2そしてQ3の基質特異性を調べたo また、
Lineweaver-Burlζplotを用いてミカエリス定数(Km)、 最大速度 (Vmax)そして触媒効率(Vmax/Km)を求めた(Table 3-2)。 その結
29
果、 いずれのイソフォームもL-ドーパ、 ドーパミンそしてNーアセチルドー パミンに対してのKm値は、 0.99'"'-'4.71 mMの範間にあった。 その触媒効率 は、 Q3> Q2 > Q1であった。 いずれのイソフォームもドーパミンを最も良
い某質としていた。 Lーチロシンおよびヒドロキノンの酸化は、 触媒しなかっ た。
以上、 3E性質を調べた結果をTable 3-3にまとめた。
第五節 考察
カイコPPOのイソフォームの分離、 精製に初めて成功し、 Q1、 Q2および Q3の精製標品を得た。 SDS-PAGEの結果、 Q1、 Q2およびQ3は、 いずれの イソフォームにも73kDaおよび74kDaのポリペプチドが含まれることがわ かった。 Q3の分子サイズは、 ゲル瀦過を用いて調べたところ122kDaであ り、 Q3は73kDaおよび74kDaのヘテロダイマーであることが予想される。
安原らは、 錦秋×鐘和系統由来のPPOは、 71.5kDaおよび71kDaの2つの ポリペプチドより構成され、 native状態の分子サイズは、 126kDaであるこ とを報告している3)。 この結果から、 彼らは、 2つのポリペプチドは、 ヘテ ロダイマーを形成していると示唆している。 そして、 錦秋×鐙和系統の体液
中には、 2種類のヘテロダイマーの存在を報告している。 しかし、 これらの ヘテロタイマーすなわちイソフォームは、 Mono-Qやhydroxylapatiteを用 いても分離不可能であることを報告しており3)、 彼らが調べたPPOの諸性質 は、 2種類のイソフォームが混合した状態で検討したものである。 その他の 無脊椎動物において、 SDS-PAGEの結果、 ショウジヨウバエ(Drosophi1a melanogaster) PPOの分子サイズは、 78kDaおよび77kDa 4)、 ザリガニ
(Pacifastacus leniusculus)の分子サイズは76kDa 5)、 タバコスズメガ (Manduca sexta)の分子サイズは、 77kDaおよび71kDa 6)であり、 カイ コPPOの分子サイズと近い。
Q1、 Q2そしてQ3の等電点(pl)は、 5.55、 5.58そして5.63であった。 そ の他の無脊椎動物由来のPPOのpIは、 錦秋×鎧和系統のpIが、 それぞれ4.95
そして4.98であり3)、 ザリガこでは、 5.45)、 ショウジョウパエでは、 5.8お よび6.7である4)。 すなわち、 報告されている無脊椎動物由来のPPOは、 いず れも酸性タンパク質である。
前章において確立したDBMAを用いての活性測定法で基質特異性について 検討した。 いずれのイソフォームもoージフエノールの酸化を触媒したがpージ、
フエノールおよびモノフエノール類の酸化は触媒しなかった。 これに対し て、 ショウジョウバエにおいては、 モノフエノール類を酸化するものとジフ エノール類を酸化するイソフォームの存在が報告されている4)。 次にKm Vm以そしてVmax/KmをL-ドーパ、 ドーパミンそしてN-アセチルドーパミ
ンに対して測定したo Km{1直は、 0.99"'-'4.71mMの範囲にあり、 ほとんど同 じであった。 タバコスズメガにおいては、 体液のPPOと皮膚のPPOのドーパ に対するKm{1直は、 それぞれ4.15そして8.4mMであった6)。 また、 ドーパミ ンに対する両酵素のKm{1直は、 0.71および0.91であり、 ドーパに対してはカ イコ由来のPPOの方が親和性が高く、 ドーパミンに対してはタバコスズメガ 由来の方が親和性が高かった。
第六節 小括
(1)カイコa80系統の体液から、 ButylToyopearl 650M疎水クロマトグラ フィー、 SephacrylS-200ゲル癒過クロマトグラフィー、 Q-Sepharose�
イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて3種のPPOイソフォーム、
Q1、 Q2およびQ3を分離、 精製した。
(2)いずれのイソフォームもSDS-PAGEの結果、 73kDaおよび:74kDaの ポリペプチドより構成されていた。 ゲル滅過の結果、 Q3の分子サイズは、
122 kDaであった。
(3)等電点は、 Q1が5.55、 Q2が5.63そしてQ3が5.58であった。
(4)いずれのイソフォームもpH6-10の範囲で安定であり、 DBMAによる 活性化の至適pHは、 6.5であった。 また、 活性化されたPPOの触媒反応にお
ける至適pHは、 Q1および、Q2がpH 5.5-7.5そしてQ3がpH 5.5-6.5であっ
31
た。
(5)いずれのイソフォームもLードーパ、 ドーパミンそしてN-アセチルドー パミンの酸化を触媒した。 一方、 L-チロシンおよびヒドロキノンの酸化は、
触媒しなかった。