デンドリマー/シクロデキストリン結合体の調製

トシル化 α-CyD の調製: Melton らの方法に準じて合成した. ⁶⁸⁾ ベンゼンで水分 を共沸除去した乾燥 α-CyD 8 g を無水ピリジン 500 mL に溶解後, 5 °C 以下に冷 却, 攪拌しながらp-トルエンスルホニルクロライド 6 g を加え, 室温で 2 時間攪拌し た. 反応溶液に水 (約 100 mL) を注ぎ込み反応を停止させた後, 減圧濃縮し, ア

セトン 100 mL を添加して析出した沈殿物を濾取した. 沈殿物は吸着クロマトグラフ

ィーを用いて分離, 精製した. (多孔性ポリスチレン樹脂 (DIAION^® HP-20); 溶離液: メタノール/水=0:100 v/v ? 100:0 v/v; 2.3 g, 収率 29%). FAB-Mass [M-H]^- m/z 1125.

デンドリマー (generation 2)/α-CyD conjugate の調製: デンドリマー (G2) 0.5 mL

(2.6x10^-5 mol) を試験管エバポレーターに加えて減圧下メタノールを完全に留去した.

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その後, トシル化 α-CyD 26 mg および DMSO 0.5 mL を加えて軽く混和し, 試験管 内を窒素置換後, 油浴中, 60 °C で 24 時間攪拌した. 反応物をTOSOH TSKGel HW-40S (5.3 cm²x70 cm, 溶出緩衝液: 0.1 M 炭酸水素アンモニウム) を用いてゲル 濾過した. Conjugates を含むフラクション画分を濃縮後, 濃縮液を 0.5 mL の水に 再溶解し, メタノール 3 mL を加えて十分に白濁するまで混和した. 沈殿物を含む 溶液を 1,500 rpm, 15 分間遠心分離後, 上清のメタノールを取り除き, 再びメタノー ル 3 mL を添加してよく混和し, 同様に遠心分離した後上清を取り除き, 残渣中のメ タノールを試験管エバポレーターにより完全に留去した (収率 18 %). ¹H NMR (500 MHz, D2O) δ (ppm from TMS) 5.29 and 4.96 (H1, α-CyD), 3.94-3.61 (H3, H5, H6, α-CyD), 3.60-3.33 (H2, H4, α-CyD), 3.33-3.08 (dendrimer methylene), 3.08-2.94 (dendrimer methylene), 2.94-2.60 (dendrimer methylene), 2.60-2.43 (dendrimer methylene), 2.43-2.15 (dendrimer methylene).

トシル化 β-CyD の調製: Brown らの方法に準じて合成した. ⁶⁹⁾ ベンゼンで水分 を共沸除去した乾燥 β-CyD 13 g を無水ピリジン 100 mL に溶解後, 室温で無水条 件下, 45 分間かけて p-トルエンスルホニルクロライド 1.8 g を加え, 18 時間攪拌した. 反応終了後, 反応溶液を減圧濃縮し, アセトン 100 mL を添加して析出した沈殿物 を濾取した. 得られた沈殿物を水から 3 回再結晶し, 白色結晶 (4.9 g, 収率 38%) を得た. FAB-Mass [M-H]^- m/z 1287.

デンドリマー (generation 2)/β-CyD conjugate の調製: デンドリマー 0.5 mL

(2.6x10^-5 mol) を試験管エバポレーターに加えて減圧下メタノールを完全に留去した.

その後, トシル化 β-CyD 30 mg および DMSO 0.5 mL を加えて軽く混和し, 試験管 内を窒素置換後, 油浴中, 60 °C で 24 時間攪拌した. 以後の操作は, デンドリマー (G2)/α-CyD conjugate 調製時と同様である (収率 24 %). ¹H NMR (500 MHz, D₂O) δ (ppm from TMS), 4.96 (H1, β-CyD), 3.93-3.67 (H3, H5, H6, β-CyD), 3.59-3.40 (H2, H4, β-CyD), 3.34-3.08 (dendrimer methylene), 3.08-2.96 (dendrimer methylene), 2.96-2.62 (dendrimer methylene), 2.62-2.44 (dendrimer methylene), 2.44-2.22

- 71 -  (dendrimer methylene).

ナフタレンスルホニル化 γ-CyD の調製: Melton らの方法に準じて合成した. ⁶⁸⁾ ベンゼンで水分を共沸除去した乾燥 γ-CyD 15 g を無水ピリジン 200 mL に溶解後, 5 °C 以下に冷却, 攪拌しながらβ-ナフタレンスルホニルクロライド 3 g を加え, 室温 で 5 時間攪拌した. 水 (約 100 mL) を注ぎ込んで反応を停止させた後, 反応溶 液を減圧濃縮し, アセトン 500 mL を添加して析出した沈殿物を濾取した. 沈殿物 は吸着クロマトグラフィーで分離, 精製した. (多孔性ポリスチレン樹脂 (DIAION^® HP-20); 溶 離 液:メタノー ル/水=0:100 v/v ? 100:0 v/v; 3.62 g, 収 率 24.1%).

FAB-Mass [M-H]^- m/z 1486.

デンドリマー/γ-CyD conjugate の調製: デンドリマー 0.5 mL (2.6x10^-5 mol) を試 験管エバポレーターに加えて減圧下メタノールを完全に留去した. その後, ナフタレ ンスルホニル化 γ-CyD 35 mg および DMSO 0.5 mL を加えて軽く混和し, 試験管 内を窒素置換後, 油浴中, 60 °C で 24 時間攪拌した. 以後の操作は, デンドリマー (G2)/α-CyD conjugate 調製時と同様である (収率 29 %). ¹H NMR (500 MHz, D2O) δ (ppm from TMS) 5.29 and 5.00 (H1, γ-CyD), 3.91-3.60 (H3, H5, H6, γ-CyD), 3.60-3.39 (H2, H4, γ-CyD), 3.39-3.05 (dendrimer methylene), 3.05-2.97 (dendrimer methylene), 2.97-2.57 (dendrimer methylene), 2.57-2.39 (dendrimer methylene).

デンドリマー (generation 3, 4)/α-CyD conjugate の調製: デンドリマー 0.5 mL あ るいは 1 mL (2.6x10^-5 mol) を試験管エバポレーターに加えて減圧下メタノールを完 全に留去した. その後, トシル化 α-CyD 25 mg および DMSO 0.5 mL を加えて軽 く混和し, 試験管内を窒素置換後, 油浴中, 60 °Cで 24 時間攪拌した. 以後の操作 は, デンドリマー (G2)/α-CyD conjugate 調製時と同様である. α-CDE Conjugate (G3) (収率 15 %): ¹H NMR (500 MHz, D2O) δ (ppm from TMS) 4.93 (H1, α-CyD), 3.85-3.74 (H3, H5, H6, α-CyD), 3.53-3.38 (H2, H4, α-CyD), 3.38-3.13 (dendrimer

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methylene), 3.10-2.80 (dendrimer methylene), 2.80-2.54 (dendrimer methylene), 2.54-2.38 (dendrimer methylene), 2.38-2.30 (dendrimer methylene).? α-CDE Conjugate (G4) (収率 12 %): ¹H NMR (500 MHz, D2O) δ (ppm from TMS) 4.92 (H1, α-CyD), 3.86-3.72 (H3, H5, H6, α-CyD), 3.52-3.36 (H2, H4, α-CyD), 3.36-3.12 (dendrimer methylene), 3.08-3.02 (dendrimer methylene), 2.95-2.49 (dendrimer methylene), 2.33-2.15 (dendrimer methylene).

置換度の異なるα-シクロデキストリン/デンドリマー (G3) 結合体の調製

デンドリマー 0.5 mL (2.6 x 10^-5 mol) を試験管エバポレーターに加えて減圧下メタ ノールを完全に留去した. その後, トシル化 α-CyD を加え，(DS 1.1, 25 mg (2.6 x 10^-5 mol); DS 2.4, 100 mg (1.0 x 10^-4 mol); DS 5.4, 200 mg (2.0 x 10^-4 mol)) 軽く混和 し，試験管内を窒素置換後，油浴中，60 ℃で 24 時間攪拌した．以後の操作は, α-CDE conjugate (G2) 調製時と同様である. α-CDE conjugate (DS 1.1): 収量15%;

1H-NMR (500 MHz, D2O) δ (ppm from TMS) 4.95 (H1, α-CyD), 3.90-3.65 (H3, H5, H6, α-CyD), 3.59-3.46 (H2, H4, α-CyD), 3.38-3.15 (dendrimer methylene), 3.05-2.91 (dendrimer methylene), 2.95-2.60 (dendrimer methylene), 2.60-2.42 (dendrimer methylene), 2.20-2.18 (dendrimer methylene). α-CDE conjugate (DS 2.4): 収量 18%; ¹H-NMR (500 MHz, D2O) δ (ppm from TMS) 4.94 (H1, α-CyD), 3.86-3.74 (H3, H5, H6, α-CyD), 3.53-3.47 (H2, H4, α-CyD), 3.27-3.13 (dendrimer methylene), 3.05-2.81 (dendrimer methylene), 2.72-2.51 (dendrimer methylene), 2.36-2.31 (dendrimer methylene). α-CDE conjugate (DS 5.4): 収量 23%; ¹H-NMR (500 MHz, D2O) δ (ppm from TMS) 5.30-4.96 (H1, α-CyD), 3.88-3.75 (H3, H5, H6, α-CyD), 3.55-3.47 (H2, H4, α-CyD), 3.40-3.12 (dendrimer methylene), 3.07-2.98 (dendrimer methylene), 2.74-2.54 (dendrimer methylene), 2.36-2.33 (dendrimer methylene).

- 73 -  3. 物性測定

NMR スペクトル測定：¹H-及び ¹³C-NMR は, 日本電子 (株) 製 α-500 FT-NMR スペクトロメータを用いて 25 °C で測定した. 溶媒はDMSO-d6 あるいは D₂O を用 い, サンプルの濃度は 10 mM とした. ¹H- ならびに¹³C-シグナルの化学シフトは, DMSO あるいは H₂O のピークを用いてテトラメチルシラン (tetramethylsilane, TMS) からの低磁場シフトとして表した.

FAB マススペクトル測定: 日本電子製 JMS-DX 303 質量分析計を用いて室温で

測定した. マトリックスには DMSO:ジエタノールアミン (1:1) 混合溶媒を用いた.

粒子径測定: Tris- EDTA Solution (TE) に溶解したプラスミド DNA 4 µL (1 µg/µL) を Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) 1.5 mL に加え， 10 秒間ボルテックス後，

HBSSに溶解した各種ベクター 100 µL を加え， 15 分間室温でインキュベートした．

測定は Beckman 製 Coulter N4 Plus を用い，測定角度 62.6 °, 測定温度 25 °C で102 秒間測定を行った.

ζ-電位測定: TE に溶解したプラスミド DNA 4 µL (1 µg/µL) を HBSS 1.5 mL に加 え， 10 秒間ボルテックス後， HBSS に溶解した各種ベクター 100 µL を加え， 10 秒間ボルテックス後, 15 分間室温でインキュベートした． 測定は大塚電子 (株) 製 ELS-800 を用い，測定温度 25 °C で行った.