遺伝子導入用ベクターとしての

(1)

遺伝子導入用ベクターとしての

シクロデキストリン / デンドリマー結合体の分子設計と機能性評価

2003

木原史博

Molecular Design and Evaluation of Cyclodextrin/Dendrimer Conjugates as Non-viral

Vectors for Gene Transfer

Fumihiro Kihara

(2)

Molecular Design and Evaluation of Cyclodextrin/Dendrimer Conjugates as Non-viral Vectors for Gene Transfer

Fumihiro Kihara

Gene therapy may be one of the most important medications for the next generation.

However, the establishment of an efficient and safe method for delivering exogenous gene into cells is still in the formative stage. The following four methods are currently available for gene transfer, i.e. viral vector, non-viral vector and physical methods as well as naked plasmid DNA (pDNA) method without vectors. Although non-viral vectors are not as effective as viral vectors, they do have certain advantages: they are easily prepared, are not limited by gene size, and can be vested through structural modification with the ability to carry pDNA to the target cells. For these reasons, improvement in gene transfer activity of non-viral vectors is of utmost importance. Thereby the following four barriers should be overcome for improvement of transfection efficiency: an entrance to the cell, a release from the endosomes and an entrance to the nucleus.

Cyclodextrins (CyDs) are known to form inclusion complexes with a variety of guest molecules in solution and in solid state. Further, CyDs at higher concentrations decrease the integrity of cell membranes through inclusion of some membrane components, leading to an increase in the permeability of impermeable drugs. This membrane-disruptive property of CyDs may be useful for enhancing the gene transfer activity of various non-viral vectors such as polyamines and polyamidoamine dendrimers.

In this study, we prepared CyD derivatives bound covalently to Starburst

^®

polyamidoamine dendrimer, one of the representative polycationic non-viral vector, and investigated their gene transfer activity in vitro and in vivo . The structure of CyD/dendrimer (CDE) conjugates was optimized by chemical modifications to obtain higher gene transfer efficiency, as follows:

1. Effect of CyD cavity size ( α-, β- and γ-CyDs), 2. Effect of generation of the dendrimer (generations 2, 3 and 4), 3. Effect of number of CyD molecules (degree of substitution 1.1, 2.4, 5.4) to be incorporated in the dendrimer. The results were summarized as follows:

1-1. The α -, β- and γ-CyD conjugates with dendrimer (generation2 (G2)) in a molar ratio of 1:1 were prepared, and the complexation of these conjugates with pDNA was studied by agarose gel electrophoresis. The intensity of the band derived from DNA after electrophoresis decreased with increasing the charge ratio of CDE conjugate/DNA complexes, and the band disappeared at the charge ratio of 1:1. The similar patterns were observed for the α-, β- and γ-CDE conjugate/DNA complexes and the dendrimer/DNA complex, suggesting that these CDE conjugates formed the complexes with pDNA in a similar manner to dendrimer.

1-2. The α -, β- and γ-CDE conjugates (G2) showed higher luciferase gene expression than

the corresponding dendrimer alone in NIH3T3 and RAW264.7 cells. Among three

(3)

conjugates, the α -CDE conjugate had the highest transfer efficiency, whose activity was 100-times that of dendrimer alone and was superior to that of a commercial transfer agent, Lipofectin™.

2-1. The α -CyD conjugates with dendrimers of different generations (G2, G3 and G4) in a molar ratio of 1:1 were prepared to optimize the structure of the dendrimer residues for gene transfer activity. The complexation of these α-CDE conjugates with pDNA was confirmed by electrophoretic analysis. No differences in ζ -Potential and particle size were observed between these α -CDE conjugates (G2, G3 and G4) and between the conjugates and the corresponding dendrimers, suggesting α -CyD moiety in the conjugates has no influence to the complexation with pDNA.

2-2. The α-CDE conjugates with different generations of dendrimer (G2, G3 and G4) showed higher luciferase gene expression than the corresponding dendrimers in NIH3T3 and RAW264.7 cells. The expression efficiency of the α -CDE conjugate with generation 3 (G3) was higher than those of the G2 and G4 conjugates. No cytotoxicity in NIH3T3 and RAW264.7 cells was observed for these conjugates and dendrimers up to the charge ratio of 100/1 (vector/pDNA), but at higher charge ratios, the cytotoxicity increased in the order of the G2 < G3 < G4 conjugates.

3-1. The α -CyD conjugates of G3 dendrimer in different molar ratios of 1.1, 2.4 and 5.4 ( α -CyD/dendrimer, DS 1.1, 2.4 and 5.4) were prepared to optimize the number of α -CyD moiety. The complexation of these α-CDE conjugates with pDNA was confirmed by electrophoretic analysis. The α -CDE conjugates of DS 2.4 and 5.4 released a model dye, calcein, from liposomes whereas the conjugate of DS 1.1 did not release the dye, suggesting α-CyDs in DS 2.4 and 5.4 conjugates possess membrane-disruptive ability.

3-2. Luciferase gene expression in NIH3T3 and HepG2 cells augmented as the charge ratio of α -CDE conjugates/pDNA increased, and at higher charge ratios the activity of the α -CDE conjugate with DS 2.4 was highest among the three conjugate (DS 1.1, 2.4 and 5.4). After intravenous administration of pDNA complexes in mice, the α-CDE conjugate (DS 2.4) delivered pDNA more efficiently to spleen, liver, lung and kidney, compared with dendrimer and other α-CDE conjugates. In particular, the higher gene expression in spleen was observed 12h after the administration of the DS 2.4 conjugate.

In conclusion, the α -CDE conjugate (G3, DS 2.4) having generation 3 of dendrimer and

degree of substitution 2.4 of α -CyD is the best CDE conjugate among various conjugates

prepared in this study, showing notable gene transfer activity in vitro and in vivo with low

cytotoxicity. Consequently potential use of the α -CDE conjugate (G3, DS 2.4) could be

expected as a non-viral vector to deliver gene in vivo and these data may be useful for design

of CyD conjugates with other non- viral vectors.

(4)

A) Dendrimer (G3) B) α-CDE (G3)

Frontispiece 2. Confocal Laser Microscopic Images for the Distribution of FITC-labeled pDNA in NIH3T3 Cells 25 hr after Transfection of Dendrimer (G3)/pDNA (A) and α -CDE Conjugate (G3)/pDNA (B)

Scale bars represent 20 µ m.

Frontispiece 1. Confocal Laser Microscopic Images for the Distribution of FITC-labeled pDNA in NIH3T3 Cells 25 hr after Transfection

pDNA alone

With Dendrimer (200/1)

With α -CDE conjugate (200/1) With Dendrimer (5/1)

With α-CDE conjugate (5/1)

Scale bars represent 25 µ m.

The number in parentheses represents the charge ratio.

With TransFast™

FRONTISPIECE

(5)

目次

緒言

1

第 1 章

α-, β-, γ-

シクロデキストリンを利用した細胞への遺伝子導入と発現：

シクロデキストリンの空洞径の影響

7

第 1 節序

7

第 2 節デンドリマー

/CyD

結合体の調製と構造解析

8 /CyD

結合体とプラスミド

DNA

との相互作用

10 3-1

アガロースゲル電気泳動による検討

10 3-2

プラスミド

DNA

複合体の粒子径の検討

11 3-3 DNA

の酵素安定性に及ぼすデンドリマー

/CyD

結合体の影響

12 /CyD

結合体の細胞障害性の検討

14 /CyD

結合体による遺伝子導入効果の検討

16 5-1 Luciferase

遺伝子導入による遺伝子導入効果の検討

16 5-2

遺伝子発現の時間推移の検討

18 5-3

デンドリマー

/CyD

物理的混合物の遺伝子発現効果の検討

19

第 6 節プラスミド

DNA

の細胞会合に及ぼす

デンドリマー

/CyD

結合体の影響

21

第 7 節共焦点レーザー顕微鏡によるプラスミド

DNA

の

細胞内動態の検討

23

第 8 節小括

25

第 2 章

α -シクロデキストリン /デンドリマー結合体による細胞への

遺伝子導入と発現：デンドリマーのジェネレーションの影響

28

第 1 節序

28 /CyD

結合体の調製と構造解析

29

(6)

/CyD

DNA

との相互作用

30 3-1

30 3-2

粒子径の検討

31 3-3 ζ-電位の検討 32

3-4 DNA

の酵素抵抗性に及ぼすデンドリマー

/ α -CyD

結合体の影響 33 第 4 節 TNS を用いた包接能の検討

34 / α -CyD

35 /α -CyD

結合体の遺伝子導入効果の検討

36 6-1 Luciferase

による遺伝子導入効果の検討

36 6-2 Green fluorescence protein

による遺伝子導入効率の検討

38 6-3

血清存在下における遺伝子導入効果の検討

40 6-4

遺伝子発現時間の検討

41 6-5

デンドリマー

/ α -CyD

物理的混合物の遺伝子導入効果の検討

42

第 7 節プラスミド

DNA

の細胞会合に及ぼす

デンドリマー

/α-CyD

結合体の影響

43

第 8 節共焦点レーザー顕微鏡によるプラスミド

DNA

の

細胞内動態の検討

44

第 9 節小括

45

第 3 章

α-シクロデキストリン /デンドリマー結合体による遺伝子導入と発現：

α-CyD

の置換度の影響

48

第 1 節序

48

第 2 節

α-CyD

の置換度の異なるデンドリマー/α

-CyD

結合体の

調製と構造解析

49 /CyD

DNA

との相互作用

50 3-1

50

(7)

3-2

粒子径の検討

51

第 4 節カルセイン封入リポソームを用いた膜破壊効果の検討

52 / α -CyD

53 /α -CyD

結合体の遺伝子発現効果の検討

54 / α -CyD

結合体の細胞に対する

遺伝子発現効率の検討

56

第 8 節

In vivo

条件下における遺伝子発現効果の検討

58

第 9 節小括

60

総括

63

謝辞

67

実験の部

69

参考文献

82

(8)

本論文で使用した主な略語一覧表

ADA Adenosine deaminase

アデノシンデアミナーゼ

Amp

^r

Ampicilin resistant

アンピシリン耐性

CDE CyD/dendrimer conjugate CyD/デンドリマー共有結合体

conjugate

CMV Cytomegaro virus

サイトメガロウイルス

CyD Cyclodextrin

シクロデキストリン

dCTP Deoxy cytidine triphosphate

デオキシシチジン

3

リン酸

DDS Drug delivery system

薬物送達システム

DMEM Dulbecco's Modified Eagle medium

ダルベッコ変法イーグル培地

DMSO Dimethylsulfoxide

ジメチルスルホキシド

DNase DNA nuclease DNA

分解酵素

DS Degree of substitution

平均置換度

EDTA Disodium ethylenediaminetetraacetate

エチレンジアミン四酢酸

FAB Fast atom bombardment

高速電子衝撃

FCS Fetal calf serum

ウシ胎児血清

FITC Fluorescein isothiocyanate

フルオレセインイソチオシアネート

G Generation

GFP Green fluorescent protein

HBSS Hanks' balanced salt solution

ハンクス緩衝液

HEPES N-2-hydroxyethylpiperazinde-N'-ethanesulfonic acid

HIV Human immunodeficiency virus

ヒト免疫不全ウイルス

HJV Hemagglutinating virus of japan

センダイウイルス

Kan

^r

Kanamycin resistant

カナマイシン耐性

Luc Luciferase

ホタルルシフェラーゼ

MTT 3-[4, 5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyl tetrazolium bromide;Thiazolyl blue

NLS Nuclear localization signal

核移行シグナル

NMR Nuclear magnetic resonance

核磁気共鳴

PAMAM Polyamidoamine

ポリアミドアミン

pDNA Plasmid DNA

環状 DNA

RLU Relative light unit

相対発光量

Rluc Renilla luciferase

ウミシイタケルシフェラーゼ

RNAi RNA interference RNA

干渉

SDS Sodium dodecylsulfate

ドデシル硫酸ナトリウム

TBE Tris-borate EDTA

TE Tris-EDTA

トリス

-EDTA

TMS Tetramethylsilane

テトラメチルシラン

TNS 2-(p-Toluidinyl)naphthalene-6-sulfonate p-トルイジニルナフタレンスルホン

酸

X-gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- β -D-galactoside

X-SCID X-linked severe combined immunodeficiency X

連鎖重症複合免疫不全症

(9)

本論文は学術雑誌に掲載された次の論文を基礎とするものである.

(1) Enhancement of Gene Expression by Polyamidoamine Dendrimer Conjugates with

α-, β- and γ-Cyclodextrins

H. Arima, F. Kihara, F. Hirayama and K. Uekama:

Bioconjugate Chem., 12, 476-484 (2001)

(2) Effects of Structure of Polyamidoamine Dendrimer on Gene Transfer Efficiency of the Dendrimer Conjugate with α-Cyclodextrin

F. Kihara, H. Arima, T. Tsutsumi, F. Hirayama, and K. Uekama:

Bioconjugate Chem., 13, 1211-1219 (2002)

(3) In vitro and In vivo Gene Transfer by Optimized α -Cyclodextrin Conjugate with Polyamidoamine Dendrimer

F. Kihara, H. Arima, T. Tsutsumi, F. Hirayama, and K. Uekama:

Bioconjugate Chem., accepted for publication.

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

(17)

(18)

(19)

(20)

(21)

(22)

(23)

(24)

(25)

(26)

(27)

(28)

(29)

(30)

(31)

(32)

(33)

(34)

(35)

(36)

(37)

(38)

(39)

(40)

(41)

3‑3 c ‑

電位の検討

複合体の荷電状態は細胞への接着性や粒子自体の溶解度に影響することが知られている. そこで.調製した

DN

A/ベクター複合体のじ電位を測定した

F i g . 22

に示すように，各複合体の会電位は

+14. . . . . . . . +25 mV

であり，デンドリマーと

α‑CDEc o n j u g a t e s

聞に大きな差はみられなかった. これらの結果から，

α‑CyD

は複合体形成後の

DN

A/ベクター粒子のな電位に影響を与えないものと推察された.

30

〉三

20 :

何

. ー

d

z

. 。 ^早 2

^.

^a

¹⁰

人J

、

。。 ₅₀ ₁₀₀ ₁₅₀ ₂₀₀

Charge r a t i o (Vector/pDNA)

F i g . 2 2 . c ‑ P o t e n t i a l s of Dendrimers (G2 ， G3 ， G4)/pDNA and α‑CDE Conjugates (G2 ， G3 ， G4)/pDNA

ロ:

Dendrimer (G2) ・， ^: ^α

^ー

^CDEc ô ⁿ ^j û ^g â ^t ê ^(G2) ，

0: Dendrimer (G3) ・， ^:α‑CDEc ô ⁿ ^j û ^g â ^t ê ^(G3) ，

ム:

Dendrimer (G4)

，

A:α

ー

CDEc o n j u g a t e (G4)

，

+ : TransFasFM.

Each p o i n t r e p r e s e n t s t h e mean

土

S . E .o f 3 e x p e r i m e n t s .

つ ‑

qd

(42)

(43)

(44)

(45)

(46)

(47)

(48)

(49)

(50)

(51)

(52)

(53)

(54)

(55)

(56)

(57)

(58)

(59)

(60)

(61)

(62)

(63)

(64)

(65)

(66)

(67)

(68)

(69)

(70)

(71)

- 62 -

以上述べたように, デンドリマーを

G3

に固定し

, α -CyD

の置換度が異なる

3

種の

α-CDE conjugates (DS 1.1, 2.4, 5.4)

の中で,

α-CDE conjugate (DS 2.4)

が

in

vitro, in vivo

両条件下において遺伝子導入効率が最も優れることが明らかとなった.

非ウイルスベクターにおける遺伝子導入効率の改善方法としては, 前章でも述べたように, エンドソーム膜からの積極的な脱出が必要である

.

今回, α-CDE conjugates の置換度を増加させると遺伝子導入効率が増大したこと

,

また

α -CDE conjugates (DS 2.4, 5.4)

はリポソーム膜破壊能を有すること

,

さらに

,

ベクター/pDNA 複合体の物理的特性に関しては有意差が見られなかったことから

,

遺伝子発現促進効果は Fig. 43 に示すように, エンドソーム膜を破壊することにより

,

多くの pDNA が細胞質に移行することに起因するものと考えられる

. また, α-CDE conjugate (DS 2.4)

が最も優れる理由としては, DS 5.4 体の細胞障害性が増大したためと推察される

.

proteins mRNA

NC2H4N

N N

N N N N N N

NN NN N

N N N NN N N N N N

N NH 2 NH 2 NH2 NH²

NH

2

NH

2

NH 2 NH

2 NH NH

2

NH 2 NH 2 NH²

NH² NH NH2 2HN 2HN 2HN 2HN 2HN 2HN HN

2HN 2HN 2HN 2HN 2HN 2 HN 2HN HN HN (HO )

5

(HO

)5

(HO )5

NC2H4N

N N

N N N N N N

NN NN N

N N N NN N N N N N

NH

2

NH

2

NH 2 NH

2 NH NH

2

NH 2 NH 2 NH²

5 (HO ) 5

(HO

)5 (HO )5

(HO )5(HO )5

Endosome

Endosome disruption ability

・Liposome disruption ability

NC2H4N

N N

NN N N N N N N N NN

N N

N N N N N N N

N N N

NNH 2 NH 2 NH2 NH

2

NH

2

NH

2

NH 2 NH 2 NH 2 NH

2

NH²NH² NH² NH² NH2 NH2 2HN 2HN 2HN 2HN 2HN 2HN 2HN

2HN 2HN 2HN 2 HN 2HN 2HN

2

HN 2HN HN (HO )5 NC2H4N

N N

N N N N N N N

N N N

NNH 2 NH 2 NH2 NH

2

NH

2

NH

2

NH 2 NH 2 NH 2 NH

2

HN 2HN HN (HO )5

NC2H4N

N N

N N NN N N

NNN N N N N N N NN N

N N N

NH

2

NH

2

NH 2 NH 2 NH

2 NH

2

NH 2 NH²

NH² NH² NH2 NH2 2HN 2HN 2HN 2HN 2HN 2HN 2HN

2HN 2HN 2HN 2HN 2 HN 2HN

2HN 2HN HN (HO )5 NC2H4N

N N

N N NN N N

N N N

NH

2

NH

2

NH 2 NH 2 NH

2 NH

2

NH 2 NH²

2HN 2HN HN

(HO )5 NC2H4N

N N

NN N N N N N N

NNNN N

N N N NN N N N N N

N NH 2 NH2 NH2 NH²

NH

2

NH

2

NH 2 NH

2 NH NH²NH²

NH² NH2 NH2 NH NH2 2HN 2HN 2HN 2HN 2HN 2HN HN

2HN 2HN 2HN 2HN

2HN 2 HN 2HN HN HN (HO

)5

(HO )

5

(HO )5 NC2H4N

N N

NN N N N N N N

NNNN N

N N N NN N N N N N

N NH 2 NH2 NH2 NH²

NH

2

NH

2

NH 2 NH

2 NH NH²NH²

2HN 2HN 2HN 2HN

)5 (HO )5

(HO )

5 (HO )

5

(HO )5(HO )5

Vector/pDNA Complex

Gene expression (in vitro, in vivo) Physical properties

Cytotoxicity

・Electrophoresis

・Perticle size

DS 1.1 = DS 2.4 = DS 5.4

DS 1.1 = DS 2.4 < DS 5.4

DS 1.1 << DS 2.4 = DS 5.4

DS 1.1 < DS 5.4 < DS 2.4

proteins mRNA

NC2H4N

N N

N N N N N N

NN NN N

N N N NN N N N N N

NH

2

NH

2

NH 2 NH

2 NH NH

2

NH 2 NH 2 NH²

5

(HO

)5

(HO )5

NC2H4N

N N

N N N N N N

NN NN N

N N N NN N N N N N

NH

2

NH

2

NH 2 NH

2 NH NH

2

NH 2 NH 2 NH²

5 (HO ) 5

(HO

)5 (HO )5

(HO )5(HO )5

Endosome

Endosome disruption ability

・Liposome disruption ability

NC2H4N

N N

N N N N N N N

N N N

NNH 2 NH 2 NH2 NH

2

NH

2

NH

2

NH 2 NH 2 NH 2 NH

2

HN 2HN HN (HO )5 NC2H4N

N N

N N N N N N N

N N N

NNH 2 NH 2 NH2 NH

2

NH

2

NH

2

NH 2 NH 2 NH 2 NH

2

HN 2HN HN (HO )5

NC2H4N

N N

N N NN N N

N N N

NH

2

NH

2

NH 2 NH 2 NH

2 NH

2

NH 2 NH²

2HN 2HN HN (HO )5 NC2H4N

N N

N N NN N N

N N N

NH

2

NH

2

NH 2 NH 2 NH

2 NH

2

NH 2 NH²

2HN 2HN HN

(HO )5 NC2H4N

N N

NN N N N N N N

NNNN N

N N N NN N N N N N

N NH 2 NH2 NH2 NH²

NH

2

NH

2

NH 2 NH

2 NH NH²NH²

2HN 2HN 2HN 2HN

)5

(HO

)5

(HO )5 NC2H4N

N N

NN N N N N N N

NNNN N

N N N NN N N N N N

N NH 2 NH2 NH2 NH²

NH

2

NH

2

NH 2 NH

2 NH NH²NH²

2HN 2HN 2HN 2HN

)5 (HO )5

(HO )

5 (HO )

5

(HO )5(HO )5

Vector/pDNA Complex

Gene expression (in vitro, in vivo) Physical properties

Cytotoxicity

・Electrophoresis

・Perticle size

DS 1.1 = DS 2.4 = DS 5.4

DS 1.1 = DS 2.4 < DS 5.4

DS 1.1 << DS 2.4 = DS 5.4

DS 1.1 < DS 5.4 < DS 2.4

Fig. 43. Proposed Scheme of Gene Expression by α-CDE Conjugates (G3)

(72)

- 63 -

総括

本研究では, 非ウイルスベクターの遺伝子発現の改善を目的として

,

スターバーストポリアミドアミンデンドリマーと

CyD

結合体 (CDE conjugate) を調製し

,

それらの遺伝子導入用ベクターとしての有用性を評価した. まず, CyD 空洞径の異なる

α -, β-, γ-CyDs

とデンドリマー (G2) との結合体を調製し

,

それらの物理的特性や遺伝子導入効率について検討した. 次に, generation の異なるデンドリマーと

α -CyD

との結合体を調製し

,

それらの遺伝子導入効果を比較検討した. さらに, デンドリマー

/α-CyD

結合体の遺伝子発現効率の向上, ならびに

α-CyD

の遺伝子発現促進機

構の解明を企図して

,

デンドリマー

(G3)

に

α -CyD

を複数個導入した結合体を調製し

,

それらの遺伝子導入効果について検討した. 以下に本研究で得られた知見を総括する

.

1) p-トルエンスルホニル化 α -

及び

β-CyDs

あるいはナフタレンスルホニル化

γ-CyD

とデンドリマーを反応させて

,

デンドリマー/CyD 結合体 (CDE conjugates) を調製した. ¹

H-NMR

スペクトルや薄層クロマトグラフィーによる検討から

, CDE conjugates

は CyDs とデンドリマーがモル比 1:1 で結合していることを確認した.

2) pDNA

と

CDE conjugates

複合体形成に及ぼす混合比の影響をアガロース電気

泳動により検討した. pDNA バンドはベクターの添加量の増大, すなわち正のチャージ比 (ベクター/pDNA) の増加に伴い薄くなり

,

いずれのベクターもチャージ比 1/1 で pDNA バンドは消失した. これらの結果から

,

デンドリマーは pDNA と静電的相互作用により複合体を形成し

,

チャージ比 1/1 で複合体の正味の電荷が正に傾くことが示唆された

. また, CDE conjugates

はデンドリマーと類似した様

式で

pDNA

と複合体を形成するものと推察された

.

3) CDE conjugate

の遺伝子発現効果はデンドリマー単独よりも大きく，特に

α-CDE

conjugate

が最も高い遺伝子発現効果を示した.

α -CDE conjugate

はチャージ比

遺伝子導入用ベクターとしての