セレンテラジンおよび新規セレンテラジン類縁体の生物発光反応評価

65

66 図3-19 RlucおよびRluc変異体を用いた42a–dおよび2の相対発光反応速度 (rel. Vmax)

続いて42a–dおよび2の発光効率を調べるために、相対発光量子収率(Φbl)を測定した(表3-8および図 3-20)。Φbl値はHEPES緩衝液中における42a–dおよび2のL-L反応の発光スペクトルを、AB-1850分光 光度計を用いて反応が完了するまで測定し、分子数当たりの発光スペクトルの面積比から 42a および Rlucの値を1.0とした際の相対比で表した。セレンテラジン類縁体42a–dのΦbl値は、異なるルシフェ ラーゼであっても42b、42a、42c、42dの順に高い傾向にあった。さらに、ルシフェラーゼ間では異な るΦbl値を示し、Rluc8.6_535 > Rluc8 ≈ Rluc8.6_535 > Rlucの順に高い傾向を示した。Rluc変異体はRluc の活性中心付近に変異を導入している、活性中心の極性等の分子環境が変化し発光量子収率に影響を与 えたものと考えられる。また、セレンテラジン類縁体42a–dのΦbl値は対応する中性セレンテラミド55a–

d の DMSO 中における蛍光量子収率(Φfl)と相関があることを示し、その大きさによって増減する傾向を 示した。Φbl値は、反応生成収率(Φr)、一重項励起生成効率(Φs)および蛍光量子収率(Φfl)の積で求まる。酵 素反応中における蛍光性がDMSO中の中性セレンテラミド55a–dのΦfl値と同等であると仮定した場合、

Φr値とΦs値の積を、Φbl値をΦfl値で除して計算した(表3-9)。セレンテラジン類縁体42a–dのΦr値とΦs

値の積は、ルシフェラーゼの種類に関わらず、42b、42c、42a、42dの順に高い傾向を示した。これはセ レンテラジン類縁体42bの反応生成収率(Φr)と一重項励起生成効率(Φs)の一方または両方が高いことを意

67 味しており、酵素内で最も42bが酵素反応性あるいは励起状態での一重項励起状態への移行性が高いも のと推測される。

表3-8 RlucおよびRluc変異体を用いた42a–dおよび2の相対発光量子収率(rel. Φbl)および中性セレンテ ラミド55a–dの蛍光量子収率(Φfl)

Compound rel. Φbl a (%SE^b) Φfl c

Rluc Rluc8 Rluc8.6_535 Rluc8.6_547

42a 0.20 (7%) 0.39 (10%) 1.3 (14%) 0.89 (11%) 0.34

42b 0.34 (14%) 0.80 (13%) 1.8 (5%) 0.75 (18%) 0.39

42c 0.15 (34%) 0.38 (29%) 0.95 (8%) 0.27 (17%) 0.25

42d 0.10 (2%) 0.19 (10%) 0.48 (8%) 0.070 (8%) 0.16

2 1.0 (14%) 1.1 (8%) 0.34 (5%) 0.37 (4%) 0.18

a 2およびRlucの値を1.0とした際の相対発光量子収率(rel. Φbl値) ^b標準誤差パーセンテージ ^c 対応する 中性セレンテラミド55a–dのDMSO中における蛍光量子収率

図3-20 RlucおよびRluc変異体を用いた42a–dおよび2の相対発光量子収率 (rel. Φbl)

68 表3-9 DMSO中の蛍光量子収率(Φfl)から求めたRlucおよびRluc変異体と42a–dの反応生成収率(Φr)と 一重項励起生成効率(Φs)の積および中性セレンテラミド55a–dの蛍光量子収率(Φfl)

Compound rel. Φr x Φs a (%SE^b) Φfl c

Rluc Rluc8 Rluc8.6_535 Rluc8.6_547

42a 1.0 (7%) 1.9 (10%) 6.4 (14%) 4.4 (11%) 0.34

42b 2.6 (14%) 6.1 (13%) 14 (5%) 5.8 (18%) 0.39

42c 1.8 (34%) 4.5 (29%) 11 (8%) 3.3 (17%) 0.25

42d 1.0 (2%) 2.0 (10%) 5.1 (8%) 0.74 (8%) 0.16

a 42aおよびRlucの値を1.0とした際の反応生成収率(Φr)と一重項励起生成効率(Φs)の積(Φr x Φs) ^b標準誤 差パーセンテージ ^c 対応する中性セレンテラミド55a–dのDMSO中における蛍光量子収率

さらに、セレンテラジン類縁体42a–dおよびセレンテラジン2の相対酵素反応速度定数(rel. kcat)を求 めた(表3-10および図3-20)。Rel. kcat値はrel. Vmax値をrel. Φbl値で除して算出し、42aおよびRlucの値 を1.0とした際の相対比で表した。Rlucとセレンテラジン類縁体42a–cの組み合わせにおけるRel. kcat値 は、セレンテラジン2のRel. kcat値と同等の値を示した。これは、天然型のRlucルシフェラーゼは酵素 認識の自由度が高く、多少の分子サイズの異なるセレンテラジン類縁体においても酵素認識できるもの と推察される。Rluc8とセレンテラジン類縁体42a、42bとセレンテラジン2の組み合わせにおけるrel.

kcat値は、Rlucとセレンテラジン2の組み合わせの値と同等であり、42c、42dについては分子サイズが 大きくなるにつれてkcat値が低下した。Rluc8ルシフェラーゼの変異によりセレンテラジン類縁体の酵素 認識が低下したためと考えられる。さらに、Rluc8.6_535およびRluc8.6_547とセレンテラジン類縁体42a–

dのkcat値はセレテンラジン2の組み合わせより大きく低下した。これは、Rluc8ルシフェラーゼ変異体

であるRluc8.6_535およびRluc8.6_547がセレンテラジン2に対して最適化されており、Rluc8よりもさ

らにセレンテラジン類縁体への酵素認識が低下したためと考えられる。また、Rluc8.6_535およびセレン テラジン類縁体との組み合わせは、他のRlucルシフェラーゼ変異体との組み合わせと同程度高い kcat値 を示す。Rluc8.6_535およびセレテンラジン2のkcat値は１桁高く、Rluc8.6_535が高い酵素反応速度を持 つルシフェラーゼ変異体であると推測できる。そのため、Rluc8.6_535とセレンテラジン類縁体42a–dは セレテンラジン2のkcat値よりも低下するものの、他のルシフェラーゼと同等の高いkcat値を示したと考 えられる。

69 表3-10 RlucおよびRluc変異体を用いた42a–dおよび2の相対酵素反応速度定数 (rel. Kcat)

Compound rel. kcata (%SE^b)

Rluc Rluc8 Rluc8.6_535 Rluc8.6_547

42a 0.75 (8%) 1.4 (12%) 1.2 (15%) 0.050 (11%)

42b 1.1 (15%) 0.47 (15%) 1.6 (6%) 0.035 (18%)

42c 0.78 (36%) 0.15 (30%) 0.37 (8%) 0.011 (17%)

42d 0.083 (6%) 0.077 (12%) 0.15 (12%) 0.040 (9%)

2 1.0 (14%) 0.58 (8%) 11 (5%) 1.3 (5%)

a 42aおよびRlucの値を1.0とした際の相対酵素反応速度定数(rel. Kcat値) ^b標準誤差パーセンテージ

図3-21 RlucおよびRluc変異体を用いた42a–dおよび2の相対酵素反応速度定数(rel. Kcat)

70