度、毒性を評価することである。
Ⅲ- 3 . 実験方法と材料
Ⅲ- 3-1. 歯科用コンポジットレジン
歯科充填用コンポジットレジンであるSOLARE (GC, Tokyo, Japan)を使用した。
（以下CRとする）。
Ⅲ- 3-2. 試料作製
凍結乾燥したTp をCRに添加し、テフロンモールド使用にてISO 7489 に基
づき直径3 mm×高さ6 mmの円柱に成型し光照射にて十分に硬化させた。Tp を
含有しないレジン試料をコントロール試料とした。
（第1章、第2章 実験方法と材料 参照）
Ⅲ- 4. 評価項目
Ⅲ- 4-1. リゾチーム結合試験
CRに凍結乾燥したTp を1wt%、3wt%で加え光照射にて硬化させた。硬化した
試料を800 µg/mlのリゾチーム溶液1 ml中に入れ、恒温槽 (25℃) にて24時間浸
漬しTp にリゾチームを結合させ、リゾチーム溶液の吸光度測定 (OD280) を行っ た。リゾチーム溶液の吸光度の減少からリゾチーム結合量を算定した。Tpを含 有しないレジン試料をコントロールとした。
Ⅲ- 4-2. 抗菌試験
前記のリゾチームを結合させたCR (以下、リゾチーム結合CR) をBHI液体培地
にて12時間前培養したS. mutans菌液1 ml中に浸漬し、37℃、24時間・48時間 インキュベート [5% CO2（v/v）] した。インキュベート後に菌液の濁度測定
(OD600) と生菌コロニー数をカウント (CFU, colony forming unit）した。PBS 1 ml 中に浸漬しリゾチームを結合させていないCRをコントロールとした。
Ⅲ- 4-3. 強度試験
1wt%及び3wt% Tp を含有したCR試料を光照射にて硬化させた後、蒸留水中
に24時間浸漬し、引張圧縮試験機（SV-301, Shimazu, Kyoto, Japan）にてクロス ヘッドスピード1 mm/minで圧縮破壊試験と引張り強度試験を行った。Tp を含 有しないレジン試料をコントロールとした。
Ⅲ- 4-4. 細胞毒性試験
細胞毒性試験はThe methylterazolium test (以下、MTT test とする) に従って行
った (Yang Y et al. 2002)。 CRに凍結乾燥したTpを0wt%、1wt%、3wt%で加え光 照射にて硬化させた。これらを70%エタノールとPBSで洗った。試料を24穴プ レートに2 mlのDulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM) を入れ、37℃、3日間
インキュベート [5% CO2（v/v）] した溶出液を調製し、MTT test に用いる培 養液とした。表面のボリューム率を 0.541cm2/mlとしISO規格 (0.5~6.0 cm2/ml)
(Wataha JC et al. 1999) に従った。Balb/c 3T3 mouse fibroblast cell (1×104個) を96 穴プレートにて10% fetal bovine serum (FBS) と100 U/ml penicillinを含む100 µl のDMEMで37℃、24時間インキュベート [5% CO2（v/v）] してMTT testに用い た。各wellから培養液を吸引し、前述の各溶出液を 0%, 40%, 80% 含む培養液 Eluate 0% (DMEM 100 µlのみ)、Eluate 40% (DMEM 60 µlに溶出液40 µlを加えた もの)、Eluate 80% (DMEM 20 µlに溶出液80 µlを加えたもの) を調製し3,7日間培 養によるMTT testを行った。培養後それぞれのwellにCell Counting Kit-8溶液を
10 µlずつ添加しCO2インキュベータ内で1〜4時間呈色反応を行った。呈色反応
後wellそれぞれの上清を 96 穴プレートに移し替え、オートプレートリーダー (ImmunoMini, Inter Med, Japan) を用い吸光度測定 (OD450) を行った。
Ⅲ- 4-5. 統計
全てのデータは ANOVA とシェッフェ多重比較検定法を用い解析し、p<0.05 を有意差とした。
Ⅲ- 5. 結果
Ⅲ- 5-1 . リゾチーム結合試験
Fig.15-(a) はTp 含有CR試料をリゾチーム溶液に浸漬し、インキュベートした
後のリゾチーム溶液の吸光度を示す。吸光度測定において、OD280がそれぞれ
controlは1.90 ± 0.01、1wt%は1.83 ± 0.02、3wt%は1.83 ± 0.03 を示しTp 含有CR 試料はcontrolとの間に有意差を認めた (p<0.05)。Fig.15-(b) はTp 含有CR 試料の リゾチーム結合量を示す。結合量が3wt% は42.1 ± 9.8 µg、1wt%は36.9 ± 7.5 µg、
controlは14.6 ± 3.8 µg を示し、Tp 含有CR 試料はcontrolとの間に有意差を認め た (p<0.05)。このことによりCRへのTpの含有率が高いほどより多くのリゾチー ムがCRに結合することがわかった。
Ⅲ- 5-2. 抗菌試験
Fig.16-(a),(b) はリゾチーム溶液に浸漬したCR試料と浸漬していないCR試料
の抗菌活性をOD600で測定した結果を示す。24時間インキュベート条件の(a)につ いて、OD600は1wt% in PBSが0.750 ±0.0054、1wt% in Lyzが0.690 ± 0.0112、3wt%
in PBSが0.752 ± 0.0107、3wt% in Lyzが0.679 ± 0.0036 を示した。また48時間イ ンキュベート条件の(b)について、OD600は1wt% in PBSが0.590 ± 0.0151、 1wt% in Lyz が0.569 ± 0.0038、3wt% in PBSが0.589 ± 0.0141、3wt% in Lyz が0.546 ± 0.0072を示し、いずれも1wt% in PBSと1wt% in Lyz 間、および3wt% in PBSと
3wt% in Lyz 間、1wt% in Lyzと3wt% in Lyz 間に有意差を認めた (p< 0.05)。
次にFig.16-(c),(d) はリゾチーム溶液に浸漬したCR試料と浸漬していないCR 試料の抗菌活性をCFUにて調べた結果である。24 時間インキュベート条件の(c)
について CFUは 1wt% in PBSが6.65×108 ± 4.0×107 CFU/ml、 1wt% in Lyz が 4.87×108 ± 7.7×107 CFU/ml、3wt% in PBS が6.32×108 ± 9.2×107 CFU/ml、3wt% in Lyz が3.50×108 ± 3.8×107 CFU/mlを示した。また48時間インキュベート条件の(d) について CFUは 1wt% in PBSが 1.46×108 ± 3.4×107 CFU/ml、1wt% in Lyz が 1.07×10 8 ± 1.5×107 CFU/ml、3wt% in PBSが1.52×108 ± 3.0×107 CFU/ml、3wt% in Lyz が0.73×108 ± 2.3×107 CFU/mlを示し、いずれも1wt% in PBSと1wt% in Lyz 間、
および3wt% in PBSと3wt% in Lyz 間、1wt% in Lyzと3wt% in Lyz 間に有意差を 認めた (p< 0.05)。以上よりCRへのTpの含有率が高いほどリゾチームの結合量が
多くS. mutansに対する抗菌性が高まることが確認できた。一方、PBSに浸漬した だけのCRはTpの含有率に関係なくS. mutansに対して抗菌性を示さなかった。
Ⅲ- 5-3. 強度試験
Fig.17は強度試験の結果を示す。強度試験においてTp含有レジン試料は圧縮
強度、引張り強度共にcontrolと比較して有意差を認めた (p<0.05)。
Ⅲ- 5-4. 細胞毒性試験
Fig.18は7日間における細胞毒性試験の結果を示す。controlと比較して0wt%、
1wt%、3wt%のEluate 40%、Eluate 80%どちらにおいても細胞毒性を示さなかっ
た。
また細胞組織像についても Eluate 0% と比べてどのレジン試料においても大 きな変化は見られなかった (Fig. 19)。
Ⅲ- 6. 考察
第3章にて用いたCRを第2章のGICと比較すると、リゾチームの結合試験、
抗菌試験、強度試験、細胞毒性試験、全ての結果 (Fig.15〜Fig.19) において大き な相違はなかった。これは、用いた材料が異なっていてもTp とリゾチームの結
合の仕方は変わらず、Tp とのリゾチームの結合部位は正電荷であるLys-1, Arg-5,
Lys-13, Arg-14, Arg-128であると考えられる。またリゾチームの抗菌活性部位で
ある Glu-35, Asp-52 は Tp の結合部位と反対側に存在し S. mutans に対しても GICs同様に抗菌性を示したと考えられる。
このように、CRに陽イオン交換樹脂を応用し唾液に含まれるリゾチームを陽 イオン交換樹脂に結合させ局所的に抗菌性蛋白質リゾチームの濃度を上げるこ とは、GICs同様にCR修復においてう蝕予防や治療に有益であると考えている。
(a)
(b)
Figure 15.
Tp含有CRのリゾチーム結合試験(a) リゾチームの吸光度 (OD280), (b) Tp含有CRのリゾチーム結合量 試料間の有意差を*で示す (p<0.05)
(a) 24hr
(b) 48hr
(c) 24hr
(d) 48hr
Figure 16.
Tp含有CRのS. mutansに対する抗菌試験(a) 24時間後の濁度測定, (b) 48時間後の濁度測定, (c) 24時間後の培養法, (d) 48 時間後の培養法
試料間の有意差を*で示す (p<0.05)
(a)
(b)
Figure 17.
Tp含有CRの強度試験 (a) 圧縮強度, (b) 引張り強度 試料間の有意差を*で示す (p<0.05)Figure 18.
細胞毒性試験 (7日間培養)(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
(g)
Figure 19.
Tp含有CR溶出液にて培養した線維芽細胞の細胞像 (7日間培養)(a) Eluate 0%, (b) Eluate 40% (Tp 0wt%), (c) Eluate 40% (Tp 1wt%), (d) Eluate 40%
(Tp 3wt%), (e) Eluate 80% (Tp 0wt%), (f) Eluate 80% (Tp 1wt%), (g) Eluate 80%(Tp 3wt%)
Ⅳ
.結論
これらの結果より、グラスアイオノマーセメントやコンポジットレジンの陽 イオン交換樹脂の含有率の増加によりリゾチームの結合量は増加し、それと共
にS. mutans に対する抗菌性も効果的に影響することが示唆された。細胞毒性に
ついては in vitro の条件下で陽イオン交換樹脂含有グラスアイオノマーセメン
トとコンポジットレジンは従来のものと比較して毒性を示さなかった。また強 度試験において、陽イオン交換樹脂含有グラスアイオノマーセメントおよびコ ンポジットレジンは口腔内において使用できる可能性が示唆された。
故に、グラスアイオノマーセメントとコンポジットレジンに陽イオン交換樹 脂を臨床的に応用することは、口腔内において局所的な抗菌性蛋白質の集中を 促し、う蝕の予防や治療に有用であると考えられる。
Ⅴ
.謝辞
本稿を終えるにあたり、御指導と御校閲を賜りました
九州大学大学院歯学研究院口腔機能修復学講座 寺田 善博 教授 九州大学大学院歯学研究院口腔機能修復学講座 永留 初實 先生 に深く感謝致します。また実験方法について御助言を賜りました 九州大学大学院歯学研究院口腔機能修復学講座 篠原 義憲 先生 はじめ教室員の皆様に心より御礼申し上げます。
Ⅵ
.参考文献
Abe Y, Ishii M, Takeuchi M, Ueshige M, Tanaka S, Akagawa Y. Effect of saliva on an
antimicrobial tissue conditioner containing silver-zeolite. Journal of oral rehabilitation 2004;31:568-73.
Arendorf TM, Walker DM. Denture stomatitis: a review. Journal of oral rehabilitation 1987;14:217-27.
Beyth N, Yudovin-Farber I, Bahir R, Domb AJ, Weiss EI. Antibacterial activity of dental composites containing quaternary ammonium polyethylenimine nanoparticles against Streptococcus mutans. Biomaterials 2006; 27: 3995-4002.
Boesman-Finkelstein M, Finkelstein RA. Sequential purification of lactoferrin, lysozyme and secretory immunoglobulin A from human milk. FEBS letters 1982; 144:
1-5.
Botelho MG. Inhibitory effects on selected oral bacteria of antibacterial agents incorporated in a glass ionomer cement. Caries research 2003;37:108-14.
Budtz-Jorgensen, E. Clinical aspects of Candida infection in denture wearers. Journal of the American Dental Association 1978;96:474-79.
Cheng Y, Sakai T, Moroi R, Nakagawa M, Sakai H, Ogata T, Terada Y. Self-cleaning
ability of a photocatalyst-containing denture base material. Dental materials journal 2008;27:179-86.
Christersson LA, Zambon JJ, Genco RJ. Dental bacterial plaques. Nature and role in periodontal disease. Journal of clinical periodontology 1991;18:441-6.
Eichner H. Protein composition of human saliva under rest and stimulation and its changes in salivary gland diseases. Fortschritte der Medizin 1977;95:1522-26.
Eichner H, Eichner V, Münzel M, Hochstrasser K. Simultaneous determination of lysozyme and IgA-content in human parotid saliva, compared with flow-rate and totalprotein-secretion during rest and stimulation (author's transl). Laryngologie, Rhinologie, Otologie 1975;54:554-65.
Glynn AA, Martin W, Adinolfi M.Levels of lysozyme in human foetuses and newborns.
Nature 1970; 225: 77-8.
Hamada S, Masuda N, Kotani S. Isolation and Serotyping of Streptococcus mutans from Teeth and Feces of Children. Journal of clinical microbiology 1980;11:314-18.
Hiro-O Ito. Infective endocarditis and dental procedures: evidence, pathogenesis, and prevention. The journal of medical investigation 2006;53: 189-98.
Hume WR, Mount GJ. In vitro studies on the potential for pulpal cytotoxicity of glass-ionomer cements. Journal of dental research 1988;67:915-18.
Ikeda S, Igarashi T, Goto N, Miyazaki T. Antibacterial effect of polycarboxylate cement combined with tannin-fluoride preparation (HY-agent) on oral bacteria. The Japanese Society for Dental Materials and Devices 2000;19:456-63.
Imazato S, Torii Y, Takatsuka T, Inoue K, Ebi N, Ebisu S. Bactericidal effect of dentin
primer containing antibacterial monomer methacryloyloxydodecylpyridinium bromide (MDPB) against bacteria in human carious dentin. Journal of oral rehabilitation 2001;28:314-19.
Ito H-O, Hirata M, Koga T. Hen egg-white lysozyme inhibits biological activities of lipopolysaccharides from periodontopathic bacteria. Journal of periodontal research 1997;32:295-99.
Iwamoto Y, Watanabe T, Tsunemitsu A, Fukui K, Moriyama T. Lysis of streptococci by lysozyme from human parotid saliva and sodium lauryl sulfate. Journal of dental research 1971; 50: 1688.
Jedrychowski JR, Caputo AA, Kerper S. Antibacterial and mechanical properties of restorative materials combined with chlorhexidines. Journal of oral rehabilitation 1983;10:373-81.
Jollès J, Jollès P. The primary chemical structure of human milk lysozyme:
establishment of a temporary formula. Helvetica chimica acta 1969;52:2671-75.
Kamaya T. Lytic action of lysozyme on Candida albicans. Mycopathologia et mycologia applicata 1970;42:197-207.
Kraus FW, Mestecky J. Immunohistochemical localization of amylase, lysozyme and immunoglobulins in the human parotid gland. Archives of oral biology 1971;16: 781-9.
Korsrud FR, Mestecky J. Characterization of epithelial elements in human major salivary glands by functional markers: localization of amylase, lactoferrin, lysozyme, secretory component, and secretory immunoglobulins by paired immunofluorescence staining.
The journal of histochemistry and cytochemistry 1982; 30: 657-66.
Listgarten MA, Levine S. Positive correlation between the proportions of subgingival spirochetes and motile bacteria and susceptibility of human subjects to periodontal deterioration. Journal of clinical periodontology 1981;8:122-38.
Lockhart SR, Joly S, Vargas K, Swails-Wenger J, Enger L, Soll DR. Natural defenses against candida colonization breakdown in the oral cavities of the elderly. Journal of
dental research 1999;78:857-68.
Mandel ID. The role of saliva in maintaining oral homeostasis. Journal of the American Dental Association 1989;119:298-304.
Mansson-Rahemtulla B, Baldone DC, Pruitt KM, Rahemtulla F. Effects of variations in pH and hypothiocyanite concentrations on S. mutans glucose metabolism. Journal of dental research 1987;66:486-91.
Marquis G, Montplaisir S, Garzon S, Strykowski H, Auger P. Fungitoxicity of muramidase: Ultra-structural damage to Candida albicans. Laboratory investigation 1982;46:627-36.
Matsuura T, Abe Y, Sato Y, Okamoto K, Ueshige M, Akagawa Y. Prolonged antimicrobial effect of tissue conditioners containing silver-zeolite. Journal of dentistry 1997;25:373-77.
McComb D, Ericson D. Antimicrobial action of new, proprietary lining cements.
Journal of dental research 1987; 66: 1025-8.
Moro I, Umemura S, Gargo SS, Mestecky J. Immunohistochemical distribution of immunoglobulins, lactoferrin, and lysozyme in human minor salivary glands. Journal of pathology 1984; 13: 97-104.
Nagadome H, Kawano K, Terada Y. Identification of the adsorbing site of lysozyme onto the hydroxyapatite surface using hydrogen exchange and 1H NMR. FEBS letters 1993; 317: 128-30.
Neu HC. The biochemical basis of antimicrobial and bacterial resistance. Bulletin of the New York Academy of Medicine 1987;63:295-317.
Nicholson JW, Braybrook JH, Wasson EA. The biocompatibility of glass-poly (alkenoate) glass-ionomer cements: a review. Journal of biomaterials science. Polymer edition 1991;2:277-85.
Okuda K, Ebihara Y. Relationships between chronic oral infectious diseases and
systemic diseases. The Bulletin of Tokyo Dental College 1998;39:165-74.
Palenik CJ, Behnen MJ, Setcos JC, Miller CH. Inhibition of microbial adherence and growth by various glass ionomers in vitro. Dental Materials 1992; 8: 16-20.
Pruitt KM, Mansson-Rahemtulla B, Tenovuo J. Detection of the hypothiocyanite (OSCN-) ion in human parotid saliva and the effect of pH on OSCN- generation in the salivary peroxidase antimicrobial system. Archives of oral biology 1983;28:517-25.
Reitamo S, Klockars M, Raeste AM. Immunohistochemical identification of lysozyme in the minor salivary glands of man. Archives of oral biology 1977; 22: 515-9.
Ribeiro J, Ericson D. In vitro antibacterial effect of chlorhexidine added to glass-ionomer cements. Scandinavian journal of dental research 1991;99:533-40.
Sanders BJ, Gregory RL, Moore K, Avery DR. Antibacterial and physical properties of resin modified glass-ionomers combined with chlorhexidine. Journal of oral rehabilitation 2002;29:553-58.
