抗 は100KΩ 前 後 で あ った 。 時 に2本 の 記 録 電 極 を 用 い て2点 間 の電 位 差 を 差 動 増 幅 で記 録 し
た 。
結 果 と考 察
電 極 先 端 を,標 本 表 面 に押 し付 け た 場 合,細 胞 内記 録 の もの に よ く似 た,振 幅 数 十mVの 正 方 向 のslow waveが 観 察 され た が,電 極 先 端 を 標 本表 面 か ら徐 々 に離 して い く と振 幅 は 小 さ く
な り,負 方 向 の鋭 い ス パ イ ク様 の電 位 と,そ れ に続 く,ゆ っ く り と した 時 間 経 過 の 陽電 位 が 得 られ る よ うに な った 。 負 方 向 の ス パ イ ク様 電 位 の 振 幅 は 標 本 と電 極 先 端 の距 離 に よ って 大 き く 変 化 した が,正 方 向 の ゆ っ く り した 電位 は あ ま り影 響 を 受 け な か った 。 しか し,こ の 正 方 向 の 電 位 は電 極 の 水 平 方 向 の移 動 に よ って そ の形 を 変 化 させ,標 本 の 局 所 的 な電 場 に 影 響 さ れ る も の と考 え られ た 。 特 に,輪 走 筋 の 方 向 に沿 った 移 動 に お い て,電 位 の 変 化 が 著 明 に認 め られ た 。 さ らに,細 胞 内 電 極 を 用 い てslow waveの 同 時 記 録 を 行 い 比 較 した 結 果,負 方 向 の ス パ イ ク様 電 位 は細 胞 膜 の 内 向 き電 流 を 反 映 して い る も の
と推 定 され た 。
次 に,電 極 先 端 を標 本 に軽 く押 し付 け た 状 態
で,電 極 内 溶 液 の灌 流 を 行 った 。細 胞 外 のK濃
度 を40mMに 増 す とslow waveは 消 失 し た
が,電 極 内 の み を 高 濃 度 のK溶 液 で灌 流 した場
合,正 方 向 の緩 徐 な電 位 が増 大 し,頻 度 は変 化
し なか った 。 外 液 へTEA(2‑10mM)を 与 えた
場 合 も この電 位 は増 大 した が,頻 度 は影 響 を 受 け な か った.電 極 内 へ のTEA投 与 に よ って は 負 方 向 の電 位 の増 大 が 見 られ た.ま た,外 液 お よ び電 極 内液 か らCaを 除 く と,slow waveの 発 生 頻 度 が減 少 し,10分 程 度 で ほ とん ど消 失 し た 。 この 状 態 で,電 極 の 内 側 のみ を2.4mMCa を含 ん だKrebsで 灌 流 す る と,負 方 向 の スパ イ ク様 電 位 の 回 復 が み られ た が,そ の頻 度 は 正 常 に比 べ て 低 い ま ま で あ った 。 先 端 の直 径 が100 μm未 満 の 細 い 電 極 を 用 い た 場 合 に は,こ の slow waveの 回 復 は み られ なか った 。
以 上 の結 果 よ り,陰 性 の ス パ イ ク様 の 電 位 は 細 胞 膜 の 内 向 きCa電 流 に よ る も の と考 え ら
れ,そ れ に続 き正 方 向 の 緩 徐 な電 位 は 外 向 きK 電 流 を反 映 して い る部 分 と近 くの 組 織 の 電 場 を 拾 っ て い る部 分 を 含 む も の と推 測 さ れ る.ま た, 正 常 な頻 度 のslow waveの 発 生 に は,数 百 μm 以 上 の大 き さの 筋 組 織 が 必要 で あ る可 能 性 が 考
え られ る.
文 献
Tomita, T. (1981). Electric activity (spike and slow waves) in gastrointestinal smooth mus-cles. In: Smooth Muscle, Edward Arnold Ltd. pp. 127-156.
モ ル モ ッ ト幽 門 括 約 部 に 対 す る カ テ コ ル ア ミ ン の ア ル フ ァ 作 用
名古 屋 大学 医学 部 第 一 生 理学 教 室 Syed. Md. Mohsin, 富 田 忠 雄
緒 言
幽 門 部 括 約 筋 は 交 感 神 経 に よ っ て 密 に 支 配 さ れ て い る が そ の 機 能 は ま だ 充 分 に 解 明 さ れ て い な い(Allescher et a1., 1989)。 イ ヌ に お け る in vivoの 実 験 を 基 に し て ア ド レ ナ リ ン 受 容 体 の 内,alpha‑receptorは 主 に コ リ ン 作 動 性 の 副 交 感 神 経 に 存 在 し,ア セ チ ル コ リ ン の 放 出 を 抑 え る こ と に よ っ て 括 約 筋 の 収 縮 に 対 し て 抑 制 的 に 働 く が,ア ド レ ナ リ ン 作 動 薬 の 平 滑 筋 へ の 直 接 作 用 は 明 確 で な く,beta‑receptorは 平 滑 筋 に 対 し て 直 接 的 な 抑 制 作 用 を も つ 以 外 に ア セ チ ル コ リ ン の 放 出 を 促 進 す る た め 括 約 筋 の 収 縮 を 強 め る と報 告 さ れ て い る?Allescher et al., 1989)。
本 実 験 で は モ ル モ ッ トの 摘 出 幽 門 部 の 試 料 を 用 い,こ の 部 の 平 滑 筋 に 対 す る カ テ コ ル ア ミ ン の 直 接 作 用 を 調 べ て み た 。
実 験 方 法
前 半 の 実 験 は 幽 門 括 約 筋 を 中 心 と し て 約2
cmの 試 料 を 取 り出 し,括 約 筋 か ら 胃側 の粘 膜 を 除 き,一 定 速 度 で 管 腔 内 を 胃側 か ら十 二 指 腸 へ 灌 流 した と きの 幽 門 前 庭 側 の 内 圧 お よ び長 軸 に沿 っ て発 生 す る張 力 を測 定 した 。 後 半 の 実 験 で は 幽 門部 付 近 の 輪 走 お よび 縦 走 方 向 の 小 さ い 筋 切 片 の機 械 的 活 動 に対 す る カ テ コル ア ミン の 反 応 を調 べ た 。
実 験 結 果
0.5‑3ml/minの 一 定 速 度 で 内 腔 を 灌 流 す る と持 続 的 な 内 圧 の 上 昇 と1分 間 に1回 程 度 の律 動 的 で不 規 則 な圧 の変 動 が み られ る 。 持 続 的 な 圧 は ほ ぼ 流 速 に比 例 して増 加 す る が,律 動 的 変 動 の方 は あ ま り大 き い変 化 を 示 さ な い 。 縦 方 向 の張 力 は 流 速 や 持 続 的 内 圧 と関 係 な く内 圧 の律 動 変 化 ど似 た よ うな 自発 性 活 動 を もつ 。 管 腔 内 に カ テ コ ル ア ミ ン を 与 え る と,adrenaline (Adr)お よびphenylephrine(Phe)は1‑20mM
で 濃 度 依 存 性 に律 動 性 内 圧 変 動 を抑 え,縦 向 き
の律 動 性 張 力 発 生 を増 強 す る。 これ らの 作 用 は
日 本 平 滑 筋 誌26(6)1990 469
alpha‑1受 容 体 の 遮 断 剤 で あ るprazosinで ほ ぼ 消 失 す る.Alpha‑2受 容 体 の 刺 激 剤 で あ る BHT‑920は 内 圧 変 動 に対 して 非 常 に 弱 い抑 制 作 用 しか 示 さ な い.Beta受 容 体 刺 激 剤 で あ る isoprenalineは 内圧 も張 力 も時 間経 過 の 長 い 弱
い抑 制 を 起 こす.
括 約 筋 付 近 の 平 滑 筋 は全 体 的 に持 続 性 に 発 生 す る筋 緊 張 は 弱 く,自 発 性 活 動 を もつ 点 で は 共 通 して い る が,adrenalineに 対 す る反 応 は部 位 に よ って,さ ら に 輪 走 筋 か 縦 走 筋 か に よ って 差 が み られ る。 輪 走 筋 で は 幽 門 前 庭 で主 に 自発 性 収 縮 の 抑 制 後 増 強,括 約 筋 に 隣 接 す る 胃 側 で ゆ っ く り した収 縮,括 約 筋 で 一 過 性 の収 縮 の 後 に抑 制,括 約 筋 に 隣接 した 十 二 指 腸 側 で抑 制 が み られ る.胃 の 縦 走 筋 も部 位 に よ って 異 な り,大 弯 側 で は 緊 張 性 の収 縮 が,小 弯 側 に近 づ く と低 頻 度 の 大 き い相 動 性 の 収 縮 が み られ る。 十 二 指 腸 の縦 走 筋 で は 抑 制 の み が 起 こ る。 これ らは 全 てprazosinの 前 処 置 で 消 失 す る が,pro‑
pranololで は影 響 を受 け な い.
考 察 な ら び に結 論
幽 門 括 約 筋 付 近 の 平 滑 筋 の カ テ コル ア ミン に 対 す る反 応 は か な り複 雑 で,必 ず し も輪 走 筋 で 興 奮 縦 走 筋 で抑 制 とい う消 化 管 で一般 的 にみ られ る よ うな反 応 で な く,狭 い部 位 に興 奮 と抑 制 が 複 雑 に交 錯 して い る.胃 内 容 物 の十 二 指 腸 へ の 輸 送 は 幽 門括 約 筋 に よ る抵 抗 と 胃側 の 輪 走 筋 の 収 縮 に よる 内圧 の 上 昇 の兼 ね 合 い に よ る と 考 え られ る が,こ れ らの 部 位 に お け る平 滑 筋 自 体 に 存 在 す る ア ド レ ナ リ ン 受 容 体 は 主 に alpha‑1型 で,全 体 と し て 内 容 物 の 通 過 を 促 進 す る よ うに働 い て い る もの と推 測 され る。
文 献
Allescher, H.D., Ahmad, S., Kostolanska, F., Kwan, C. Y. and Daniel, E.E. (1989). Modulation of Pyloric Motor activity via adrenergic rece-ptors. J. Pharmacol. Exp. Ther., 249: 652-659.
モ ル モ ッ ト胃お よ び 膀 胱 壁 平 滑 筋 に 対 す る 塩 化 ア ン モ ニ ウ ムの 作 用
名古屋大学医学部 第一生理学教室
松 本 俊 広,徳 納 博 幸,富 田 忠 雄
結 論
平 滑 筋 に お け る細 胞 内pHの 変 動 と収 縮 弛 緩 と の 関 係 は ま だ 充 分 明 ら か に さ れ て い な い 。 今 ま で,平 滑 筋 で の 細 胞 内pHは 主 に 細 胞 内 電 極 で 測 定 さ れ て い た が,最 近 単 離 し た 細 胞 で は pH感 受 性 を も つ 蛍 光 色 素(例 え ぼ2,7‑biscar‑
boxyethyl‑5(6)‑carboxy‑fluorescein,BCECF
な ど)を 用 い た 方 法 が 応 用 さ れ る よ うに な っ て き て い る(Siskind et a1., 1989)。 本 研 究 で は 使 い 易 いneutral redの 吸 光 ス ペ ク トル のpH依 存 性 を 利 用 し て(LaManna, 1987)モ ル モ ッ ト
胃 な ら び に 膀 胱 壁 平 滑 筋 の 摘 出 試 料 の 細 胞 内
pHと 収 縮 反 応 に 対 す る 塩 化 ア ン モ ニ ウ ム (NH4Cl)の 作 用 を 調 べ た 。NH4Clは 多 く の 細 胞 で 投 与 中 は 細 胞 内 を ア ル カ リ性 に,洗 い 流 し た 後 で は 酸 性 に す る こ と が 知 ら れ て い る(Roos
and Boron, 1981)。
実 験 方 法
モ ル モ ッ ト胃 底 部 お よ び 膀 胱 壁 体 部 の 平 滑 筋 を 用 い て 張 力 発 生 と,neutral red(30μM)を 30分 ほ ど 灌 流 し て 取 り込 ま せ た と ぎ の 組 織 の 吸 光 度 を 瞬 間 マ ル チ 分 光 光 度 計(MCPD‑100, 大 塚 電 子)で 測 定 し た.両 方 と も 粘 膜 は 完 全 に 除 去 し た.実 験 は35℃ で 行 な っ た 。 細 胞 内pH
は530nmの 波 長 の 吸 光 度 を477nmの も の で 割 っ て 求 め た.
実験 結 果 お よび 考 察
胃底 部 の輪 走 筋 は 自発 性 に持 続 性 の張 力 が 発 生 す るが,NH4Cl(20mM)を 与 え る と弛 緩 し, NH4Clの 存 在 下 で 僅 か に 回 復 す る傾 向 を 示 す.
20分 後 にNH4Clを 洗 い流 す と一 過 性 の 大 き い 収 縮 を 起 こす 。 と こ ろが,膀 胱 で は 自発 性 の相 動 性 の収 縮 が 見 られ,筋 の緊 張(持 続 性 の張 力 発 生)は 弱 い.NH4Clを 与 え る と1分 程 度 の遅 れ の後 に 自発 性 活 動 の増 加 が 現 れ,筋 の緊 張 が 増 して くる.NH4Clを 除 く と20‑30分 か か って 緩 や か に 回 復 す る.こ の よ うに 胃 と膀 胱 で は NH4Clに 対 す る機 械 的 な反 応 が逆 で あ る.
Neutral redを 取 り込 ませ た と きの 組 織 の 吸 収 ス ペ ク トル は 胃 と膀 胱 で 差 は 見 ら れ な い.
NH4Clを 与 え る と 胃 で は 他 の 多 く の細 胞 で 見 られ て い る よ うに,細 胞 内 は アル カ リに傾 き,除 去 で 一 過 性 の 酸 性化 が 観 察 さ れ る.し か し な が ら,膀 胱 で はNH4Cl投 与 に よ って 最 初 か ら細 胞 内 は酸 性 に傾 く.こ れ らが弛 緩 や 収 縮 に よ る
ア ー チ フ ァ ク トで あ る こ とを 除 外 す るた め,外 液 のCaイ オ ンを 除 い た り,1/10に 減 ら した り
して 同 じ結 果 が 得 られ た。も し,こ のpHの 測 定
が 正 し け れ ぼ,細 胞 内 の 酸 性 化 と 収 縮(興 奮 性) と の 間 に 相 関 が あ る と い え る.膀 胱 で は 胃 に 比 べ てNH4Clの 透 過 性 が 高 い た め にNH3の 細 胞 内 流 入 に よ る ア ル カ リ化 が 生 じ な い の か も 知 れ な い 。 し か し,neutral redは 細 胞 内 の い ろ ん な 構 造 物 に 結 合 す る 性 質 を も っ て い る の で (LaManna, 1987),細 胞 内pHを 正 確 に 反 映 し て い る か ど うか 疑 問 も存 在 す る.今 後,別 な 色 素(4 ,5 ‑dimethy1‑5(6)‑carboxy‑Huorescein
やBCECF)を 用 い て 実 験 を 繰 り 返 す 必 要 が あ る と 思 わ れ る が,胃 と 膀 胱 でNH4Clに 対 す る 機 械 的 な 反 応 もneutralredの 吸 光 反 応 も 逆 で
あ る の は 興 味 あ る 現 象 で あ る.
文 献
LaManna, J.C. (1987). Intracellular pH determi-nation by absorption spectrophotometry of neutral red. Metabolic Brain Disease, 2: 167-182.
Roos, A. and Boron, W.F. (1981). Intracellular pH. Physiol, Rev. 61: 296-434.
Siskind, M.S., McCoy, C.E., Chobanian, A. and Schwartz, J.H. (1989). Regulation of intracellular calcium by cell pH in vascular smooth muscle cells. Am J.Physiol. 256:
C234-240.
プ ロテ イ ン ホ ス フ ァ タ ー ゼ 阻 害 剤 オ カ ダ酸 の 平 滑 筋 張 力 発 生 抑 制 作 用 に つ い て
名 古屋 大 学 医学 部 第一 生 理 学教 室
高 井 章,徳 納 博 幸
M. Syed, 富 田 忠 雄 Virginia大 学 医学 部 生理 学教 室
小 林 誠
オ カ ダ 酸(OA)は,プ ロ テ イ ソ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ の 強 力 か つ 特 異 的 な 阻 害 剤 で あ り (Bialojan and Takai, 1988),各 種 平 滑 筋 ス キ
ン ドフ ァ イ バ ー で は ミ オ シ ン軽 鎖 燐 酸 化 の 上 昇 に と も な う張 力 増 強 効 果 を 示 す(Takai, 1988)
が,intactな 平 滑 筋 標 本 で は 逆 に 張 力 発 生 を 強 く抑 制 す る(Karaki et a1., 1989: Hirano et al.,
1989)。 こ の 抑 制 効 果 の 機 序 を 明 ら か に す る た め に,モ ル モ ッ トの 腸 管 お よ び 血 管 の 平 滑 筋 に お い て,細 胞 内Ca2+濃 度 お よ び 膜 のCa2+イ オ ン
日 本 平 滑 筋 誌26(6)1990 471
チ ャ ネ ル 活 性 に 及 ぼ す 影 響 を,ミ オ シ ン軽 鎖 燐 酸 化 状 態 や 張 力 発 生 に 対 す る 影 響 と並 行 し て 検 討 し た.
方 法
モ ル モ ッ ト盲 腸 紐,回 腸(縦 走 筋 層),肺 動 脈 の 摘 出 平 滑 筋 標 本 を 用 い た.高K+(100mM)液 は,HEPES(20mM)‑Krebs液 中 のNa+を 等 モ ル のK+で 置 換 す る こ と に よ り調 製 し た.ミ
オ シ ン 軽 鎖 の 燐 酸 化 は,二 次 元 電 気 泳 動 法 に よ り分 析 し た.パ ッ チ ク ラ ン プ 法 に よ る 実 験 に は, コ ラ ゲ ナ ー ゼ 処 理 に よ る 単 離 平 滑 筋 細 胞 を 用 い た.電 極 内 液 の 組 成 は 次 の 通 り:NaCl,15 mM;TEA,30mM;BaC12,65mM;HEPES,
10mMお よ びBAY‑K8644,0.5μM.
結 果 と考 察
高K+液 中 で 等 尺 的 に 拘 縮 を 起 さ せ た 状 態 で 10μMのOAを 投 与 す る と,三 種 類 の 平 滑 筋 と
も,37℃ で は5分 以 内 に,25℃ で は40〜60分 か か っ て 完 全 に 弛 緩 し た.こ の 際,ほ と ん ど 完 全 な ミオ シ ン 軽 鎖 の 脱 燐 酸 化 が 起 っ た.筋 の 収 縮 性 は,OAを2時 間 以 上 洗 い 流 し て も 回 復 し
な か っ た が,そ の あ と,膜 をCa2+除 去 液 中 に お い て サ ポ ニ ン エ ス テ ル の 一 種 β‑escin(50μM;
Kobayashi et al, 1989)で15分 間 処 理 し て ス キ ン ド フ ァ イ バ ー に す る と,MgATP存 在 下 で2 μMのCa2+投 与 に 応 答 し て,OA処 理 前 の 拘 縮
の 最 高 レ ベ ル を100%と す る と,83±16%
(SEM;n=5)の 張 力 発 生 が 見 ら れ た 。 た だ し, OAを 投 与 し な い で β‑escinで 処 理 し た 標 本 で は,同 じ 条 件 下 で,130±17%(n=3)の 張 力 が 得 ら れ る.肺 動 脈 平 滑 筋 に お い て は,4mMの EGTAを 含 むCa2+除 去 液 中 で フ ェ ニ レ フ リ ン
を 投 与 す る と,細 胞 内Ca2+放 出 に よ る と み ら れ る 張 力 発 生 が 起 っ た.こ の 反 応 は,高K+液 中 で の 拘 縮 がOAで 完 全 に 抑 制 さ れ た あ と で も, 処 理 前 の 約70%残 存 し た.回 腸 縦 走 筋 で,fura 2‑蛍 光 法(Kobayashi et a1., 1989)に よ り,細 胞 内Ca2+濃 度([Ca2+]i)の 変 化 を 張 力 と 同 時 に 観 察 し た と こ ろ,OA(10μM)に よ る 拘 縮 抑 制 は[Ca2+]iの 不 可 逆 的 減 少 に と も な っ て 起 る こ
と が わ か っ た.た だ し,そ の 減 少 の 程 度 は15
〜20%で あ り,OA処 理 で 収 縮 性 の 失 わ れ た 筋 で も,高K+・Ca2+除 去 液 中 で のCa2+再 投 与 に と も な っ て[Ca2+]iの 明 ら か な 上 昇 が 認 め ら れ た.さ ら に 盲 腸 紐 の 単 離 細 胞 で,パ ッ チ ク ラ ン プ 法(̀cell‑attach'の 状 態)で 観 察 さ れ る 二 種 類 のCa2+チ ャ ネ ル の う ち,コ ン ダ ク タ ン ス が 比 較 的 大 き く10μMの ベ ラ パ ミ ー ル で 完 全 に 抑 制 さ れ る も の に 対 す る 効 果 を み た.OA(10 μM)は,ピ ペ ッ ト内 に 投 与 し た 場 合 に は,Ca2+
チ ャ ネ ル 活 性 に 影 響 を 与 え な か っ た が,灌 流 液 中 に 投 与 す る と,そ の 開 確 率 を33±8%(n=10) 減 少 さ せ た.こ れ ら の 結 果 よ り,OAは,主 と し てCa2+が 収 縮 蛋 白 系 を 活 性 化 す る 過 程 を 阻 害 す る こ と に よ っ て,平 滑 筋 収 縮 を 抑 制 す る ら し い.OAは 膜 に お け るCa2+流 入 を 減 少 さ せ る が,こ れ が 張 力 発 生 抑 制 作 用 に ど の 程 度 寄 与 し て い る か に つ い て は,な お 検 討 を 要 す る.
文 献
Bialojan, C. and Takai, A. (1988). Inhibitory effect of a marine-sponge toxin, okadaic acid, on protein phosphatases: specificity and kinetics Biochemical Journal 256: 283-290.
Hirano, K., Kanaide, H. and Nakamura, M. (1989).
Effects of okadaic acid on calcium concentra-tions and on contracconcentra-tions of the porcine coro-nary artery. British Journal of Pharmacology 98: 1261-1266.
Karaki, H., Mitsui, M., Nagase, H., Ozaki, H., Shibata, S. and Uemura, D. (1989). Inhibi-tory effect of a toxin okadaic acid, isolated from the black sponge on smooth muscle and platelets. British Journal of Pharmacology 98: 590-596.
Kobayashi, S., Kitazawa, T., Somlyo, A. V. and Somlyo, A. P. (1989). Cytosolic heparin inhibits muscarinic and a-adrenergic Ca2+
release in smooth muscle. Journal of Biologi-cal Chemistry 264: 17997-18004.
Takai, A. (1988). Okadaic acid: protein phos-phatase inhibition and muscle contractile effects. Journal of Muscle Research and Cell Motility, 9: 563-565.