よって置換した後に、測定に用いた。
タンパク質標品の純度および濃度決定
精製後の標品である CooA は、SDS-PAGE、アミノ酸配列解析、TOF-MS によって 分子量の評価を、吸収スペクトルおよび共鳴ラマンスペクトルにより性質の評価を行い、
得られたタンパク質が目的物質であることを確認した。また各種測定によって純度も明 らかとなり、90 ％以上の高い純度で精製を行えたことが確認出来た。
濃度の決定に関しては、ヘムタンパク質に固有の方法である、ピリジンヘモクローム 法を用いて算出した。これは CooA に含まれるヘムがプロトヘムであることがわかっ ているため、用いることが可能である。まず精製後のタンパク質を緩衝液で希釈し、約 10
µ
M で 800µ
L に調製した。次にそこから 400µ
L をチューブにとり、ピリジン 180µ
L、5 M に調製した水酸化ナトリウム溶液を 20µ
L 加え、Sodium Hydrosulfite を加 えてヘム鉄を還元し、吸収スペクトルを測定した。このスペクトルから、タンパク質溶 液に含まれるヘムの濃度が、ピリジン結合型ヘムのモル吸光係数 (ε
557 nm = 34.4 mM-1 cm-1) を用いて算出され、同時にタンパク質の濃度が算出された。次に、希釈したタン パク質溶液を測定し、得られた吸収スペクトルにおいて最も強い吸収帯である Soret 帯をもとに酸化型、還元型、一酸化炭素結合型、それぞれにおけるモル吸光係数を求め た。これにより、測定をしたサンプルの濃度は、Soret 帯における吸光度から常に算出 出来るようにした。PCR 終了後、氷中にて冷却した後、Dpn I を 1
µ
L 加え、10,000 g で 1 分間遠心した 後、37 ℃で一時間酵素処理した。合成した時と同様に大腸菌株に形質導入し、選別を 行い、DNA シークエンサーで変異の確認をした後、発現させて変異体を獲得した。吸収スペクトルの測定
吸収スペクトルの測定には、紫外可視分光光度計 DU-640 を用い、精製後の標品は 酸化型であったことから、まず酸化型を測定し、次いで Sodium Hydrosulfite を少量 加えて還元型を、最後に一酸化炭素を吹きつけて一酸化炭素結合型とし、測定を行った。
測定には光路長 1 cm のセルを用い、測定する際の希釈には 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) を用いた。
共鳴ラマンスペクトルの測定
ラマン散乱の励起光となる光源には、共鳴効果を得るために、Soret 帯である 400 nm 付近の波長を照射可能なクリプトンレーザーの 406.7 nm の発振線を用い、試料の ダメージを抑えるために、円筒セルを回転させながら測定した。またレーザー出力は 35 mW で通常測定し、野生型など、光解離しやすいものについては、フィルターを使 い、出力を 1 mW 以下に下げて測定を行った。測定に際し、ラマン散乱光をダブルモ ノクロメーターで分光し、光電子増倍管によって検出した。測定したタンパク溶液はす べて 100
µ
M とし、希釈には 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) 用いた。一酸化炭素滴定
まず、シリコンで出来た蓋が可能なスクリューキャップセルに、小さなスターラーバー を入れ、緩衝液 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) を満たしてアルゴンで酸素を置換した。気相 を完全に除去しておき、CooA を約 3
µ
M になるようにシリンジで加えた。次に別のチュー ブに 100µ
L の緩衝液を用意し、いったんアルゴンで酸素を置換した後、還元剤である Sodium Hydrosulfite をスパーテル一杯分加え、ゴムキャップをし、気相をアルゴン で置換してから溶解させた。これを 20µ
L シリンジで取り、測定するセルのシリコン の栓の上から注入した。なお、この加える量は還元の難易によって多少変化させた。同様にして、参照とするためのブタのミオグロビンを調製し、CooA のセルとともに、測 定条件である 25 ℃の環境でスターラーによって約一時間穏やかに撹拌し、溶液が均一 になるようにした。
次に、滴定に用いる一酸化炭素溶液を調製した。まず 5 mL の緩衝液をチューブにと り 、 あらかじめ 氷中 で 冷却した。これにアルゴンで酸素を置換した後に Sodium Hydrosulfite を適量加え、一酸化炭素を二、三度通気させた後にゴムキャップを付け て気密にし、再度一酸化炭素を五、六度通気させることで、一気圧における一酸化炭素 の飽和溶液を調製した。この時の濃度は約 1 mM となった。これを 25 ℃にした恒温槽 で約一時間放置し、完全に 25℃における一酸化炭素溶液を調製した。
そこで、この一酸化炭素溶液を用いて測定を行った。まず参照とするブタのミオグロ ビンを用い、徐々に滴下してゆき、吸収スペクトルの変化を温度可変紫外可視分光光度 計 V-550 および温度コントローラーETC-505 により測定環境を常に 25 ℃として追跡 した。ミオグロビンは一酸化炭素と 1:1 で結合することが明らかとなっていることから、
一酸化炭素結合型のモル分率を Soret 帯の吸光度変化から算出し、滴下した溶液の総 量との相関から、この一酸化炭素溶液の濃度を決定した。同じくこの一酸化炭素溶液を 用いて CooA の測定を温度可変紫外可視分光光度計および温度コントローラーにより 測定環境を常に 25 ℃として行った。なお、ミオグロビンに比べ、少量ずつ滴下して行 くことで詳細な変化を追跡した。CooA については、まず紫外領域を含む 250˜650 nm における吸収スペクトルを測定し、先に示した Soret 帯のモル吸光係数をもとに、
濃度の決定を行った。次に変化が微細であるため、Q 帯に着目し、515˜585 nm にお ける吸収スペクトルを測定し、吸光度変化から一酸化炭素結合型のモル分率を算出した。
ミオグロビンの結果により得られた一酸化炭素濃度を用い、滴下した際の測定セル中に おける一酸化炭素濃度を算出し、一酸化炭素結合型のモル分率との相関より、CooA の 解離定数 Kd を算出した。なお 77 位の変異体については変曲点が存在したことから、
Figure 20 および 21 で示したような解析を行った。なお、変曲点は一酸化炭素濃度と CooA の濃度比が約 1 を示した。
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