タカギ 高木 ヒロシ 博史 略 歴 1982 年 1982 年 1986 年 共同研究者 西田 郁久 奈良先端科学技術大学院大学 1988 年 バイオサイエンス研究科 博士後期課程学生 渡辺 大輔 同大学院大学同研究科 大津 厳生 同大学院大学同研究科 助教 助教 1994 年 1995 年 200

全文

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タ カ ギ

木 博

ヒ ロ シ

略 歴 1982 年 名古屋大学大学院農学研究科 生化学制御専攻 博士前期課程 修了 1982 年 味の素株式会社中央研究所 研究員 1986 年 New York 州立大学生化学科  客員研究員 1988 年 東京大学大学院農学系研究科  農学博士 1994 年 味の素株式会社食品総合研究所  主任研究員 1995 年 福井県立大学生物資源学部 助教授 2001 年 福井県立大学生物資源学部 教授 2006 年 奈良先端科学技術大学院大学 バイオサイエンス研究科 教授 (現在に至る) 共同研究者

西田 郁久

(奈良先端科学技術大学院大学 バイオサイエンス研究科 博士後期課程学生)

渡辺 大輔

(同大学院大学同研究科 助教)

大津 厳生

(同大学院大学同研究科 助教)

プロリン代謝に着目したビール酵母の育種とビールの機能性向上への応用

Breeding of beer yeast based on proline metabolism and its

application to functional improvement of beer

Proline functions as an energy source and a stress protectant in organisms. We showed that proline protects the yeast Saccharomyces cerevisiae cells from various stresses such as freezing, oxidation, and ethanol. Degradation of proline in the mitochondria also contributes to stress resistance. Here, we performed microarray analyses to identify novel genes involving the metabolism and intracellular transport of proline. As a result, 10 genes encoding the putative mitochondrial proteins (Found in Mitochondrial Proteome; FMP) were up-regulated after addition of proline to minimal medium. Interestingly, the FMP12-disrupted cells showed increased growth on the medium containing proline as the sole carbon and nitrogen source (SD-C-N+Pro) compared with the wild-type cells. In contrast, overexpression of FMP12 decreased cell growth on the same medium. This is the first to report that S. cerevisiae cells could utilize proline as a carbon source. In addition, a single disruption of the glutamate dehydrogenase genes (GDH1-3) or the glutamate decarboxylase gene (GAD1) did not affect the phenotype of FMP12 disruptant on SD-C-N+Pro, although disruption of the α-ketoglutarate dehydrogenase subunit gene (KGD1) suppressed the phenotype of FMP12 disruptant. Additionally, similar to enzymes for the proline degradation and TCA cycle, Fmp12 is localized in the mitochondria. The amino acid sequence of Fmp12 has similarity with α-ketoglutarate-dependent dioxygenase found in human or yeast Candida species. This enzyme is suggested to catalyze the formation of succinate from α-ketoglutarate. It appears

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that a novel bypass pathway of TCA cycle involving Fmp12 suppresses the utilization of proline as a carbon source. Proline contents are abundant in raw material for making beer and wine, i.e. wort and grapes, respectively. S. cerevisiae cells poorly utilize proline that is known to cause unfavorable taste or flavor of alcoholic beverages. The fermentation ability in FMP12-disrupted cells was slightly higher than that of wild-type cells in the medium containing proline as a sole nitrogen source (SD-N+Pro). However, the overexpression of FMP12 significantly decreased the fermentation ability. These results suggest that artificial regulation of the FMP12 expression is effective for improvement of fermentation productivity of yeast in proline-containing medium.

1. はじめに  ビールをはじめ種々のアルコール飲料やパン類、バイオエタノール等の製造に重要な微生物である酵 母Saccharomyces cerevisiaeは、生育の際に炭素源として主にグルコースを、またアンモニウムやアミノ 酸、尿素等を窒素源として利用する。また、Scheffersomyces stipitis等の酵母では、アミノ酸を炭素源と して利用することが知られているが1)S. cerevisiaeはアミノ酸を単一の炭素源として利用し、増殖するこ とがほとんどできない。したがって、S. cerevisiae等多くの酵母には、炭素源としてのアミノ酸の利用を抑 制する未知のメカニズムが存在していると推測される。  一方、アミノ酸のプロリンは生物のエネルギー源となり、ストレスから細胞を保護する物質としても機能し ている2)。我々は、S. cerevisiaeにおいて、プロリンが冷凍、酸化、エタノール等のストレス時の細胞生存 率低下を抑制することや、プロリンのミトコンドリアでの分解が酸化ストレス耐性に寄与することを明らかに してきた3)  本研究では、プロリンを細胞質からミトコンドリアに輸送するトランスポーターを探索する過程で、ミトコン ドリアの機能未知遺伝子の一つであるFMP124)/AIM175)がプロリンの炭素源代謝に関わることを見出 したため、その機能を解明することを目的とした。本稿では、FMP12が制御するプロリンの炭素源利用 に必要な遺伝子の解析や、FMP12産物(Fmp12)の細胞内局在とその機能予測に関する結果を報 告する。また、FMP12の発現調節がプロリンを窒素源とした場合の発酵力に及ぼす影響についても報 告する。 2. プロリンの代謝や細胞内輸送に関わる新規な遺伝子の探索と

FMP

遺伝子破壊株の表現型解析  プロリン添加培地でS. cerevisiaeを培養すると、プロリンの代謝や細胞内輸送に関わる遺伝子の発 現が一過的に誘導されると予想し、細胞内プロリン含量が増加し始める時期にDNAマイクロアレイ解析 を行い、プロリンの添加の有無による全遺伝子の発現パターンを解析した。その結果、プロリン添加後に 遺伝子発現が変動し、転写量が 2 倍以上に増加した遺伝子が約 1,000 個得られた。その中で、ミト コンドリアと液胞におけるプロリン輸送体の候補を探索したところ、液胞における候補遺伝子を 8 個 取得したが、それらがプロリン輸送体として機能することは証明できなかった。次に、ミトコンドリアの

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機能未知タンパク質(Found in Mitochondrial Proteome;FMP)の遺伝子に着目したところ、10 個 存在していたため、各遺伝子破壊株の表現型解析を行った(図 1)。その結果、グルコースを炭素源、 硫酸アンモニウムを窒素源とする通常の最少培地ではいずれの菌株も同様に生育した。また、グルコー スを炭素源、プロリンを窒素源とする培地ではプロリンの分解反応を触媒するプロリンオキシダーゼ Put1 の遺伝子破壊株(Δput1株)以外では同様に生育した。一方、興味深いことに、プロリンを単一の炭素 源とする培地において、FMP12破壊株(Δfmp12)が野生株に比べて良好に生育することを見出した。 S. cerevisiaeがプロリンを炭素源として生育できたという知見は初めてである。   図1. 各 FMP 遺伝子の破壊が酵母の生育に及ぼす影響 各酵母について培養液の希釈系列を作製し、各種寒天培地の上にスポットした。 右上図はプロリンの分解経路を示す(P5C:Δ1-pyrroline-5-carboxylate, GSA:glutamate-γ-semialdehyde)。 3.

FMP12

の破壊株と過剰発現株の解析、およびプロリンを単一窒素源・炭素源として 利用するために必要な遺伝子の解析  S. cerevisiaeにおいて、プロリンはプロリンオキシダーゼ Put1 、Δ1-ピロリン-5-カルボン酸デヒドロゲ ナーゼ Put2 、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GDH)、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ(KGDH)によ り分解され、炭素源となる。そこで、プロリンを単一炭素源とする培地で顕著に生育するΔfmp12株を用 い、KGDH や GDH の関与を遺伝学的に解析した(図 2)。その結果、プロリンを単一の窒素源かつ炭 素源とする最少培地(主な栄養源がプロリン)において、野生型株に比べてΔfmp12株が良好に生育し た。また、FMP12破壊株のPUT1PUT2を破壊するとほとんど生育できないが、3個あるGDHの遺伝 子(GDH1-3)を単独で破壊しても、FMP12単独破壊株と表現型に差はなかった。一方、興味深いこと に、FMP12KGD1(KGDH 複合体の E1コンポーネント遺伝子)の二重破壊株では、プロリンを単一 窒素源かつ炭素源とする培地で生育できなくなった。このことから、この培地でΔfmp12株が良好に生 育するためにはTCA 回路のKGDH が関与することが示唆された。次に、FMP12をプラスミドで過剰発 現させた際の酵母の生育を観察した。その結果、野生型株でFMP12を過剰発現させると、プロリンや

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グルタミン酸を単一の窒素源かつ炭素源とする培地での生育が悪くなった。また、Δfmp12株でFMP12 を過剰発現させても、同様の傾向が見られた(図3)。   図2. KGDHや GDH の遺伝子破壊がΔfmp12 株の生育に及ぼす影響 各酵母について培養液の希釈系列を作製し、各種寒天培地の上にスポットした。 上図はプロリン分解の下流経路を示している。   図3. FMP12 の過剰発現が酵母の生育に及ぼす影響 各酵母について培養液の希釈系列を作製し、各種寒天培地の上にスポットした。 4. Fmp12の細胞内局在性解析  過去に行われたハイスループットの研究では、Fmp12 はミトコンドリアに局在することが知られてお り6)、我々もFmp12 の細胞内局在性を確認した。その結果、Fmp12 の C 末端にyeGFPタグを付加す

ると、その蛍光はミトコンドリアのマーカーであるMitoTracker Redと共局在した(図 4A)。この結果か ら、Fmp12 はミトコンドリアに存在することが示された。さらに、3HAタグを付加した Fmp12-3HAをプラ スミドで過剰発現させ、ウェスタンブロッティングを行ったところ(図4B)、矢印で示すように全細胞画分とミ トコンドリア画分で検出することができた。また、Fmp12-3HA は本来のサイズよりも低分子量で検出され

たことから、N 末端に存在する50アミノ酸残基程度のペプチド配列(MTS)がミトコンドリア移行時に切 断されていると考えられた。

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  図4. Fmp12の細胞内局在性 A. 蛍光顕微鏡によるFmp12yeGFP の検出および細胞内局在性解析 B. ウエスタンブロッティングによるFmp12-3HA の検出および全細胞(WCE)と ミトコンドリア(Mt)における局在性解析 5.

FMP12

と相同性を示すオルソログ遺伝子の解析

 FMP12AIM17(Altered Inheritance rate of Mitochondria 17)としても報告されており、 ミトコンドリア機能に関与していることが明らかとなっている4 )− 6 )。また、FMP12はクラバミン酸

( clavaminic acid )シンセターゼ( CAS )様のスーパーファミリーに属し、その一次構造はカルニチ ン生合成系の酵素であるγ- ブチロベタイン(γ-butyrobetaine)ジオキシゲナーゼやトリメチルリジン (trimethyllysine)ジオキシゲナーゼとの相同性が高く、Pseudomonas属の細菌や、多くの酵母、ショ ウジョウバエ、ヒトなどに保存されている。今回、S. cerevisiaeのFmp12はCandida albicansのγ-ブチ ロベタインジオキシゲナーゼBbh1やトリメチルリジンジオキシゲナーゼBbh2と相同性を示し7)、特にBbh1 と高い相同性のあることが明らかとなった(図 5)。いずれのC. albicans由来ジオキシゲナーゼもα-ケト グルタル酸をコハク酸に変換する反応を触媒するが、S. cerevisiaeではカルニチン生合成系が欠損して いることが知られている。したがって、Fmp12 がS. cerevisiaeの細胞内でどのような反応を触媒している かは不明であり、今後の課題である。  本研究では、酵母S. cerevisiaeがプロリンを単一の窒素源かつ炭素源として利用し、生育するために は、FMP12の機能は必要ないことが明らかになった。つまり、FMP12を保持する野生型株では、窒素 源と炭素源がプロリンのみの条件では(図 6A)、Fmp12 の酵素反応でα- ケトグルタル酸からコハク酸 に至るTCA 回路のバイパス経路が活性化し、TCA 回路の反応が抑制され、細胞の生育を阻害して いると考えられる。一方、このような条件下でFMP12を破壊すると、何らかのメカニズムによりTCA 回路 が進行しやすくなり、細胞が生育すると考えられる(図6B)。

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  図5. Fmp12 とミトコンドリアジオキシゲ ナーゼファミリーの構造 S. cerevisiaeの Fmp12 と相同性を 示す C. albicans の Bbh1, 2 の模式 図と各酵素の触媒反応を示している (MTS:ミトコンドリア移行配列)。   図6. プロリンを単一の炭素・窒素源とする生育のモデル図 野生型株ではFmp12がプロリンを単一の炭素源・窒素源とする培地で TCA 回路を抑制していると考えられる。 6.

FMP12

の破壊と過剰発現が及ぼす発酵力への影響  ビールやワインの原料である麦汁やブドウ果実にはプロリンが豊富に含まれている。プロリンは S. cerevisiaeが利用しにくいアミノ酸であり、またアルコール飲料やもろみ成分の味・風味にしばしば悪 影響を及ぼすことが知られている。そこで、FMP12がプロリン含有培地における発酵力に与える影響を 評価した。その結果、硫酸アンモニウムを単一窒素源とする培地では、FMP12過剰発現株と野生型 株の発酵力に差はなかったが、Δfmp12株ではわずかながら野生型株よりも発酵力が低下した(図 7)。 一方、興味深いことに、プロリンを単一窒素源とする培地(SD-N+Pro)において、Δfmp12株は野生 型株よりもわずかながら発酵力が向上したが、逆にFMP12の過剰発現によって発酵力は著しく低下した (図 8)。培養終了時(2 週間後)のこれら全サンプルにおいて、細胞の生育度やグルコース消費量、エ タノール生産量等に差は見られなかった(データ示さず)。また、図8の実験条件では、培地中のプロリン 含量がほとんど減少しておらず、主にグルコースが炭素源として利用されたことが示された。したがって、 Fmp12によるTCA 回路のバイパス経路は、プロリンが窒素源である際の発酵力にも何らかの影響を与 えていることも示唆された。これらのことから、プロリン含有培地においてFMP12の発現量を人為的に変 動させることで、発酵生産性の向上に繋がる可能性が示された。

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図7. SD 最少培地(10%グルコース+0.5%硫酸アンモニウム)における酵母の発酵試験

各菌株の発酵力を Fermograph(アトー社製)で測定するガス発生量によって評価した。前培養を SD 最少培地 で2日行い、菌体を洗浄後、OD600=0.2で本培養を開始した(30℃)。

野生型株(WT):BY4741/pRS416CgHIS3MET15, pAD4

FMP12破壊株(Δfmp12):BY4741 Δfmp12 株 /pRS416CgHIS3MET15, pAD4 野生型株(WT):BY4741u/pVV208 FMP12過剰発現株(FMP12 OP):BY4741u/pVV208-FMP12   図8. SD 最少培地(10%グルコース+3%プロリン)培地における酵母の発酵試験 酵母の菌株と培養条件は図7と同様にして行った。 7.

FMP12

の破壊が細胞内のアミノ酸含量に及ぼす影響  FMP12の発現調節を行うことで、プロリンを炭素源・窒素源として高度に利用できる酵母を育種でき れば、プロリン含量の低減した発酵食品の製造技術にも応用できる。さらに、Fmp12 による炭素源代謝 の改変により、貧栄養下での新しい発酵生産技術の開発にも繋がる。そこで、プロリンを単一の窒素源・ 炭素源とする培地で培養した酵母の細胞内アミノ酸含量をアミノ酸アナライザーで定量した。その結果、

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Δfmp12株ではオルニチン、アルギニン、プロリンの含量が野生型株に比べて増加しており、Fmp12 の 機能がアルギニン代謝と関連していることが示唆された(図 9)。今後、Fmp12 の機能が、発酵食品の 新規な製造法や味・風味の差別化などに寄与することが期待される。   図9. 各培養条件における酵母の細胞内アミノ酸含量 各菌株の細胞内アミノ酸含量をアミノ酸アナライザーで測定した。前培養をSD 最少培地で2日行い、菌体を洗浄 後、OD600=0.2で本培養を開始した(30 ℃)。グルコースを炭素源、硫安を窒素源とする培地では6 時間、プ ロリンを単一炭素源・窒素源とする培地では7時間培養を行った。回収した菌体を洗浄後、熱水抽出し、アミノ酸 アナライザーに供した。 野生型株(WT):BY4741/pRS416CgHIS3MET15, pAD4

FMP12破壊株(Δfmp12):BY4741 Δfmp12 株 /pRS416CgHIS3MET15, pAD4

8. おわりに  本研究において、Δfmp12株ではプロリンを単一窒素源・炭素源として利用する能力が増大し、過 剰発現株では逆に低下した8)。さらに、プロリンを単一の窒素源とする培地でも発酵特性が変化する ことが示された。今後、Fmp12 が触媒する反応経路の特定を遺伝学的や生化学的な手法で行い、 S. cerevisiaeがプロリンを炭素源として利用する機構を明らかにする予定である。また、FMP12のオルソ ログ遺伝子は他の多くの酵母や高等真核生物にも保存されていることから、それら相同遺伝子産物と 共通のメカニズムを有している可能性が示唆される。興味深いことに、プロリンを窒素源・炭素源として 利用する経路は、ガン細胞の増殖やハエなど昆虫の飛翔筋の動力源にも深く関わっており、本研究で得 られた Fmp12 の知見はガン治療、害虫防除など幅広い研究分野に応用できる可能性も秘めており、今 後の展開が期待できる。特に、ガン細胞においてはオンコメタボライトとして同定されているフマル酸、コ ハク酸、2-ヒドロキシグルタル酸がα-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼを競合阻害することが報告 されており9)、Fmp12の機能と疾患との関連性についても詳細に検討する必要がある。

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謝 辞

 本研究を遂行するにあたり、公益財団法人アサヒグループ学術振興財団の助成を賜りましたことに深 く感謝致します。また、発酵試験の実験条件においてアドバイスを頂いたアサヒビール株式会社醸造研

究所の尾形智夫先生(現・前橋工科大学工学部生物工学科 教授)に感謝いたします。

参考文献

1)S. Freese, et al., Yeast, 28, 375-390, 2011.

2)高木博史 , 蛋白質核酸酵素 , 53, 249-255, 2008.

3)H. Takagi, Appl. Microbiol. Biotech., 81, 211-223, 2008.

4)A. Chacinska, et al., Personal Communication to SGD, 2004

5)D.C. Hess, et al., PLoS Genet., 5, e1000407, 1-16, 2009

6)JJ. Reinders, et al., J. Proteome Res., 5, 1543-1554, 2006.

7)K. Strijbis, et al., FASEB J., 23, 2349-2359, 2009.

8)西田郁久ら, 2014年度日本農芸化学会関西支部大会(第486回講演会)講演要旨集 . p.27. 9)W. Xu, et al., Cancer Cell, 19, 17-30, 2011.

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参照

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