Title
黒色系ダリアにおける花弁の黒色化機構( Dissertation_全
文 )
Author(s)
出口, 亜由美
Citation
Kyoto University (京都大学)
Issue Date
2016-03-23
URL
https://doi.org/10.14989/doctor.k19757
Right
許諾条件により本文は2016-07-19に公開
Type
Thesis or Dissertation
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ETD
黒 色 系 ダ リ ア に お け る 花 弁 の 黒 色 化 機 構
出 口 亜 由 美
目 次 緒 言 ...1 第 1 章 黒 色 系 ダ リ ア に 特 異 的 な 形 質 お よ び 遺 伝 子 発 現 制 御 の 解 析 ...5 第 1 節 測 色 に よ る 花 色 の 評 価 ... 5 第 2 節 花 色 に 関 与 す る 形 質 の 比 較 調 査 ... 10 第 3 節 黒 色 系 ダ リ ア に お け る 色 素 蓄 積 の 遺 伝 子 制 御 の 調 査 ... 20 第 4 節 考 察 ... 35 第 2 章 ‘ 黒 蝶 ’ の 花 弁 の 赤 紫 色 化 を 引 き 起 こ す 原 因 の 解 析 ... 41 第 1 節 ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 か ら の ウ イ ル ス の 検 出 お よ び 除 去 ... 43 第 2 節 タ バ コ 条 斑 ウ イ ル ス （ TSVd a h l i a） の 塩 基 配 列 の 調 査 ... 51 第 3 節 TSVd a h l i a感 染 に よ る 赤 紫 色 化 機 構 の 調 査 ... 52 第 4 節 TSVd a h l i aの 接 種 お よ び 花 色 変 化 の 調 査 ... 56 第 5 節 考 察 ... 67 第 3 章 ダ リ ア 花 弁 に 蓄 積 す る 各 種 ア ン ト シ ア ニ ン の 花 弁 黒 色 化 へ の 寄 与 度 の 評 価 ... 73 第 1 節 主 要 蓄 積 ア ン ト シ ア ニ ン の 同 定 お よ び 定 量 ... 73 第 2 節 各 種 ア ン ト シ ア ニ ン の in vitro 測 色 ... 78 第 3 節 考 察 ... 88 摘 要 ... 93 Abstract ... 96 謝 辞 ... 100 引 用 文 献 ... 101
1 緒 言
黒 と い う 花 色 は ， 落 ち 着 き の あ る 色 合 い が 魅 力 的 で あ る の と ， 他 の 色 を 惹 き 立 て る 花 色 で あ る と し て 人 気 が 上 昇 し て い る ． 黒 色 花 を 咲 か せ る 植 物 種 は 数 が 少 な く ， 学 術 文 献 に お い て 報 告 さ れ て い る の は パ ン ジ ー の 野 生 種 （Viola tricolor ） （Clausen，1930），Lisianthius nigrescens（ Markham ら ，2004），お よ び ボ タ ン（ Peony spp.）（Wang ら ，2001）な ど に 限 ら れ て い る ．し か し ，近 年 で は ，ペ チ ュ ニ ア（ Petunia hybrida），タ チ ア オ イ（ Althaea rosea），ク レ マ チ ス（ Clematis）な ど で も 黒 色 系 品 種 が 販 売 さ れ 始 め た ． 黒 色 と い う 花 色 は 花 卉 産 業 に お い て こ れ か ら の 利 用 価 値 が 見 込 め る 形 質 で あ る も の の ， 花 弁 の 黒 色 化 の 仕 組 み は 明 ら か に な っ て い な い ． ダ リ ア （Dahlia variabilis） は キ ク 科 に 属 す る 高 次 倍 数 性 （ 2n = 8x = 64） の 花 卉 で あ り（Gatt ら ，1998），花 型 ，花 色 ，花 径 が 非 常 に 豊 富 で あ る た め ，過 去 100 年 で 約 50,000 品 種 が 育 種 さ れ た と い わ れ て い る （ McClaren， 2004）． 黒 色 の 品 種 も 多 数 存 在 し ， な か で も 中 大 輪 セ ミ カ ク タ ス 咲 き の ‘ 黒 蝶 ’ は 切 り 花 ダ リ ア の 代 名 詞 に も な る ほ ど 人 気 の 高 い 品 種 で あ る ． ダ リ ア の 花 弁 に 蓄 積 す る 色 素 は フ ラ ボ ノ イ ド 系 色 素 で あ り ， 橙 色 か ら 赤 紫 色 の ア ン ト シ ア ニ ン ， 淡 黄 色 の フ ラ ボ ン お よ び 黄 色 の カ ル コ ン が 主 た る 構 成 色 素 で あ る （Harborne ら ， 1990； Nordström・ Swain， 1953， 1956， 1958）． ア ン ト シ ア ニ ン は ペ ラ ル ゴ ニ ジ ン 系 お よ び シ ア ニ ジ ン 系 ， フ ラ ボ ン は ア ピ ゲ ニ ン 系 お よ び ル テ オ リ ン 系 ， カ ル コ ン は イ ソ リ キ リ チ ゲ ニ ン 系 お よ び ブ テ イ ン 系 が 蓄 積 す る ． こ れ ら の フ ラ ボ ノ イ ド 色 素 の 合 成 経 路 は 様 々 な 植 物 種 で 研 究 さ れ て お り （Tanaka ら ， 2008），ダ リ ア に お い て も 合 成 を 担 う酵 素に つ い て 研 究 が な さ れ（Fischer ら ，1988； Halbwirth ら ， 2008； Thill ら ， 2012； Wimmer ら ， 1998）， 各 色 素 ア グ リ コ ン の 合 成 経 路 は 第 1 図 の と お り で あ る と さ れ る ． ア ン ト シ ア ニ ジ ン （ ペ ラ ル ゴ ニ ジ ン お よ び シ ア ニ ジ ン ） は 糖 の 付 加 や ア シ ル 化 な ど の 過 程 を 経 て ， ア ン ト シ ア ニ ン と し て 液 胞 に 蓄 積 す る ． ダ リ ア に お い て は ， こ れ ら の 色 素 合 成 酵 素 を コ ー ド す る 遺 伝 子 も 多 く が 単 離 さ れ て い る（Ohno ら ，2011a，2011b； Schlangen ら ，2010； Suzuki ら ，2002）．ま た ，ア ン ト シ ア ニ ン 合 成 に 関 し て は ，bHLH 様 転 写 因 子 DvIVS が 合 成 経 路 上 の 複 数 の 遺 伝 子 の 発 現 量 を 正 に 制 御 し ， 花 弁 で の ア ン ト シ ア ニ ン 蓄 積 量 お よ び 桃 色 か ら 赤 紫 色 ま で の 花 色 の 濃 淡 の 決 定 因 子 で あ る こ と が 明 ら か に な っ て い る（Ohno ら ，2011a，2013）．し か し ，最 濃 色 で あ る 黒 色 は DvIVS に よ る 制 御 で は 説 明 で き ず ， 花 弁 の 黒 色 化 に は 未 知 の 機 構 が 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ て い る ．
本 研 究 で は ダ リ ア 花 弁 の 黒 色 化 機 構 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た ． 本 研 究 に 先 立 ち ， 私 は あ る 農 場 に お い て 赤 紫 色 の 花 を つ け る ‘ 黒 蝶 ’ を 発 見 し た ． こ の ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 は 遺 伝 子 背 景 が 本 来 の 黒 色 花 を つ け る ‘ 黒 蝶 ’ と 同 じ で あ る
2 と 推 察 さ れ ， 花 弁 の 黒 色 化 の 要 因 を 探 索 す る た め の 比 較 調 査 を 行 う に 適 し た 個 体 で あ る と 考 え ら れ た ． そ の た め ， 複 数 の 黒 色 系 お よ び 赤 紫 色 系 品 種 と と も に ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 を 実 験 に 供 試 し た ． 第 1 章 で は 黒 色 系 と 赤 紫 色 系 間 で の 比 較 解 析 に よ り 黒 色 系 品 種 に 特 異 的 な 形 質 お よ び 遺 伝 子 制 御 の 特 定 を 行 い ，第 2 章 で は‘ 黒 蝶 ’ の 赤 紫 色 化 の 原 因 を 調 査 し た ． 第 3 章 で は ， 第 1 章 お よ び 第 2 章 で 示 唆 さ れ た 各 種 ア ン ト シ ア ニ ン の 花 弁 黒 色 化 へ の 寄 与 度 の 違 い に つ い て in vitro 測 色 法 に よ る 評 価 を 行 っ た ． こ れ ら の 結 果 か ら ， ダ リ ア に お け る 花 弁 の 黒 色 化 機 構 お よ び 他 の 植 物 種 に お け る 黒 色 花 作 出 の 可 能 性 を 考 察 し た ． ＊ 図 表 中 で は 赤 紫 色 を purple と 表 記 し た ．
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Fig. 1. Synthetic pathway of flavonoid pigments (aglycones) accumulated in dahlia petals.
CHS: chalcone synthase, CHI: chalcone isomerase, F3H: flavanone 3-hydroxyrase, DFR: dihydroflavonol 4-reductase, ANS: anthocyanidin synthase, F3'H: flavonoid 3'-hydroxyrase, CHR: chalcone reductase, CH3H: chalcone 3-hydroxyrase, FNS: flavone synthase. Among these enzymes, only CHR remains to be isolated. 4-Coumaroyl CoA + 3x malonyl-CoA Chalcononaringenin (Chalcone) Naringenin (Flavanone) Eriodictyol (Flavanone) Isoliquiritigenin (Chalcone)
Apigenin
(Flavone)Luteolin
(Flavone) Dihydrokaempferol (Flavanonol) Dihydroquercetin (Flavanonol) Leucopelargonidin(Leucoanthocyanidin) (Leucoanthocyanidin)Leucocyanidin
Pelargonidin
(Aanthocyanidin)Cyanidin
(Anthocyanidin)Butein
(Chalcone)CHS + CHR
CH3H
CHS
CHI
F3'H
F3'H
F3H
DFR
ANS
F3H
DFR
ANS
FNS
FNS
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Fig. 2. Dahlia cultivars used in this study.
Black cultivars: ‘Fidalgo Blacky’, ‘Ms. Noir ’, ‘Kokucho’ and ‘Black Cat’. ‘Kokucho’ with purple flowers: ‘Kokucho’ (purple).
Purple cultivars: ‘Cupid’, ‘Yukino’, ‘Super Girl’, ‘Atom’ and ‘Evelyn Rumbold’. Pink cultivars: ‘Jyunn-ai’ and ‘Saffron’.
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第 1 章 黒 色 系 ダ リ ア に 特 異 的 な 形 質 お よ び 遺 伝 子 発 現 制 御 の 解 析
植 物 組 織 に お い て 黒 色 の 色 調 が 現 れ る 原 理 に は ， ブ ド ウ （Vitis vinifera ， V. labruscana）の 果 皮 の よ う な ア ン ト シ ア ニ ン の 高 蓄 積 や（ Boss ら ，1996； Shiraishi ら ，2007），パ ン ジ ー（ Viola ×wittrockiana）や パ フ ィ オ ペ デ ィ ラ ム（ Paphiopedilum appletonianum）の 花 弁 に 存 在 す る 黒 斑 の よ う に ア ン ト シ ア ニ ン と カ ロ テ ノ イ ド と い っ た 複 数 の 色 素 の 混 在 が 報 告 さ れ て い る（ 斎 藤 ，1990）．ま た ，花 色 に は 花 弁 に 蓄 積 す る 色 素 の 組 成 や 量 以 外 に も ， 色 素 の 蓄 積 組 織 や 細 胞 内 で の 局 在 ， 花 弁 表 皮 細 胞 の 構 造 ， 花 弁 pH が 関 与 し て い る こ と が 知 ら れ て い る （ Grotewold， 2006）．
本 章 で は ，ま ず ，CIE（ Commission internationale de l'éclairage：国 際 照 明 委 員 会 ） が 定 め る 均 等 色 空 間 の 一 つ で あ る L*a*b* 表 色 系 を 用 い て ダ リ ア の 花 色 の 数 値 評 価 を 行 っ た ． そ の 上 で ， 黒 色 系 品 種 ， 赤 紫 色 系 品 種 お よ び ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 を 用 い て 花 色 に 関 与 す る と 報 告 の あ る 形 質 に つ い て 比 較 調 査 を 行 い ， 黒 色 系 品 種 に 特 異 的 な 形 質 を 特 定 し た ． さ ら に ， 特 定 さ れ た 形 質 を 生 じ る 遺 伝 子 制 御 機 構 に つ い て 調 査 を 行 っ た ． 第 1 節 測 色 に よ る 花 色 の 評 価 〈 材 料 お よ び 方 法 〉 黒 色 系 4 品 種（ ‘ フ ィ ダ ル ゴ ブ ラ ッ キ ー ’ ，‘ ミ ズ ノ ア ー ル ’ ，‘ 黒 蝶 ’ ，‘ ブ ラ ッ ク キ ャ ッ ト ’ ），赤 紫 色 系 5 品 種（ ‘ キ ュ ー ピ ッ ト ’ ，‘ 雪 乃 ’ ，‘ ス ー パ ー ガ ー ル ’ ， ‘ ア ト ム ’ ， ‘ エ ベ リ ン ラ ン ボ ル ト ’ ）， 桃 色 系 2 品 種 （‘ 純 愛 ’，‘ サ フ ラ ン ’）お よ び‘ 黒 蝶 ’赤 紫 色 個 体 を 供 試 し た ．色 差 計 NR-3000（ 日 本 電 色 工 業 ） を 用 い て ，生 花 弁 の L*a*b*値 を 測 定 し た ．L*は 明 度 ，a*は 赤 － 緑 ，b*は 黄 － 青 を 示 す 数 値 で あ り ，a*お よ び b*か ら 彩 度 を 示 す C* = (a*2 + b*2)1 / 2を 計 算 し た ．1 花 序 あ た り 花 弁 3 枚 を 3 箇 所 ず つ ， 計 3 花 序 分 測 定 し ， 各 品 種 お よ び ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 の L*， a*， b*お よ び C*の 平 均 値 を 算 出 し た ． 測 定 は 測 定 台 の 影 響 が 出 な い よ う 白 色 紙 の 上 で 行 っ た ．L*お よ び C*の 有 意 差 検 定 は マ ン ホ イ ッ ト ニ ー の U 検 定 で 行 っ た ． 〈 結 果 〉 各 品 種 の 花 弁 の L*， a*， b*お よ び C*は 第 1-1 表 の と お り で あ り ， 彩 度 C*お よ び 明 度 L*に よ る 各 品 種 の 分 布 を 第 1-1 図 に 示 し た ． 桃 色 系 ， 赤 紫 色 系 ， 黒 色 系 品 種 の 順 に 花 色 が 淡 色 か ら 濃 色 に な る に し た が い L*は 低 く な っ た ．一 方 で ，C*は 桃 色 系 か ら 赤 紫 色 系 に か け て は 高 く な り ， 黒 色 系 に な る と 低 く な っ た ． 黒 色 系 と そ
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の 他 の 色 系 （ 赤 紫 色 系 お よ び 桃 色 系 ） と の 比 較 で は ，L*は 黒 色 系 品 種 に お い て 有 意 に 低 く （P = 0.007）， C*に は 有 意 な 差 は な か っ た （ P = 0.234）． 黒 色 系 品 種 内 で は ， 見 た 目 の 花 色 （ 第 2 図 ） が よ り 黒 い 品 種 ほ ど L*お よ び C*が と も に 低 い 値 を 示 し た ．こ れ は 日 本 色 彩 研 究 所 が 定 め る PCCS（ Practical Color Co-ordinate System： 日 本 色 研 配 色 体 系 ）で の ト ー ン（ 第 1-2 図 ）に お い て L*お よ び C*が 低 く な る ほ ど 黒 色 に 近 づ く こ と と 一 致 し た ．
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Table 1-1. Petal colors described by CIE L*a*b* coordinates.
L* a* b* C* 'Fidalgo Blacky' 14.14 ± 0.33 84.53 ± 1.51 2.34 ± 0.10 84.57 ± 1.51 'Ms. Noir' 14.22 ± 0.20 86.01 ± 5.50 3.06 ± 0.48 86.07 ± 5.51 'Kokucho' 14.90 ± 0.17 94.12 ± 2.68 3.84 ± 0.42 94.20 ± 2.69 'Black Cat' 15.94 ± 0.96 103.53 ± 1.61 6.58 ± 0.77 103.75 ± 1.62 'Kokucho' (purple) 17.22 ± 0.28 119.62 ± 2.07 8.76 ± 0.40 119.94 ± 2.08 'Cupid' 20.55 121.42 -0.96 121.44 'Yukino' 21.53 ± 0.56 119.50 ± 1.28 11.46 ± 1.86 120.09 ± 1.23 'Super Girl' 24.10 ± 1.10 111.74 ± 2.02 13.76 ± 2.72 112.70 ± 1.73 'Atom' 27.53 ± 1.48 106.92 ± 3.69 -7.47 ± 0.86 107.20 ± 3.67 'Evelyn Rumbold' 29.45 ± 1.84 94.23 ± 4.17 1.39 ± 3.11 94.40 ± 4.14 'Jyunn-ai' 60.29 48.91 -12.99 50.61 'Saffron' 63.06 ± 0.25 46.62 ± 0.73 -10.83 ± 0.20 50.79 ± 0.69 C* was culculated as (a *2+b *2)1/2.
Cultivar CIE L*a*b*C* coordinates
Flower color
Data represent the average ± SE of total 27 collected data points:
3 locations × 3 petals × 3 individual inflorescences (2 inflorescences in 'Cupid' and 'Jyunn-ai'). Black
Purple
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Fig. 1-1. Distribution of L* (lightness) and C* (chro ma) values of black, purple, pink cultivars and ‘Kokucho’ (purple).
The raw data are shown in Table 1-1.
0 10 20 30 40 50 60 70 0 50 100 150
L*
(Lightness)
C* (Chroma)
Pink Purple 'Kokucho' (purple) Black2 3 4
5
6
7
9
1
8
10
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1. 'Fidalgo Blacky'
2. 'Ms.Noir'
3. 'Kokucho'
4. 'Black Cat'
5. 'Kokucho' (purple)
6. 'Cupid'
7. 'Yukino'
8. 'Super Girl'
9. 'Atom'
10. 'Evelyn Rumbold'
11. 'Jyunn-ai'
12. 'Saffron'
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Fig. 1-2. Tone defined in Practical color coordinate system developed by Japan Color Research Institute.
10 第 2 節 花 色 に 関 与 す る 形 質 の 比 較 調 査 〈 材 料 お よ び 方 法 〉 黒 色 系 4 品 種 ， 赤 紫 色 系 5 品 種 お よ び ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 を 供 試 し た ． 色 素 蓄 積 組 織 お よ び 細 胞 内 で の 蓄 積 局 在 の 観 察 ［ 生 切 片 の 観 察 ］ 展 開 花 弁 を 重 ね た カ ミ ソ リ 2 枚 で 切 断 し ， カ ミ ソ リ の 間 に は さ ま れ た 花 弁 切 片 を ス ラ イ ド グ ラ ス に の せ た ． カ バ ー ガ ラ ス を の せ ， 端 か ら 水 を 含 ま せ た 後 ，VHX Digital Microscope（ キ ー エ ン ス ） で 観 察 し た ． 花 弁 表 皮 細 胞 の 観 察 ［ レ ジ ン 切 片 の 観 察 ］ 展 開 花 弁 を FAA 固 定 液 （ エ タ ノ ー ル ： 水 ： ホ ル マ リ ン ： 酢 酸 = 12： 6： 1： 1 v/v/v/v） に 浸 漬 し ， デ シ ケ ー タ ー 中 で 一 晩 脱 気 し た ． FAA 固 定 し た 花 弁 を カ ミ ソ リ で 5 mm 四 方 に 切 り ，流 水 で 一 晩 洗 浄 し ，組 織 中 の FAA 固 定 液 を 水 に 置 換 し た ． 次 に ， 以 下 の 置 換 液 お よ び 浸 漬 時 間 で 組 織 中 の 水 を エ タ ノ ー ル に ， さ ら に エ タ ノ ー ル か ら 置 換 用 レ ジ ン に 置 換 し た ． 30％ エ タ ノ ー ル 30 分 50％ エ タ ノ ー ル 30 分 70％ エ タ ノ ー ル 30 分 90％ エ タ ノ ー ル 30 分 100（ 99） ％ エ タ ノ ー ル 30 分 以 上 50％ 置 換 用 レ ジ ン ＋ 50％ エ タ ノ ー ル 2 時 間 100％ 置 換 用 レ ジ ン 1 時 間 以 上 包 埋 用 レ ジ ン を ブ ロ ッ ク 作 成 用 の 型 に 約 3 mL 分 注 し ， 花 弁 サ ン プ ル を 入 れ ， シ リ カ ゲ ル を 入 れ た 容 器 内 で 固 め た ．固 ま っ た レ ジ ン ブ ロ ッ ク を 型 か ら 取 り 出 し ， ミ ク ロ ト ー ム RM2155（ Leica Microsystem）を 用 い て 厚 さ 5 μm の 切 片 を 作 成 し た ． 水 面 で 切 片 を 伸 展 さ せ ， ス ラ イ ド ガ ラ ス に 貼 り 付 け て 乾 燥 し た ． ト ル イ ジ ン ブ ル ー で 30 分 間 染 色 し た 後 ， 5 分 間 水 洗 し た ． 乾 燥 さ せ ， VHX Digital Microscope で 観 察 し た ． 各 品 種 花 弁 向 軸 面 の 表 皮 細 胞 か ら 任 意 の 3 細 胞 を 選 択 し て ， 表 層 面 に 対 し て 垂 直 方 向 を 縦 と し て 各 細 胞 の 縦 （ 高 さ ） お よ び 横 （ 幅 ） の 長 さ を 測 定 し ， 縦 横 比 の 平 均 値 を 算 出 し た ．黒 色 系 と 赤 紫 色 系（‘ 黒 蝶 ’赤 紫 色 個 体 を 含 む ）間 の 縦 横 比 の 有 意 差 検 定 は マ ン ホ イ ッ ト ニ ー の U 検 定 で 行 っ た ． ＊ 置 換 用 レ ジ ン
Technovit 7100 liquid（ Heraeus Kulzer） 100 mL に Hardner I（ Heraeus Kulzer） 1.0 g を 溶 解 し て 作 成 し ，4℃ で 保 存 し た ．
11 ＊ 包 埋 用 レ ジ ン
置 換 用 レ ジ ン と Hardner II（ Heraeus Kulzer） を 9： 1 の 割 合 で 混 合 し て 作 成 し た ．
花 弁 pH の 測 定 生 花 弁 200 mg に 蒸 留 水 6 mL を 加 え ， 乳 棒 お よ び 乳 鉢 を 用 い て 花 弁 を 磨 砕 し た ．1 分 以 内 に pH メ ー タ ー EX-20（ 堀 場 製 作 所 ）を 用 い て pH を 測 定 し た ．3 つ の 異 な る 花 序 の 花 弁 を 用 い ，3 反 復 に よ る 平 均 値 を 算 出 し た ． 有 意 差 検 定 は マ ン ホ イ ッ ト ニ ー の U 検 定 で 行 っ た ． 花 弁 蓄 積 色 素 の 定 量 展 開 花 弁 100 mg を 液 体 窒 素 中 で 凍 結 粉 砕 し ，酢 酸 メ タ ノ ー ル 水 溶 液（ 酢 酸：メ タ ノ ー ル ： 蒸 留 水 ＝1： 4： 5 v/v/v） 1 mL を 加 え ， よ く 混 合 し た ． 1.5 mL エ ッ ペ ン ド ル フ チ ュ ー ブ に 回 収 し ，4℃ で 一 晩 放 置 し た ．4℃ ，20,600 g で 15 分 間 遠 心 分 離 し た 後 ， 上 清 を ペ ト リ 皿 に 回 収 し ， 風 乾 し た ． 乾 燥 し た 色 素 を 塩 酸 メ タ ノ ー ル 水 溶 液 （10％ 塩 酸 ， 50％ メ タ ノ ー ル ） 1 mL に 再 溶 解 し ， 25 µL を 1.5 mL エ ッ ペ ン ド ル フ チ ュ ー ブ に 回 収 し ， 塩 酸 メ タ ノ ー ル 水 溶 液 475 µL を 加 え 全 量 500 µL の 20 倍 希 釈 色 素 溶 液 を 作 成 し た ． キ ャ ッ プ ロ ッ ク を 装 着 し ，95℃ の ウ ォ ー タ ー バ ス で 1 時 間 加 熱 し た ． C18 カ ラ ム（ 日 本 ウ ォ ー タ ー ズ ）を 装 着 し た 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー（ High performance liquid chromatography： HPLC） LC10A シ ス テ ム （ 島 津 製 作 所 ） に 20 µL を 注 入 し ，流 速 1 mL·min- 1，40℃ で 50 分 間 解 析 を 行 っ た ．溶 出 液 は A 液（ 1.5％ リ ン 酸 ）お よ び B 液（ 1.5％ リ ン 酸 ，25％ ア セ ト ニ ト リ ル ，20％ 酢 酸 ）の 2 種 類 を 用 意 し ， 測 定 開 始 後 40 分 間 で B 液 の 割 合 が 20％ か ら 85％ に ， 続 く 5 分 間 で 再 び 20％ に な る よ う に 勾 配 を 設 定 し た ．測 定 波 長 は ア ン ト シ ア ニ ジ ン に は 520 nm，フ ラ ボ ン に は 350 nm を 使 用 し た ． 検 出 さ れ た ピ ー ク 面 積 か ら 各 色 素 ア グ リ コ ン の 蓄 積 量 を 算 出 し た ． 検 量 線 作 成 に は ， 薄 層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で 回 収 し た ペ ラ ル ゴ ニ ジ ン （ 立 澤 氏 よ り 提 供 ）， 塩 化 シ ア ニ ジ ン 純 品 （ 和 光 純 薬 ）， ア ピ ゲ ニ ン 純 品 （ 和 光 純 薬 ） お よ び ル テ オ リ ン 純 品 （LKT Laboratories） を 使 用 し た ． シ ア ニ ジ ン の 検 量 線 は 塩 化 シ ア ニ ジ ン と の 分 子 量 比 か ら 換 算 し て 作 成 し た ． ‘ 黒 蝶 ’ お よ び‘ 黒 蝶 ’赤 紫 色 個 体 に つ い て は ，4 つ の 花 弁 発 達 ス テ ー ジ（ S1： 着 色 前 ，S2： 半 分 程 度 着 色 ， S3： 完 全 着 色 未 展 開 ， S4： 完 全 着 色 完 全 展 開 ） 別 に 生 花 弁 100 mg あ た り の 蓄 積 量 を 測 定 し た ．
12 〈 結 果 〉 色 素 蓄 積 組 織 お よ び 細 胞 内 で の 蓄 積 の 局 在 各 品 種 お よ び ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 の 花 弁 生 切 片 の 写 真 を 第 1-3 図 に 示 し た ． す べ て に お い て ，色 素 の 蓄 積 は 花 弁 向 軸 面 お よ び 背 軸 面 の 表 皮 細 胞 の み で み ら れ た ． ま た ， 表 皮 細 胞 内 は 一 様 に 着 色 し て お り ， 黒 色 系 と 赤 紫 色 系 と で 色 素 の 蓄 積 様 相 に 違 い は み ら れ な か っ た ． 花 弁 表 皮 細 胞 の 形 態 各 品 種 お よ び‘ 黒 蝶 ’赤 紫 色 個 体 の 花 弁 レ ジ ン 切 片 の 写 真 を 第 1-4 図 に 示 し た ． 品 種 に よ っ て 表 皮 細 胞 の 大 き さ ， 形 ， 配 列 は 様 々 で あ っ た が ， 各 色 系 で 目 立 っ た 特 徴 が あ る わ け で は な か っ た ． 黒 色 系 と 赤 紫 色 系 と で 表 皮 細 胞 の 縦 横 比 に 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た （ 第 1-2 表 ， P = 0.521）． 花 弁 pH 各 品 種 お よ び ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 の 測 定 結 果 を 第 1-3 表 に 示 し た ． す べ て に お い て 花 弁 pH は 4.9 か ら 5.5 ま で の 弱 酸 性 で あ り ， 一 般 的 な 花 弁 pH の 範 囲 内 で あ っ た ． 黒 色 系 品 種 で は お お よ そ 5.0 付 近 で あ っ た の に 対 し ， 赤 紫 色 系 品 種 で は 黒 色 系 品 種 よ り も 高 い 値 を 示 し ， 黒 色 系 品 種 と 赤 紫 色 系 品 種 お よ び ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 と で は 5％ 水 準 で 有 意 な 差 が み ら れ た （ P = 0.033）． し か し ， 黒 色 系 と 赤 紫 色 系 で の pH の 差 は わ ず か 0.5 程 度 で あ っ た ．ま た ，赤 紫 色 系‘ 雪 乃 ’と 黒 色 系‘ ミ ズ ノ ア ー ル ’の 値 に は ほ と ん ど 差 が な く ，‘ 黒 蝶 ’赤 紫 色 個 体 は‘ 黒 蝶 ’お よ び そ の 他 の 黒 色 系 品 種 と 同 等 の 値 を 示 し た ． フ ラ ボ ノ イ ド 色 素 蓄 積 量 各 品 種 に お け る 色 素 ア グ リ コ ン 別 蓄 積 量 を 第 1-5 図 に 示 し た ． 算 出 さ れ た 各 ア グ リ コ ン 量 は そ れ ら を 骨 格 と す る 配 糖 体 ， す な わ ち ア ン ト シ ア ニ ン お よ び フ ラ ボ ン の 蓄 積 量 を 反 映 す る も の と 考 え ら れ た ． 黒 色 系 品 種 は ア ン ト シ ア ニ ン （ ペ ラ ル ゴ ニ ジ ン 系 お よ び シ ア ニ ジ ン 系 ）の 総 蓄 積 量 が 比 較 的 多 か っ た が ，‘ フ ィ ダ ル ゴ ブ ラ ッ キ ー ’ お よ び ‘ ブ ラ ッ ク キ ャ ッ ト ’ は 赤 紫 色 系 の ‘ 雪 乃 ’ お よ び ‘ ス ー パ ー ガ ー ル ’ よ り も ア ン ト シ ア ニ ン 総 蓄 積 量 が 少 な か っ た ． ま た ， 黒 色 系 品 種 は シ ア ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン の 割 合 が 高 く ， 絶 対 蓄 積 量 が 多 い 傾 向 が み ら れ た ． さ ら に ， 黒 色 系 品 種 と 赤 紫 色 系 品 種 間 で の 明 確 な 違 い と し て ， 黒 色 系 品 種 は 赤 紫 色 系 品 種 で は 蓄 積 が み ら れ る フ ラ ボ ン （ ア ピ ゲ ニ ン 系 お よ び ル テ オ リ ン 系 ） を ほ と ん ど 蓄 積 し て い な か っ た ． ‘ 黒 蝶 ’ は フ ラ ボ ン を 蓄 積 し て い な か っ た の に 対 し ，‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 は 赤 紫 色 系 品 種 の よ う に フ ラ ボ ン を 蓄 積 し て い た （ 第 1-6 図 a, b）．‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体
13 で は フ ラ ボ ン が S1 か ら 蓄 積 し 始 め ， S3 で 蓄 積 が 最 大 と な っ た ． ま た ， ア ン ト シ ア ニ ン は‘ 黒 蝶 ’と 同 様 に S3 で 蓄 積 が 最 大 と な っ た が ，蓄 積 量 は‘ 黒 蝶 ’よ り も 少 な か っ た ．S3 に お け る ‘ 黒 蝶 ’ で の ア ン ト シ ア ニ ン 総 蓄 積 量 と ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 で の ア ン ト シ ア ニ ン お よ び フ ラ ボ ン の 総 蓄 積 量 は 概 ね 一 致 し て い た ． ま た ， ア グ リ コ ン 別 に ア ン ト シ ア ニ ン 蓄 積 量 を 比 較 す る と ，‘ 黒 蝶 ’赤 紫 色 個 体 で の ペ ラ ル ゴ ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン 蓄 積 量 ， シ ア ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン 蓄 積 量 は ‘ 黒 蝶 ’ よ り そ れ ぞ れ 0.74 mg， 0.55 mg（ 生 花 弁 100 mg あ た り ） 少 な く ， シ ア ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン で の み 有 意 な 差 が み ら れ た （ 第 1-6 図 c）．
14
Fig. 1-3. Transverse sections of petals of black cultivars, purple cultivars and ‘Kokucho’ (purple).
(a) ‘Fidalgo Blacky’, (b) ‘Ms. Noir ’, (c) ‘Kokucho’, (d) ‘Black Cat’, (e) ‘Kokucho’ (purple), (f) ‘Cupid’, (g) ‘Yukino’, (h) ‘Super Girl’, (i) ‘Ato m’, (j) ‘Evelyn Rumbold’. Scale bar in (j) shows 100 µm.
15
Fig. 1-4. Transverse sections of adaxial petal epidermal cells of black cultivars, purple cultivars and ‘Kokucho’ (purple).
(a) ‘Fidalgo Blacky’, (b) ‘Ms. Noir ’, (c) ‘Kokucho’, (d) ‘Black Cat’, (e) ‘Kokucho’ (purple), (f) ‘Cupid’, (g) ‘Yukino’, (h) ‘Super Girl’, (i) ‘Ato m’, (j) ‘Evelyn Rumbold’. Scale bar in (j) shows 100 µm.
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Table 1-2. Heights and widths of adaxial epidermal cells of petals.
'Fidalgo Blacky'
44.6 ± 2.4
30.4 ± 0.9
1.47 ± 0.05
'Ms. Noir'
81.2 ± 5.0
43.7 ± 3.8
1.87 ± 0.08
'Kokucho'
48.6 ± 0.6
30.4 ± 1.4
1.61 ± 0.09
'Black Cat'
55.5 ± 3.0
36.6 ± 1.3
1.53 ± 0.13
'Kokucho' (purple)
62.3 ± 0.7
34.9 ± 1.5
1.80 ± 0.07
'Cupid'
54.9 ± 2.6
52.9 ± 2.8
1.04 ± 0.05
'Yukino'
52.9 ± 2.3
30.5 ± 2.4
1.77 ± 0.17
'Super Girl'
64.3 ± 2.8
37.8 ± 3.8
1.73 ± 0.11
'Atom'
71.6 ± 2.5
42.8 ± 1.2
1.67 ± 0.02
'Evelyn Rumbold'
58.8 ± 4.6
33.9 ± 2.4
1.73 ± 0.06
Date represent the average ± SE of three cells.
Flower color
Black
Purple
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Table 1-3. Petal cellular pHs of each cultivar.
Flower color
Cultivars
pH
'Fidalgo Blacky'
4.97 ± 0.03
'Ms. Noir'
5.13 ± 0.03
'Kokucho'
4.92 ± 0.03
'Black Cat'
5.08 ± 0.06
'Kokucho' (purple)
5.01 ± 0.02
'Cupid'
5.42 ± 0.03
'Yukino'
5.16 ± 0.02
'Super Girl'
5.35 ± 0.01
'Atom'
5.44 ± 0.02
'Evelyn Rumbold'
5.50 ± 0.02
Data represent the average ± SE of three replications.
Black
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Fig. 1-5. Contents of flavonoid aglycones in petals of black and purple cultivars. Ap: apigenin, Lt: luteolin, Pg: pelargonidin, Cy: cyanidin. Data represent the average ± SE of each flavonoid (three biological replications; the data of ‘Cupid’ represent two biological replications).
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 'F idalgo Bl acky' 'M s. N oir ' 'Ko kucho' 'Blac k Cat' 'Cupi d' 'Yu kino' 'Su per G irl' 'A to m' 'Ev elyn Rumbo ld' C onte nts of flavo noid ag ly cones (m g·100 m g -1 F. W .) Ap Lt Pg Cy
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Fig. 1-6. Contents of flavonoid aglycones in petals of ‘Kokucho’ and ‘Kokucho’ (purple) at four developmental stages.
(a) ‘Kokucho’, (b) ‘Kokucho’ (purple), (c) the amounts of each aglycone in the ‘Kokucho’ and ‘Kokucho’ (purple) at S3. Ap: apigenin, Lt: luteolin, Pg: pelargonidin, Cy: cyanidin. Four petal developmental stages; S1: uncolored, S2: half colored, S3: co mpletely colored and folded, S4: completely colored and unfolded. Data represent the average ± SE of each flavonoid (three biological replications). Statistical analysis was performed with Mann-Whitney U test. * P<0.05, N.S. not significant. 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 S1 S2 S3 S4 C onte n ts o f fl av ono id a gl yc ones (m g· 10 0 mg -1 F. W .) Petal stage Ap Lt Pg Cy 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 S1 S2 S3 S4 C onten ts o f fla vo noi d ag ly cone s (m g· 100 m g -1 F. W .) Petal stage Ap Lt Pg Cy
(a)
(b)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Pg Cy Ap Lt C o nt ents of fla vo no id a gl yc ones (mg ·1 00 mg -1 F. W .) 'Kokucho' 'Kokucho' (purple)＊
＊
＊
N. S.(c)
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第 3 節 黒 色 系 ダ リ ア に お け る 色 素 蓄 積 の 遺 伝 子 制 御 の 調 査 〈 材 料 お よ び 方 法 〉
フ ラ ボ ン 合 成 酵 素 遺 伝 子 （DvFNS） の シ ー ク エ ン ス 解 析
フ ラ ボ ン 合 成 に 関 与 す る DvFNS の cDNA 全 長 配 列 お よ び ゲ ノ ム 全 長 配 列 を シ ー ク エ ン ス 解 析 に よ り 決 定 し た ． 全 RNA の 抽 出 に は Sepasol®-RNA I Super G（ ナ カ ラ イ テ ス ク ）を 用 い た ．cDNA の 合 成 に は ReverTra Ace（ 東 洋 紡 ）を 用 い た ．全 RNA 50 ng・µL- 1を テ ン プ レ ー ト と し て 用 い ，oligo(dT)プ ラ イ マ ー を 用 い て 逆 転 写 し た ．DNA は MagExtractorT M -Plant Genome-（ 東 洋 紡 ） あ る い は 修 正 CTAB 法 （Murray・ Thompson， 1980） に よ り 抽 出 し た ．
‘ 雪 乃 ’ の cDNA， ‘ 黒 蝶 ’ お よ び ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 の DNA を テ ン プ レ ー ト に 全 長 プ ラ イ マ ー （ 第 1-4 表 ） を 用 い て PCR を 行 い ， ク ロ ー ニ ン グ し た 後 ， シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 っ た ．PCR の 酵 素 に は Blend Taq（ 東 洋 紡 ） を 用 い た ． TA ク ロ ー ニ ン グ に は DynaExpress TA PCR Cloning Kit（ バ イ オ ダ イ ナ ミ ク ス 研 究 所 ） を 使 用 し た ．Applied BiosystemsT M BigDye terminator v3.1 cycle sequencing kit（ Thermo Fisher Scientific） を 用 い て サ ン プ ル を 調 製 し ， Applied BiosystemsT M ABI PRISM® 3100 Genetic analyzer（ Thermo Fisher Scientific） で シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 っ た ．
‘ 雪 乃 ’ の DvFNS cDNA 配 列 お よ び ‘ 黒 蝶 ’ の DvFNS ゲ ノ ム 配 列 か ら ‘ 黒 蝶 ’ に お け る 推 定 DvFNS cDNA 配 列 を 決 定 し た ． 使 用 し た プ ラ イ マ ー は 第 1-4 表 に 示 し た と お り で あ る ． ま た ，DvFNS の 全 長 プ ラ イ マ ー を 用 い て ， EmeraldAmp® PCR Master Mix（ タ カ ラ バ イ オ ） で ゲ ノ ミ ッ ク PCR を 行 い ， 黒 色 系 品 種 お よ び 赤 紫 色 系 品 種 に お け る ゲ ノ ム 配 列 の 有 無 を 確 認 し た ． フ ラ ボ ノ イ ド の 合 成 お よ び 蓄 積 に 関 与 す る 遺 伝 子 の 発 現 量 の 調 査 黒 色 系 4 品 種 ， 赤 紫 色 系 5 品 種 お よ び ‘ 黒 蝶 ’ の 赤 紫 色 個 体 の cDNA を A.C. Milli-Q 水 で 50 倍 希 釈 し た も の を テ ン プ レ ー ト と し て 用 い た ． Real-time RT-PCR に よ り ， フ ラ ボ ン 合 成 に 関 与 す る DvFNS， ア ン ト シ ア ニ ン 合 成 に 関 与 す る 転 写 因 子 DvIVS，カ ル コ ン 合 成 酵 素 遺 伝 子（ DvCHS1，DvCHS2），カ ル コ ン 異 性 化 酵 素 遺 伝 子 （DvCHI） ， フ ラ バ ノ ン 3-水 酸 化 酵 素 遺 伝 子 （ DvF3H） ， ジ ヒ ド ロ フ ラ ボ ノ ー ル 4-還 元 酵 素 遺 伝 子（ DvDFR），ア ン ト シ ア ニ ジ ン 合 成 酵 素 遺 伝 子（ DvANS）， ア ン ト シ ア ニ ジ ン グ ル コ ー ス 転 移 酵 素 遺 伝 子 （ anthocyanidin 3-glucosyltransferase: Dv3GT） お よ び ア ン ト シ ア ニ ン 3-マ ロ ニ ル 基 転 移 酵 素 遺 伝 子 （anthocyanin 3-malonyltransferase: Dv3MT） ， シ ア ニ ジ ン お よ び ル テ オ リ ン 合 成 に 関 与 す る フ ラ ボ ノ イ ド 3'水 酸 化 酵 素 遺 伝 子 （DvF3'H）お よ び 液 胞 輸 送 に 関 与 す る グ ル タ チ オ ン S-転 移 酵 素 遺 伝 子 （ glutathione S-transferase: DvGST） の 発 現 量 を 調 査 し た ．PCR の 試 薬 に は SYBR® Premix Ex Taq T M II（ タ カ ラ バ イ オ ）を 用 い て ，
21
Applied BiosystemsT M 7900HT Fast Real-ti me PCR System（ Thermo Fisher Scientific） で 解 析 を 行 っ た ．プ ロ グ ラ ム は｛（95℃・10 秒 ）→［（ 95℃・10 秒 ），（60℃・30 秒 ）］ ×40 サ イ ク ル →95℃ （ 15 秒 ） →60℃ （ 15 秒 ） →72℃ （ 15 秒 ）｝ と し た ． 使 用 し た プ ラ イ マ ー は 第 1-5 表 に 示 し た と お り で あ る ． 発 達 ス テ ー ジ 別 の 花 弁 を 用 い た 予 備 実 験 に お い て 最 も 発 現 が 高 か っ た ス テ ー ジ（DvFNS お よ び DvF3'H；S2，そ の 他 の 遺 伝 子 ；S3） の 花 弁 cDNA を 用 い た ． 各 遺 伝 子 に つ い て の 検 量 線 は ‘ 雪 乃 ’ の cDNA の 希 釈 系 列 を 用 い て 作 成 し た ． 内 部 標 準 に は DvActin を 用 い た ．
DvFNS の small interfering RNA（ siRNA） の 検 出 ［ ノ ー ザ ン ブ ロ ッ ト 解 析 ］ 各 品 種 お よ び ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 の S2 花 弁 か ら 抽 出 し た 全 RNA を 用 い て ， ノ ー ザ ン ブ ロ ッ ト 解 析 に よ り DvFNS の siRNA を 検 出 し た ． 解 析 は 以 下 の 手 順 に し た が い 行 っ た ． ⅰ) プ ロ ー ブ の 作 成 ① プ ラ ス ミ ド DNA の 抽 出 ② 制 限 酵 素 処 理 ③ フ ェ ノ ー ル ・ ク ロ ロ ホ ル ム 抽 出 お よ び エ タ ノ ー ル 沈 殿 ④ ジ ゴ キ シ ゲ ニ ン （DIG） を 用 い た RNA ラ ベ リ ン グ ⅱ)炭 酸 バ ッ フ ァ ー に よ る プ ロ ー ブ の 切 断 ⅲ)ノ ー ザ ン ブ ロ ッ ト 解 析 ① ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動 ② エ レ ク ト ロ ト ラ ン ス ブ ロ ッ テ ィ ン グ ③UV ク ロ ス リ ン ク ④ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン ⑤ 洗 浄 お よ び 検 出 各 段 階 の 詳 細 は 以 下 の と お り で あ る ． ⅰ) プ ロ ー ブ の 作 成 ① プ ラ ス ミ ド DNA の 抽 出 ‘ 黒 蝶 ’ か ら 全 RNA を 抽 出 し ， RT 反 応 に よ り cDNA を 作 成 し た ． DvFNS の 全 長 プ ラ イ マ ー （ 第 1-4 表 ） を 用 い て RT-PCR を 行 い ， PCR 産 物 を ク ロ ー ニ ン グ し た ． 大 腸 菌 か ら QuickGene Plasmid kit S II（ PL-S2） （ 倉 敷 紡 績 ） を 用 い て プ ラ ス ミ ド DNA を 抽 出 し た ．
② 制 限 酵 素 処 理
抽 出 し た プ ラ ス ミ ド DNA 3 μg を テ ン プ レ ー ト と し て ， 37℃ で 1 時 間 ， 制 限 酵 素 処 理 を 行 っ た ． 酵 素 は HindⅢ （ タ カ ラ バ イ オ ） を 用 い た ．
22 ③ フ ェ ノ ー ル ・ ク ロ ロ ホ ル ム 抽 出 お よ び エ タ ノ ー ル 沈 殿 制 限 酵 素 処 理 を 行 っ た サ ン プ ル の フ ェ ノ ー ル ・ ク ロ ロ ホ ル ム 抽 出 a )お よ び エ タ ノ ー ル 沈 殿 b )を 行 い ，13 μL の A.C. Milli-Q 水 に 溶 解 し た ． a)フ ェ ノ ー ル ・ ク ロ ロ ホ ル ム 抽 出 サ ン プ ル 100 μL に A.C. Milli-Q 水 100 μL を 加 え て 200 μL と し ， phenol/chloroform/isoamyl alcohol を 等 量（ 200 μL）加 え voltex に か け た ．20,600 ×g， 4℃ で 15 分 間 遠 心 分 離 し ， 上 清 を 回 収 し た ． b)エ タ ノ ー ル 沈 殿 サ ン プ ル の 0.01 倍 量 の グ リ コ ー ゲ ン ，0.1 倍 量 の 3M 酢 酸 ナ ト リ ウ ム（ pH5.2） お よ び 2.5 倍 量 の 100％ エ タ ノ ー ル を 加 え -20℃ で 30 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た ．20,600 ×g，4℃ で 20 分 間 遠 心 分 離 し ，上 清 を 捨 て ，70%エ タ ノ ー ル を 1 mL 加 え た ．20,600 ×g で 5 分 間 遠 心 分 離 し ， 上 清 を 捨 て ， 減 圧 乾 燥 し た ． ④DIG を 用 い た RNA ラ ベ リ ン グ
1. テ ン プ レ ー ト DNA 13μL 全 量 を 使 用 し た ． DIG RNA Labeling Kit（ ロ シ ュ ・ ダ イ ア グ ノ ス テ ィ ッ ク ス ） を 用 い て ，37℃ ， 2 時 間 の イ ン キ ュ ベ ー ト に よ り ラ ベ リ ン グ を 行 っ た ． 2. 0.2M EDTA（ pH8.0） 2 μL を 加 え て 反 応 を 停 止 さ せ た ． 3. エ タ ノ ー ル 沈 殿 を 行 い ， 最 終 濃 度 が 100 ng/μL と な る よ う に A.C. Milli-Q 水 に 溶 解 し た ． ⅱ)炭 酸 バ ッ フ ァ ー に よ る プ ロ ー ブ の 切 断 1. 約 15 µg の RNA プ ロ ー ブ に 等 量 の 炭 酸 バ ッ フ ァ ー を 加 え ， 60℃ で イ ン キ ュ ベ ー ト し た ． イ ン キ ュ ベ ー ト 時 間 は 以 下 の 計 算 式 に よ り 求 め た ． T=(Li-Lf)/(kLiLf) T＝ 時 間 （ 分 ） ， Li＝ プ ロ ー ブ の 最 初 の 長 さ Lf＝ プ ロ ー ブ の 最 終 的 な 長 さ ， ｋ ＝ 定 数 （ 0.11kb/分 ） 今 回 は 150bp に 切 断 す る た め ， T＝ (1.545-0.15)/(0.11・1.545・0.15)に よ り 55 分 間 の イ ン キ ュ ベ ー ト を 行 っ た ． ＊ 炭 酸 バ ッ フ ァ ー 組 成 （pH10.2） 60mM Na2CO3 40mM NaHCO3 2. 10％ 酢 酸 10 μL を 加 え 反 応 を 停 止 さ せ た ． 3. エ タ ノ ー ル 沈 殿 を 行 い ， 20 μL の A.C. Milli-Q 水 に 溶 解 し た ． ⅲ)ノ ー ザ ン ブ ロ ッ ト 解 析 ① ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動
23 1. 15%ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル の 作 成 尿 素 21.021 g Tris 0.27 g ホ ウ 酸 0.1375 g を 計 量 し ，A.C.
Milli-Q 水 で 18 mL に フ ィ ル ア ッ プ し た ．電 子 レ ン ジ で 暖 め て
溶 解 し ， 以 下 の 試 薬 を 加 え た ． 0.5 M EDTA (pH8.0) 200 μL 40% ア ク リ ル ア ミ ド /BIS (19:1) 18.75 mL 10% ペ ル オ キ ソ 二 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム 170 μL A.C. Milli-Q 水 で 50 mL に フ ィ ル ア ッ プ し て よ く 混 和 し ， N,N,N,N-テ ト ラ メ チ ル ジ ア ミ ン （TEMED） 20 μL を 加 え ， ゲ ル 板 に 流 し 込 ん だ ． 2. サ ン プ ル の 調 整全 RNA 10 μg を 使 用 し た ． 等 量 の loading dye を 加 え ， 65℃ で 10 分 間 変 性 処 理 を し た 後 ， 氷 上 で 急 冷 し た ． ＊ loading dye 組 成 2×loading dye 98% Formamide 10mM EDTA (pH8.0) 1mg/mL キ シ レ ン シ ア ノ ー ル FF 1mg/mL ブ ロ モ フ ェ ノ ー ル ブ ル ー (BPB) 3. 電 気 泳 動 泳 動 に は 0.5×TBE バ ッ フ ァ ー を 用 い た ． サ ン プ ル を ア プ ラ イ す る 前 に シ リ ン ジ を 用 い て 析 出 し た 尿 素 を 除 去 し た ．150 V で 5 時 間 程 度 ，BPB が ゲ ル の 下 端 に 達 す る ま で 泳 動 し た ． ② エ レ ク ト ロ ト ラ ン ス ブ ロ ッ テ ィ ン グ 0.5×TBE バ ッ フ ァ ー 中 で 石 綿 ， ろ 紙 ， ゲ ル ， メ ン ブ レ ン ， ろ 紙 ， 石 綿 を こ の 順 に 重 ね ，プ レ ー ト で 挟 ん だ ．0.5×TBE バ ッ フ ァ ー 中 で 15 V，4℃ ，一 晩 ブ ロ ッ テ ィ ン グ し た ． ブ ロ ッ テ ィ ン グ 終 了 後 ， メ ン ブ レ ン を 20×SSC に 浸 し た ろ 紙 の 上 に 30 分 間 静 置 し ， 平 衡 化 し た 後 ， 風 乾 し た ． ③UV ク ロ ス リ ン ク メ ン ブ レ ン CROSS LINKER XL-200（ タ イ テ ッ ク ） を 用 い て 254 V， 0.12 J/cm2 の UV を 照 射 し ， ク ロ ス リ ン ク し た ．
24 ④ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン
1. プ レ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン
メ ン ブ レ ン を 40℃ に 予 熱 し た DIG Easy Hyb Granules （ ロ シ ュ ・ ダ イ ア グ ノ ス テ ィ ッ ク ス ）5 mL 中 で ， 40℃ ， 20 rpm で 30 分 間 以 上 振 と う し た ．
2. ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン
予 熱 し た DIG Easy Hyb Granules 7 mL に プ ロ ー ブ 溶 液 を 加 え て ， プ レ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 溶 液 と 入 れ 換 え た ．40℃ で 一 晩 ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を 行 っ た ． ⑤ 洗 浄 お よ び 検 出 メ ン ブ レ ン を 以 下 の と お り に 洗 浄 し ， 抗 体 反 応 を 行 っ た 後 ， バ ン ド の 検 出 を 行 っ た ． 1. 低 ス ト リ ン ジ ェ ン シ ー バ ッ フ ァ ー で 室 温 に お い て 5 分 間 ×2 回 洗 浄 し た ． ＊ 低 ス ト リ ン ジ ェ ン シ ー バ ッ フ ァ ー 組 成 2×SSC 0.1% SDS ＊1×SSC 組 成 0.15 M NaCl 0.015 M ク エ ン 酸 Na・ 2H2O 2. 高 ス ト リ ン ジ ェ ン シ ー バ ッ フ ァ ー で 40℃ に お い て 15 分 間 ×2 回 洗 浄 し た ． ＊ 高 ス ト リ ン ジ ェ ン シ ー バ ッ フ ァ ー 組 成 0.1×SSC 0.1% SDS 3. 洗 浄 バ ッ フ ァ ー で 室 温 に お い て 1～ 2 分 間 洗 浄 し た ． ＊ 洗 浄 バ ッ フ ァ ー 組 成 0.1 M マ レ イ ン 酸 0.15 M NaCl (pH 7.5) 0.3%(v/v) Tween20 4. ブ ロ ッ キ ン グ 溶 液 中 で 室 温 に お い て 30 分 間 振 と う し た ． 10×ブ ロ ッ キ ン グ 溶 液 を マ レ イ ン 酸 で 1×に 希 釈 し て 用 い た ． 5. 抗 体 溶 液 中 で 室 温 に お い て 30 分 間 振 と う し た ．
抗 体 溶 液 は ブ ロ ッ キ ン グ 溶 液 20 mL に Anti-DIG-AP Fab Fragments（ ロ シ ュ ・ ダ イ ア グ ノ ス テ ィ ッ ク ス ） を 4 μL 加 え て 作 成 し た ．
6. 洗 浄 バ ッ フ ァ ー で 15 分 間 ×2 回 洗 浄 し た ． 7. 検 出 バ ッ フ ァ ー 中 で 3 分 間 平 衡 化 し た ．
25 ＊ 検 出 バ ッ フ ァ ー 組 成 0.1 M Tris-HCl(pH 9.5) 0.1 M NaCl 8. CDP-Star を メ ン ブ レ ン に 滴 下 し ，LAS-3000mini（ 富 士 フ イ ル ム ）を 用 い て バ ン ド を 検 出 し た ． small RNA の DvFNS へ の マ ッ ピ ン グ
‘ 黒 蝶 ’ を 供 試 し た ．S2 花 弁 200 mg か ら Applied BiosystemsT M MirVana miRNA Isolation Kit（ Thermo Fisher Scientific） を 用 い て small RNA を 抽 出 し た ． 次 世 代 シ ー ク エ ン サ ーIllumina HiSeq 2000（ Illumina） に よ り small RNA を 網 羅 的 に 検 出 し た ． 得 ら れ た small RNA 配 列 の う ち 18-32 nt の small RNA を ‘ 黒 蝶 ’ の DvFNS ゲ ノ ム 配 列 に つ い て ， セ ン ス 方 向 お よ び ア ン チ セ ン ス 方 向 に ミ ス マ ッ チ 0 の 条 件 で マ ッ ピ ン グ し た ． ま た ，DvFNS を 赤 紫 色 系 品 種 と 同 程 度 発 現 し ， フ ラ ボ ン を 蓄 積 す る 赤 白 複 色 系‘ 結 納 ’の 花 弁 か ら 抽 出 し た small RNA（ Ohno ら ，2011b）も 同 様 に ‘ 黒 蝶 ’ の DvFNS ゲ ノ ム 配 列 へ マ ッ ピ ン グ し た ．
26
Table 1-4. Primers for sequence analysis and genomic PCR of DvFNS
Name Orientation Sequence(5'-3')
FNS Full-F (for sequence) sense TCTCATCTTACCATGAATACACT
FNS Full-R (for sequence) antisense GCGAAGGGAAACACACTAGATTCG
FNS Full-F (for genomic PCR) sense CCATGAATACACTCCTAGTACTCC
FNS Full-R (or genomic PCR) antisense ATAAAGGACTATCACCAACGG
FNS-1161R antisense ATATCCGGATTTAACACTCACA
FNS-488F sense CAAACAAAATGAGAGTGTGAA
FNS-800F sense ATGGCAAAGGGAAAGATTTTCTAGA
FNS-942R antisense TATTATTACTGCGGTTGTGTCTGTT
FNS-IntF1 sense ACGTGTGAGTTGAGCATCCCGAAT
FNS-IntR1 antisense TAATCTTGAAATAATTAAGA
FNS-IntR2 antisense TGTGCGTTAAAAATCTAGGGTCAT
FNS 3’Race sense GCTGGAACAGACACAACCGCAGTA
FNS 3’Race-1 sense ATGTTATTCGTAAACATTT
FNS 3’Race-1R antisense ACCTCGTTCATCCATATT
FNS 3’Race-2F sense AATATGGATGAACGAGGT
FNS 3’Race-nested sense CCCTATGGTCATGGAAAAAGCAAA
FNS 5’Race antisense CTCACATTTTCATTTGACTTCCGTA
FNS 5’Race-1F antisense AATCCACCTCCGTCTCGGTT
FNS 5’Race-1R antisense ATATCCTCGTACCTCTTCTT
FNS 5’Race-nested antisense GGTGGATGAAGTCGGAAGGCTTCT
Table 1-5. Sequences of primers for real-time RT-PCR.
Gene Forward primer (5'-3') Reverse primer (5'-3')
DvIVS CATAACCCAAGTAAAGAAAGCCATT CATCCATTTTTAAATTGTTTGTGGT
DvCHS1 CATGTGCTAAGCGAATACGG CCTCTCCGGTGGTATTGAAC
DvCHS2 TGTCCCAACTACCATGCCGATTTC TTACACATTAAAATGACACAGTGA
DvCHI AGAAGCTGGGAATGCAGTGT GAGATCTGAGAGCCTTGATGC
DvF3H TTGGAGGGAGATTGTGACCT GGCCCATTAACTCCTTGCTA
DvDFR CAACTTCCGGTCTATGACGAG TTTCGGCCAATGTTTTTGAC
DvANS GCTCCAACTCTTCTACAACG GAAATCCTGACCTTCTCCTT
Dv3GT AAACATCACCCTTCTTACTCT TTGAAAAGCGCGATGGATGTT
Dv3MT AAATACGAAGTTGTTTCAATC TTGCACTTTCTAATCCATCAT
DvGST ATGTGGTGGGATGATATTTCAAACA AACATTTATTTGTGAGTCACATACA
DvF3'H TCGGCTTCGTTGACGTGGTG TACGGTGCAAACACCAGATCC
DvFNS GTGTGTTTCCCTTTGCTTCGTAAAA GCGAAGGGAAACACACTAGATTCGT
27 〈 結 果 〉 DvFNS の 塩 基 配 列 ゲ ノ ミ ッ ク PCR の 結 果 ， す べ て の 黒 色 系 品 種 で 赤 紫 色 系 品 種 と 同 様 に DvFNS の バ ン ド が 確 認 で き た （ 第 1-7 図 ） ．‘ 黒 蝶 ’ の DvFNS の ゲ ノ ム 配 列 は 1 種 類 で あ っ た （AB769841 ） ． ゲ ノ ム 配 列 か ら 推 定 さ れ た ‘ 黒 蝶 ’ の DvFNS cDNA （AB769842）は 1,545 bp で あ り 514 の ア ミ ノ 酸 を コ ー ド し て い た ．こ の ア ミ ノ 酸 配 列 は ガ ー ベ ラ（Garbera hybrida）の FNS II（ AAD39549）（ Martens・ Forkmann， 1999 ） と 70 ％ の 相 同 性 を 示 し ， ダ イ ズ （ Glycine max ） の FNS II （ ACV65037 ） （Flieg mann ら ，2010）お よ び リ ン ド ウ（ Gentiana triflora）の FNS II（ BAD91809） （Nakatsuka ら ， 2005 ） と そ れ ぞ れ 56 ％ お よ び 54％ の 相 同 性 を 示 し た ． ま た ， D.variabilis‘ Feuerschein’ か ら 単 離 さ れ た FNS（ ADM67335 ） （ Thill ら ， 2012） と は 完 全 に 一 致 し た ． ‘ 黒 蝶 ’ の DvFNS ゲ ノ ム 配 列 （AB769841）に は 1,150 bp の イ ン ト ロ ン が 一 つ 含 ま れ て い た ．‘ 黒 蝶 ’ と ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 と で DvFNS ゲ ノ ム 配 列 は 完 全 に 一 致 し た ． 遺 伝 子 発 現 量 DvFNS は 赤 紫 色 系 品 種 お よ び ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 で は 十 分 な 発 現 が 確 認 さ れ た の に 対 し ， 黒 色 系 品 種 で は ほ と ん ど 発 現 し て い な か っ た （ 第 1-8 図 ） ． ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 の DvFNS 発 現 量 は ‘ 黒 蝶 ’ の 44 倍 で あ っ た ．
DvIVS お よ び DvIVS が 発 現 制 御 す る DvCHS1， DvF3H， DvDFR， DvANS の 発 現 量 は ， 黒 色 系 品 種 で は あ る 程 度 高 か っ た （ 第 1-9 図 ） ． し か し ， 黒 色 系 ‘ ミ ズ ノ ア ー ル ’ と 赤 紫 色 系 ‘ ス ー パ ー ガ ー ル ’ は ア ン ト シ ア ニ ン の 総 蓄 積 量 が ほ と ん ど 同 等 で あ っ た に も 関 わ ら ず ， こ れ ら の 遺 伝 子 の 発 現 量 は ‘ ス ー パ ー ガ ー ル ’ で 高 く ， 他 の 黒 色 系 品 種 も ア ン ト シ ア ニ ン の 総 蓄 積 量 に 対 し て 相 対 的 に 遺 伝 子 発 現 量 が 低 い 傾 向 に あ っ た ．DvCHS2，DvCHI，Dv3GT，Dv3MT，DvF3'H お よ び DvGST の 発 現 量 も 黒 色 系 品 種 で 高 い わ け で は な か っ た （ 第 1-9 図 ） ． ま た ， ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 で は ア ン ト シ ア ニ ン 合 成 経 路 上 の 下 流 の 遺 伝 子 で あ る DvF3H ， DvDFR ， DvANS， Dv3GT お よ び Dv3MT の 発 現 量 が ‘ 黒 蝶 ’ と 比 較 し て 低 か っ た が ， DvIVS の 発 現 量 が 低 く な っ て い る わ け で は な く ， 合 成 経 路 上 流 の 遺 伝 子 の 発 現 量 も 低 く は な か っ た （ 第 1-9 図 ） ． DvFNS の siRNA ノ ー ザ ン ブ ロ ッ ト 解 析 の 結 果 ， 黒 色 系 ‘ 黒 蝶 ’ お よ び ‘ ブ ラ ッ ク キ ャ ッ ト ’ で は 20 nt 付 近 に 明 確 な バ ン ド が 確 認 さ れ た （ 第 1-10 図 ） ． ま た ， 黒 色 系 品 種 ‘ フ ィ ダ ル ゴ ブ ラ ッ キ ー ’ お よ び ‘ ミ ズ ノ ア ー ル ’ で も 同 様 の バ ン ド が う す く 検 出 さ れ た ． 一 方 で ， 赤 紫 色 系 5 品 種 お よ び ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 で は バ ン ド は 確 認 さ れ
28 な か っ た ．
small RNA の DvFNS へ の マ ッ ピ ン グ
‘ 黒 蝶 ’ の 花 弁 か ら 抽 出 し た small RNA 全 14,895,667 リ ー ド の う ち ，9,368,245 リ ー ド が 18-32 nt で あ っ た ．こ の う ち ，11,574 が ‘ 黒 蝶 ’ の DvFNS ゲ ノ ム 配 列 に マ ッ ピ ン グ さ れ た （ 第 1-11 図 a） ． マ ッ ピ ン グ さ れ た small RNA で 21 nt の も の は 10,279 リ ー ド で あ り ， そ の 多 く が DvFNS の エ キ ソ ン 2 に マ ッ ピ ン グ さ れ て い た ．DvFNS ゲ ノ ム 配 列 の 2,307 番 目 の 塩 基 か ら 2,327 番 目 の 塩 基 ま で と 一 致 す る 21 nt の ア ン チ セ ン ス small RNA が 最 も 多 く マ ッ ピ ン グ さ れ （ 4,192 リ ー ド ） ， マ ッ ピ ン グ さ れ た 全 リ ー ド の 約 40％ を 占 め て い た ． ま た ， 赤 白 複 色 系 ‘ 結 納 ’ の 花 弁 か ら 抽 出 し た small RNA は ，‘ 黒 蝶 ’ の DvFNS ゲ ノ ム 配 列 に ほ と ん ど マ ッ ピ ン グ さ れ な か っ た （ 全 17,455,041 リ ー ド 中 674 リ ー ド ， 第 1-11 図 b） ．
29
Fig. 1-7. Genomic PCR for full length of DvFNS.
The bands indicated by an arrow are full length of DvFNS.
1: ‘Fidalgo Blacky’, 2: ‘Ms. Noir ’, 3: ‘Kokucho’, 4: ‘Black Cat’, 5: ‘Kokucho’ (purple), 6: ‘Cupid’, 7: ‘Yukino’, 8: ‘Super Girl’, 9: ‘Ato m’ and 10: ‘Evelyn Rumbold’.
30
Fig. 1-8. Relative transcript abundance of DvFNS.
All data represent average ± SE (three biological replications) relative to the expression level of ‘Yukino’.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
DvFN
S
/
DvA
ct
in
31
Fig. 1-9. Relative transcript abundance of the genes involved in anthocyanin synthesis and vacuolar sorting.
(a) DvIVS, (b) DvCHS1, (c) DvCHS2, (d) DvCHI, (e) DvF3H, (f) DvDFR, (g) DvANS, (h) Dv3GT, (i) Dv3MT, (j) DvGST, (k) DvF3'H. All data represent the average ± SE [three biological replications; The data of ‘Kokucho’ (purple) is from five biological replications]. Data represent the expression level relative to the maximu m data [‘Kokucho’ (purple) for DvIVS and DvCHS2, ‘Yukino’ for DvCHS1, DvF3H, DvDFR, DvANS, Dv3GT and Dv3MT, ‘Kokucho’ for DvCHI, ‘Black Cat’ for DvGST and DvF3'H). 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Dv CHS2 / Dv Acti n 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 DvCHI / Dv Acti n 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Dv CHS1 / Dv Acti n 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 DvF 3 H / DvAc tin 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 Dv DFR / Dv Ac tin 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 Dv IVS / Dv Acti n
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
32
Fig. 1-9. Relative transcript abundance of the genes involved in anthocyanin synthesis and vacuolar sorting (continued).
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Dv AN S / Dv Ac tin 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 DvGS T / DvActin 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 Dv3 G T / DvActin 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 Dv 3M T / Dv Ac tin
(g)
(h)
(i)
(j)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 DvF3 'H / DvA ct in(k)
33
Fig. 1-10. RNA gel blot hybridization for DvFNS siRNA detection.
1: ‘Fidalgo Blacky’, 2: ‘Ms. Noir ’, 3: ‘Black Cat’, 4: ‘Kokucho’, 5: ‘Kokucho’ (purple), 6: ‘Super Girl’, 7: ‘Yukino’, 8: ‘Cupid’, 9: ‘Evelyn Rumbold’, and 10: ‘Atom’. Ribosomal RNA on the electrophoresed gel is shown in the lower photograph, which was rearranged to conform align ment of cultivars to the upper photograph.
34
Fig. 1-11. Mapping of small RNAs on DvFNS genome.
Small RNAs (18–32 nt long) without mismatch to ‘Kokucho’ DvFNS DNA were mapped on either the sense strand (red: above the X-axis) or the antisense strand (blue: below the X-axis). (a) small RNAs extracted from petals of ‘Kokucho’. (b) small RNAs extracted from petals of a red-white bicolor cultivar, ‘Yuino’ (Ohno et al. 2011b) in which DvFNS is expressed si milar to purple cultivars.
-600 -500 -400 -300 -200 -100 0 0 100 200
Exon 1 Intron Exon 2
100 bp Num be r o f ma tc hed r ead s pe r mi lli on rea ds (1 8-32 n t)
(b) ‘Yuino’
-600 -500 -400 -300 -200 -100 0 0 100 200Exon 1 Intron Exon 2
100 bp Number of ma tched r ead s per m illi on r eads (18-32 nt)
(a) ‘Kokucho’
35 第 4 節 考 察 黒 色 系 ダ リ ア の 定 義 付 け 各 品 種 お よ び ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 の 花 弁 の 測 色 結 果 （ 第 1-1 表 ， 第 1-1 図 ） か ら ，ダ リ ア の 黒 色 系 品 種 は 他 色 系 品 種 と 比 較 し て 花 弁 L*が 最 も 低 い 品 種 群 で あ る と 定 義 で き ，さ ら に C*が 低 い ほ ど よ り 黒 味 が 強 い と 考 え ら れ た ．第 1 章 の 以 降 の 実 験 で は 主 に L*を 花 色 の 指 標 と し て 使 用 す る こ と と し た ． 黒 色 系 品 種 に 特 異 的 な 色 素 蓄 積 黒 色 系 品 種 と 赤 紫 色 系 品 種 間 に お け る 色 素 蓄 積 量 の 比 較 か ら ，黒 色 系 品 種 に は ， ① ア ン ト シ ア ニ ン 総 蓄 積 量 が 比 較 的 多 い ， ② シ ア ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン の 蓄 積 量 が 多 い（ 割 合 が 高 い ），③ フ ラ ボ ン を 蓄 積 し て い な い ，と い う 3 つ の 特 徴 が あ る こ と が わ か っ た（ 第 1-5 図 ）．一 般 的 に ア ン ト シ ア ニ ン 総 蓄 積 量 が 多 い ほ ど 組 織 の 色 は 濃 色 に な る た め ， 花 弁 で の 黒 色 発 現 は ア ン ト シ ア ニ ン 総 蓄 積 量 が 多 い こ と に 起 因 し て い る と 考 え ら れ て き た ． し か し ， 各 品 種 の ア ン ト シ ア ニ ン 総 蓄 積 量 と 花 弁 L*と の 間 に は 負 の 相 関 が み ら れ た も の の （ r = -0.604）， ア ン ト シ ア ニ ン 総 蓄 積 量 が 黒 色 系 品 種 よ り も 多 い 赤 紫 色 系 品 種 （‘ 雪 乃 ’ お よ び ‘ ス ー パ ー ガ ー ル ’） が 存 在 し た こ と か ら ， ア ン ト シ ア ニ ン 総 蓄 積 量 が 多 い こ と の み で は 花 弁 黒 色 化 の 条 件 は 満 た さ れ な い こ と が 示 唆 さ れ た ． 黒 色 系 品 種 は 総 じ て シ ア ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン の 蓄 積 量 が 多 く ， 蓄 積 量 が 多 い 品 種 ほ ど 花 弁 L*が 低 か っ た ．よ っ て ，シ ア ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン は ペ ラ ル ゴ ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン よ り も 花 弁 L* の 低 下 に 強 く 寄 与 す る 可 能 性 が 考 え ら れ た ． ま た ， 黒 色 系 お よ び 赤 紫 色 系 9 品 種 に お け る シ ア ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン 蓄 積 量 と 花 弁 L*と の 間 の 相 関 係 数 は -0.689 で あ り ，ア ン ト シ ア ニ ン 総 蓄 積 量 と 花 弁 L*間 よ り も 強 い 相 関 を 示 し た こ と か ら ， シ ア ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン 蓄 積 量 は 花 弁 L*の 低 下 ，す な わ ち 花 弁 黒 色 化 に 強 く 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た ．し か し ， シ ア ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン を 黒 色 系 品 種 と 同 程 度 蓄 積 し て い た‘ キ ュ ー ピ ッ ト ’ は 黒 色 を 示 さ ず ， こ れ は ‘ キ ュ ー ピ ッ ト ’ の ア ン ト シ ア ニ ン 総 蓄 積 量 が 少 な い た め で あ る と 考 え ら れ た ． 以 上 の こ と か ら ， ア ン ト シ ア ニ ン 総 蓄 積 量 が 比 較 的 多 い こ と ， お よ び シ ア ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン 蓄 積 量 が 多 い こ と は ， い ず れ も 花 弁 が 黒 色 を 示 す た め に 必 要 な 条 件 で あ る と 考 え ら れ た ． フ ラ ボ ン は 無 色 に 近 い 淡 黄 色 色 素 で あ る が ， コ ピ グ メ ン テ ー シ ョ ン に よ り ア ン ト シ ア ニ ン の 色 調 を 変 化 さ せ る こ と が 報 告 さ れ て い る（Asen ら ，1972；Brouillard， 1983； Goto ら ， 1986； Yabuya ら ， 1997）． コ ピ グ メ ン テ ー シ ョ ン は ア ン ト シ ア ニ ン の 吸 収 極 大 波 長 を 長 波 長 側 に 移 動 さ せ ， さ ら に 吸 光 度 を 増 大 さ せ る こ と か ら ， 青 色 効 果 お よ び 濃 色 効 果 が あ る と さ れ る ． そ の た め ， 黒 色 系 品 種 に お い て ， フ ラ
36 ボ ン を 蓄 積 し な い こ と に よ る コ ピ グ メ ン テ ― シ ョ ン の 消 失 が 花 弁 の 黒 色 化 を 促 し て い る 可 能 性 は 低 い と 考 え ら れ た ． ‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 は フ ラ ボ ン を 蓄 積 し て お り ， そ の 蓄 積 量 分 だ け ‘ 黒 蝶 ’ よ り も ア ン ト シ ア ニ ン ，特 に シ ア ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン 蓄 積 量 が 減 少 し て い た（ 第 1-6 図 ）． ア ン ト シ ア ニ ン と フ ラ ボ ン は 合 成 経 路 が 途 中 ま で 同 じ で あ り ， フ ラ バ ノ ン（ ナ リ ン ゲ ニ ン お よ び エ リ オ デ ィ ク テ ィ オ ー ル ）に F3H が は た ら く と ア ン ト シ ア ニ ン 合 成 へ ，FNS が は た ら く と フ ラ ボ ン 合 成 へ と 進 む（ 第 1 図 ）．す な わ ち ，ア ン ト シ ア ニ ン と フ ラ ボ ン は 基 質 を 取 り 合 う 関 係 で あ り ， 両 色 素 の 合 成 に は 競 合 が 生 じ る と 考 え ら れ て い る （Davies ら ， 2003）．‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 で は ， フ ラ ボ ン が 合 成 さ れ る こ と に よ っ て ア ン ト シ ア ニ ン 合 成 と の 間 に 基 質 競 合 が 生 じ た た め に ， ア ン ト シ ア ニ ン の 総 蓄 積 量 が 減 少 し た と 推 測 さ れ た ．す な わ ち ，‘ 黒 蝶 ’お よ び そ の 他 の 黒 色 系 品 種 で は フ ラ ボ ン を 合 成 し な い こ と に よ っ て フ ラ ボ ン ― ア ン ト シ ア ニ ン 間 の 競 合 が 生 じ な い こ と で ， ア ン ト シ ア ニ ン 総 蓄 積 量 が 多 く な り ， ま た こ の 際 ， 仕 組 み は 明 ら か で は な い が ， 特 に シ ア ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン の 蓄 積 量 が 多 く な る こ と で ， 花 弁 が 黒 色 を 示 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た ． 花 色 に 関 与 す る そ の 他 の 形 質 一 般 的 に 花 弁 の 色 素 は 向 軸 お よ び 背 軸 面 の 表 皮 細 胞 に 蓄 積 す る が ， 柵 状 組 織 や 海 綿 状 組 織 が 着 色 す る こ と も あ り ， こ の よ う な 花 弁 で は 色 素 層 が 厚 く な る た め 濃 色 に な る と さ れ る （Inagaki ら ， 1996）． ア サ ガ オ （ Ipomoea nil）， カ ー ネ ー シ ョ ン （Dianthus caryophyllus）お よ び ト ル コ ギ キ ョ ウ（ Eustoma grandiflorum）で は ，花 弁 表 皮 細 胞 の 液 胞 内 に ア ン ト シ ア ニ ン の 凝 集 構 造［anthocyanic vacuolar inclusions （AVIs）］が で き る こ と で 花 色 が 変 化 し ，暗 く く す ん だ 色 に な る こ と が 報 告 さ れ て い る（Markham ら ，2000；Morita ら ，2005；Okamura ら ，2013；Zhang ら ，2006）． ま た ， バ ラ （Rosa hybrida） や カ ト レ ヤ （ Cattleya） で は 花 弁 表 皮 細 胞 の 形 状 （ 縦 横 比 ） と 花 弁 の 暗 色 化 と の 関 係 が 示 唆 さ れ て い る （ 松 井 ，1990； Yasuda， 1964）． 供 試 し た す べ て の ダ リ ア の 花 弁 で 着 色 は 表 皮 細 胞 の み で み ら れ ， ま た ， 液 胞 内 に AVIs ら し き も の は み ら れ な か っ た こ と か ら （ 第 1-3 図 ）， 着 色 組 織 お よ び 細 胞 内 で の 色 素 の 在 り 方 の 違 い に よ り 花 弁 の 黒 色 化 が 生 じ て い る わ け で は な い こ と が 示 さ れ た ．ま た ，色 系 に よ り 表 皮 細 胞 の 大 き さ や 形 に 傾 向 は な く（ 第 1-4 図 ），縦 横 比 に も 差 が な か っ た こ と か ら（ 第 1-2 表 ），表 皮 細 胞 の 形 態 の 違 い に よ り 花 弁 の 黒 色 化 が 生 じ て い る わ け で は な い こ と が 示 さ れ た ． 花 弁 pH に つ い て は 主 に 高 い pH に よ る 青 色 化 が 報 告 さ れ て い る（ Fukada-Tanaka ら ，2000； Yamaguchi ら ，2001； Yoshida ら ，1995，2003）．こ れ は ア ン ト シ ア ニ ン の 色 が pH に よ り 変 化 す る こ と に 起 因 し て い る ． ダ リ ア の 黒 色 系 品 種 と 赤 紫 色 系 品 種 （‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 を 含 む ） と で は ， 花 弁 pH に 5％ 水 準 で 有 意 な 差 が み ら
37 れ （P=0.033）， 黒 色 系 品 種 で 低 か っ た （ 第 1-3 表 ）． し か し な が ら ， pH の 差 が わ ず か 0.5 程 度 で あ る こ と ，‘ 黒 蝶 ’と‘ 黒 蝶 ’赤 紫 色 個 体 で 差 が な か っ た こ と か ら ， 花 弁 pH が 花 弁 黒 色 化 を 制 御 す る 主 要 因 子 で あ る 可 能 性 は 低 い と 考 え ら れ た ． DvFNS の 転 写 後 遺 伝 子 サ イ レ ン シ ン グ 黒 色 系 品 種 は 赤 紫 色 系 品 種 と 同 様 に ゲ ノ ム 中 に FNSII を コ ー ド す る DvFNS 配 列 を 有 し て い た （ 第 1-7 図 ）． し か し ， 赤 紫 色 系 品 種 で は DvFNS の 十 分 な 発 現 が 確 認 さ れ た の に 対 し ， 黒 色 系 品 種 で は ほ と ん ど 発 現 し て い な か っ た （ 第 1-8 図 ）． よ っ て ， 黒 色 系 品 種 に お い て フ ラ ボ ン が 蓄 積 し て い な い の は ，DvFNS の 発 現 が 低 く フ ラ ボ ン が 合 成 さ れ な い た め で あ る こ と が 示 唆 さ れ た ． 遺 伝 子 の 発 現 が 抑 制 さ れ る 仕 組 み の 一 つ に ，mRNA が 切 断 分 解 さ れ る 転 写 後 遺 伝 子 サ イ レ ン シ ン グ（Post-transcriptional gene silencing：PTGS）が あ る（ Ghildiyal・ Zamore，2009； Hami lton ら ，2002； Hannon，2002； Meister・ Tuschl，2004）．PTGS は 二 本 鎖 RNA 由 来 の siRNA と 相 補 的 な 配 列 を も つ 特 定 の mRNA が ， siRNA お よ び い く つ か の タ ン パ ク 質 か ら な る RNA-induced silencing complex（ RISC） に よ り 認 識 さ れ る こ と で 生 じ る ．ま た ，切 断 さ れ た mRNA 断 片 は siRNA と し て さ ら な る 切 断 分 解 を 誘 導 す る と 考 え ら れ て い る ． ノ ー ザ ン ブ ロ ッ ト 解 析 に よ り ， 黒 色 系 品 種 で の み DvFNS の siRNA が 検 出 さ れ た （ 第 1-10 図 ）． ま た ， DvFNS が 赤 紫 色 品 種 並 み に 発 現 す る ‘ 結 納 ’ の 花 弁 に お け る small RNA（ Ohno ら ，2011b）は ，DvFNS 配 列 に ほ と ん ど マ ッ ピ ン グ さ れ な か っ た の に 対 し ，‘ 黒 蝶 ’の small RNA は DvFNS 配 列 へ マ ッ ピ ン グ さ れ た（ 第 1-11 図 ）．こ れ ら の 結 果 か ら ，黒 色 系 品 種 で は DvFNS の PTGS が 生 じ て い る こ と が 示 唆 さ れ ，そ の た め に DvFNS の 発 現 が 抑 制 さ れ て い る と 考 え ら れ た ． ま た ，‘ 黒 蝶 ’ 赤 紫 色 個 体 で は DvFNS が 赤 紫 色 系 品 種 と 同 程 度 発 現 し て お り（ 第 1-8 図 ），siRNA の バ ン ド が 検 出 さ れ な か っ た こ と か ら（ 第 1-10 図 ），DvFNS の PTGS が 何 ら か の 理 由 で 抑 制 さ れ て い る と 考 え ら れ た ． ア ン ト シ ア ニ ン 合 成 お よ び 輸 送 関 連 遺 伝 子 の 発 現 量 は 黒 色 系 品 種 で あ る 程 度 高 か っ た が ，ア ン ト シ ア ニ ン 総 蓄 積 量 に 対 し て 低 い 傾 向 に あ り（ 第 1-9 図 ），黒 色 系 品 種 に お け る 比 較 的 多 い ア ン ト シ ア ニ ン 総 蓄 積 量 は DvIVS や そ の 他 の ア ン ト シ ア ニ ン 合 成 に 関 与 す る 遺 伝 子 の 発 現 量 の み で は 説 明 で き な い と 考 え ら れ た ． ト レ ニ ア （Torenia hybrida） で は F3'H の 過 剰 発 現 に よ り シ ア ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン の 蓄 積 量 が 増 加 す る （Ueyama ら ， 2002）． し か し ， 本 実 験 で 調 査 し た DvF3'H の 発 現 量 と シ ア ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン 蓄 積 量 と の 間 に は 弱 い 相 関 し か み ら れ な か っ た （r = 0.57）． ま た ， DvF3'H 発 現 量 と ア ン ト シ ア ニ ン 総 蓄 積 量 に 対 す る シ ア ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン 蓄 積 量 の 割 合 と の 間 に 相 関 は み ら れ な か っ た（r ＝ -0.18）．し た が っ て ，黒 色 系 品 種 で の シ ア ニ ジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン の 高 蓄 積 は ，DvF3'H の 発 現 量 に よ り 制 御 さ れ て い る わ け で は な い こ と が 示 唆 さ れ た ．
