Implication of ryanodine receptor in the development of methamphetamine and cocaine dependence
学位名 博士（薬学）
学位授与機関 星薬科大学
学位授与年度 2011年度
学位授与番号 32676乙第194号
URL http://id.nii.ac.jp/1240/00000337/
氏名（本籍） 黒川和宏 （栃木県）
学位の種類博士（薬学）
学位記番号 乙第194号
学位授与年月日 平成24年3月15日
学位授与の要件 学位規則第4条第2項該当者
学位論文の題名 Implication of ryanodine receptor in the development of methamphetamine and cocaine dependence
論文審査委員 主査 教授 鈴木 勉 副査 教授 亀井淳三 副査 教授 成田 年
論文内容の要旨
小胞体上にあるryanodine receptorsには3種類のsubtypes（ryanodine receptor−1／骨格筋型、 ryanodine receptor2／心筋型、およびryanodine receptor−3／脳型）が存在しており、神経伝達物質動態、遺伝子転写への関与、
細胞増殖など多彩な役割を有することが明らかにされている。L型
voltage−gated Ca2→channelsの活性化により細胞内に流入したCa2＋は、
ryanodine receptorsに結合し、細胞内Ca2＋貯蔵部位からの細胞質内へのCa2＋
放出を惹起し、細胞機能の活性化を誘導している。このryanodine receptors の活性化は、細胞質のCa2＋濃度が関係することから、L型voltage−gated Ca2＋channelsとの相互作用が存在すると推察されている。一方、依存性薬物 であるmethamphetamineおよびcocaineは、中脳辺縁dopamine神経系に 作用して強度の精神依存を形成することが知られている。しかしながら、
methamphetamineおよびcocaine誘発報酬効果形成過程における
ryanodine receptorsならびにL型voltage・gated Ca2＋channelsの関与に ついて明らかにされていない。そこで本研究では、methamphetamineおよび
cocaine誘発報酬効果形成過程におけるryanodine receptorsとL型
voltage−gated Ca2＋channelsの相互作用およびryanodine receptorsの発現 調節機序をconditioned place preference法、 Western blot法ならびに免疫 染色法などにより行動薬理学的ならびに神経化学的に検討した。
Methamphetalnineおよびcocaineによる報酬効果は、ryanodine
receptorsの遮断薬であるdantroleneの脳室内前処置により用量依存的かっ
有意に消失した。Methamphetamineおよびcocaine処置により報酬効果が認 められたマウスの前頭前野および前脳辺縁部（側坐核を含む）における ryanodine receptorsの変化を検討する目的で、細胞膜分画を作製し、
ryanodine receptorsのタンパク質量の変化をWestern blot法により検討し た。その結果、methamphetamineの処置により報酬効果が認められたマウス の前頭前野において、ryanodine receptor−1とryanodine receptor2のタン パク質量および前脳辺縁部（側坐核を含む）において、ryanodine receptor1 のタンパク質量の有意な増加が認められた。一方、cocaine処置により報酬効 果が認められたマウスの前頭前野および前脳辺縁部（側坐核を含む）において
も、ryanodine receptor−1およびryanodine receptor・2のタンパク質量の有 意な増加が認められた。さらに、methamphetamineおよびcocaineによる 報酬効果は、L型voltage・gated Ca2＋channels遮断薬であるnifedipineの 前処置により用量依存的かつ有意に抑制された。また、methamphetamineお よびcocaineの処置により報酬効果が認められたマウスの前頭前野および前 脳辺縁部（側坐核を含む）におけるL型voltage−gated Ca2＋channelsの Ca。12およびCa。1．3タンパク質量の有意な増加が認められた。これらの実
験成績からmethamphetamineおよびcocailleによる報酬効果形成に
ryanodine receptorsおよびL型voltage・gated Ca2＋channelsが関与して
いる可能性が示唆された。一般に、ryanodine receptorsと L型
voltage・gated Ca2＋channelsの相互作用が知られていることから、それぞれ のryanodine receptorsとL型voltage・gated Ca2＋channelsのタンパク質 量の増加にL型voltage・gated Ca2＋channelsおよびryanodine receptors が調節を起こしているか否かを検討した。その結果、methamphetamineおよ びcocaineの処置により報酬効果が認められたマウスの前頭前野および前脳 辺縁部（側坐核を含む）におけるryanodine receptorsのタンパク質量の増加
は、nifedipineの前処置により抑制が認められなかった。また、
methamphetamineおよびcocaineの処置によるL型voltage−gated Ca2＋
channelsのタンパク質量の増加は、 dantroleneの前処置により抑制が認めら
れなかった。
そこで次に、methamphetamineおよびcocaille誘発報酬効果形成に対する dopamine DI receptorsおよびdopamine D2 receptorsの拮抗薬である
SCH23390および sulpirideの効果について検討したところ、
methamphetamineおよびcocaine誘発報酬効果は、 SCH23390および
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sulpirideのいずれの処置によっても用量依存的かつ有意に抑制された。さら に、methamphetamineおよびcocaineの処置により前頭前野および前脳辺 縁部（側坐核を含む）でのryanodine receptorsのタンパク質量の増加は、
SCH23390前処置により有意に抑制され、 sulpiride処置では抑制が認められ なかった。これらの実験結果から、methamphetamineおよびcocaineによ るryanodine receptor・1およびryanodine receptor−2のタンパク質量の増 加機構にdopamine DI receptorsを介した調節機序が存在していることを明
らかにした。
Ryanodine receptorsのupregulationの詳細な機序を明らかにするために、
初代培養マウス大脳皮質神経細胞を用いて検討した。その結果、神経細胞に
methamphetamineまたはcocaineを処置することにより ryanodine
receptor−1およびryanodine receptor−2のタンパク質量ならびにmRNAの 有意な増加が認められた。これらの増加は、SCH23390を同時に処置すること により有意に抑制された。また、dopamine Dlreceptorsのfull agonistであ るSKF82958処置によりryanodine receptor1およびryanodine receptor2
のタンパク質量ならびに mRNAの有意な増加が認められた。
methamphetamineの処置によるryanodine receptor1およびryanodine
receptor・2のタンパク質量の増加は、protein kinase A阻害薬であるKT5720 の同時処置により用量依存的かっ有意に抑制された。また、methamphetamine の処置によるcAMP response element binding proteinのリン酸化の増加は、
SCH23390の処置により有意に抑制された。これらの結果から、
methamphetamineおよびcocaineによるryanodine receptor1および
ryanodine receptor・2のタンパク質量の増加は、 dopamine Dlreceptorsの活 性化に随伴するprotein kinase Aの活性化と、これらに引き続き生じる cyclicAMP response element binding proteinの活性化が関与する発現調節に
より誘導される可能性が示唆された。
申脳辺縁dopamine神経系の起始核が存在する腹側被蓋野における
ryanodine receptorsの変化を、 methamphetamine処置により報酬効果が認 められたマウスの腹側被蓋i野 （10wer midbrain周囲の腹側被蓋i野領域を一部 含む）から調製した細胞膜分画標本を用いてWestern blot法により検討した。
その結果、腹側被蓋野において、ryanodine receptor−1と ryanodine
receptor−2のタンパク質量の有意な増加が認められた。さらに、腹側被蓋野に
投射しているglutamate神経とryanodine receptorsの機能的関連性を明ら
かにする目的で、腹側被蓋野におけるdopamine神経細胞上のryanodine receptorsおよびNmethy1−D−aspartate receptorsの局在の有無を免疫染色 法により検討したところ、腹側被蓋野に存在するryanodine receptorsは、そ
のほとんどがdopamine神経細胞上に発現していること、および
N−methyl・D−aspartate receptorsを構成するsubunitsの一っであるNR2B subunitsの発現が確認された。また、NR2B subunitsとryanodine receptors
との共局在も認められた。 このことから、腹側被蓋野において、dopamine神 経細胞上にryanodine receptorsおよびNR2B subunitsがともに発現して いることを明らかにした。そこで次に、methamphetamine処置により、
N−methyl・D−aspartate receptorsのsubunitsであるNR1， NR2Aならびに NR2Bのタンパク質量の変化について検討した。その結果、methamphetamine 処置により、NR1、 NR2AおよびNR2B subunitsのタンパク質量の有意な増 加が観察された。また、methamphetamine処置により誘発される報酬効果は、
N−methyl−D−aspartate receptors 阻害薬であ る MK−801 および N・methyl・D−aspartate receptorsの NR2B subunits阻害薬である ifenprodilの前処置により有意に抑制された。また、 methamphetamine処置
により報酬効果が認められたマウスの腹側被蓋野におけるryanodine
receptor−1およびryanodine receptor・2タンパク質量の増加は、 ifenprodi1
を前処置することにより有意に抑制された。これらの実験成績から、
methamphetamine誘発報酬効果形成時の腹側被蓋野におけるryanodine
receptorsのタンパク質量の増加には、 N−methy1−D・aspartate receptorsの NR2B subunitsを介した調節機序が関与していることを明らかにした。
以上の本研究の結果から、 methamphetamineおよびcocaine誘発報酬効 果形成には、前頭前野および前脳辺縁部（側坐核を含む）におけるdopamine DI receptorsを介したryanodine receptorsの発現調節機構、また腹側被蓋 野における N−methyl・D・aspartate receptorsに関連した ryanodine receptorsの発現調節機構に伴ったryanodine receptorsのタンパク質量の増 加が関与していることが明らかとなった。
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Metham hetamineおよびcocaine誘発艮酬交 形成における r anodine rece torsのタンパク質量の増加に対する調節機構i
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Methamphetamineおよびcocaineは、 N−methyl−D−aspartate receptors を介したCa2＋濃度上昇およびdopamine DI receptors活†4三化に随伴する protein kinase A活性化を介して cyclicAMP response element binding proteinの活性化を引き起こす。リン酸化されたcyclicAMP response element binding proteinは、ryanodine receptorsのプロモター領域にあるcyclicAMP response element binding protein siteに結合することにより、ryanodine receptorsのupregulationが引き起こされる。 Ryanodine receptorsの upregulationは、細胞内Ca2＋貯蔵部位からの細胞質内へのCa2＋放出を惹起
し、細胞機能の活性化を誘導する。また、L型voltage−dependent calcium
channelsのupregulationおよびそれに続く ryanodine receptorsの
upregulationによる細胞内Ca2＋濃度上昇が、 methamphetamineおよび
cocaineの薬物依存に大きく関与する。
論文審査の結果の要旨
わが国ではmethamphetamine（METH）の乱用が絶えることなく、また METHの治療法も確立されていないため、多きな社会問題となっている。本 研究ではMETHおよび米国で最も乱用されているcocaineにより誘発される 精神依存の形成過程におけるryanodine受容体（RyRs）の関与とRyRsの発現 調節機序を検討している。METHおよびcocaineによる精神依存はRyRs拮抗 薬であるdantroleneの前処置によりほぼ完全に消失している。 METHにより 精神依存が形成されたマウスの前頭前野においてRyR−1とRyR−2のタンパク 質量が、また前脳辺縁部においてRyR−1のタンパク質量の有意な増加が認め られている。また、cocaineにより精神依存が形成されたマウスの前頭前野お よび前脳辺縁部においても、RyR−1およびRyR−2のタンパク質量が有意に増加 している。さらに、METHおよびcocaineの精神依存形成に対するdopamine Dl（DA DI）受容体拮抗薬であるSCH23390の効果について検討を行い、
METHおよびcocaineによる精神依存はSCH23390の処置によって有意に抑 制され、METHおよびcocaine処置により前頭前野および前脳辺縁部で誘発さ れるRyRsのタンパク質量の増加もSCH23390の前処置により有意に抑制され ている。次に、RyRsの発現調節の詳細な機序を明らかにするために、初代培 養マウス大脳皮質神経細胞を用いて検討を行なっている。その結果、神経細胞 へのMETHまたはcocaineの問駄曝露によりRyR−1およびRyR−2のタンパク 質量ならびにそのmRNAの有意な増加を示している。また、これらの増加は SCH23390の同時処置により有意に抑制されている。一方、 DA DI受容体の完 全作動薬であるSKF82958処置でもRyR−1およびRyR−2のタンパク質量なら びにmRNAは有意な増加を示している。また、 METH処置によるRyR−1およ びRyR−2のタンパク質量の増加はprotein kinase A阻害薬であるKT5720の 同時処置により有意に抑制され、METH処置によるcAMP response element binding protein（CREB）のリン酸化の増加は、 SCH23390の処置により有意に 抑制されている。さらに、中脳辺縁DA神経系の起始核が存在する中脳底部に おけるRyRsの変化を検討し、 METH処置により精神依存が認められたマウ スの中脳底部において、RyR−1とRyR−2のタンパク質量の有意な増加が認め
られている。METH処置による精神依存はN−methyl−D−aspartate（NMDA）受 容体のNR2B subunits拮抗薬であるifenprodilの前処置により有意に抑制され ている。また、METH処置により精神依存が認められたマウスの中脳底部に
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