In vitro 全血培養系からの病原体検出の試み ―鏡検法・Hybrisep・PCR 法の比較―

序 文

近年，抗緑膿菌作用を持つ抗菌剤の使用量の増 加により耐性化が非常に進み，臨床的に問題と なってきている．今回，我々は緑膿菌に対し

全血培養系モデルを用いて PCR 法による起因 菌早期同定法と既存の in situ hybridization

を 含めた鏡検法の現実的な特性と感度を比較検討し た．

方法と材料

1．in vitro 全血培養モデル

健常人からヘパリン加採血 7ml を行った．On ice において全血を 15ml Falcon tube に移し，サ ンプルの顆粒球数を確認した．その顆粒球に対し て，Pseudomonas aeruginosa 株（ATCC 27853）を LB medium を用い好気的に 37℃ で 24 時間培養 し，10％ FCS 含 RPMI に浮遊調整した緑膿菌を granulocyte

に加え 37℃ 孵卵器で 5 分間インキュベイトした 後，各サンプルの buffy coat を回収し，溶血後顆粒 球を 1× PBS で 2 回洗浄し，浮遊細菌を除去し

た．洗浄後，10％ FCS 含 RPMI に再浮遊し，Gram 染色および May-Giemsa 染色にて緑膿菌貪食像 と浮遊状態の細菌が存在していないことを確認し た．

2．鏡検法

Gram 染色および May-Giemsa 染色は通常の方 法で施行した．また Hybrisep についてはキット

（HYBRISEP，扶桑薬品工業） を使用し，キットに 添付された方法に従い鏡検した．

3．DNA 抽出および PCR assay

各モデルの顆粒球（1×10

cells

ml）を genomic DNA purification kit（ThermoLabsystems，Fin- land）及 び 自 動 核 酸 抽 出 機（Kingfisher

Ther- moLabsystems，Finland） を用いて DNA を抽出し た（結果は示してないが抽出 DNA に対し細菌遺 伝子 16SrRNA （233bp）

の増幅は確認済み） ．それ らのサンプル に 対 し て Capillary PCR

を 施 行 し

gene（504bp）

の増幅を確認 した．Capillary PCR のサーモサイクリング条件 は 1 サイクル目を 94℃ で 1 分間行い，次に 94℃

で 10 秒間，64℃ で 10 秒間，72℃ で 10 秒間を 35 サイクル行った． 最後の伸展反応は 72℃ で 3 分間

In vitro 全血培養系からの病原体検出の試み

―鏡検法・Hybrisep・PCR 法の比較―

久留米大学医学部第一内科

吉無田太郎 本田 順一 濱田美奈子 廣川 雅士 野田 和人 一木 裕子 相沢 久道

（平成 15 年 3 月 3 日受付）

（平成 15 年 6 月 9 日受理）

〔感染症誌 77：687〜689，2003〕

第72回日本感染症学会西日本地方会会長推薦論文

別刷請求先：（〒830―0011）福岡県久留米市旭町 67

久留米大学医学部第一内科 吉無田太郎

Key words： Pseudomonas aeruginosa, PCR, infection model

687

平成15年 9 月20日

行った．

結果と考察

今まで正確な同一条件モデルを用いた比較実験 は類がない．Shimada らは Hybrisep と血液培養 法を比較検討し，Hybrisep において，その感度や 検 査 時 間 な ど に 関 し て の 有 用 性 を 報 告 し て い る

．しかし今回の結果は，貪食像が Gram 染色 で granulocyte!

＝1（granulocyte：

P. aeruginosa＝1：1）まで確認出来たこと（Fig. 1

a 黄 矢 印）を 基 準 に す る と Hybrisep は 100 倍

（Fig. 1a 黒 矢 印） ，PCR 法 は 1,000 倍 の 感 度

（granulocyte

1b） ，PCR 法は最も良いことが解った．検査時間は Capillary PCR 法で約 3 時間，Hybrisep は最低約 8 時間は必要な上，手技や結果解釈は複雑で熟練 を要する難点がある．今回の結果より，PCR 法が

arrow）wereP. aeruginosa.The lower were Hybrisep. Dark purple spots（black ar- row）wereP. aeruginosa.The upper axis numbers（1〜1,000）were a ratio of granu- locyte!P. aeruginosa. Magnification, ×1,000

b：Lane 1：Molecular marker（1kb）,Lane 2：Granulocyte!P. aeruginosa＝1,Lane 3：Granulocyte!P. aeruginosa＝10, Lane 4：Granulocyte!P. aeruginosa＝100,Lane 5：Granulocyte!P. aeruginosa＝1,000, Lane 6：Granulocyte!P. aeruginosa＝10,000

a

b 吉無田太郎 他 688

感染症学雑誌 第77巻 第 9 号

buffy coat からの起因菌同定に 非 常 に 有 用 で あ り，臨床応用可能であることが証明された．我々 はその他の菌種においても比較検討を行い同様の 結果を得ており，様々な病態の臨床検体において も検討を行っている．

文 献

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The Detection of Bacteria Using

Whole Blood Models

―The Characterization of Microscopy, Hybrisep and Polymerase Chain Reaction―

Taro YOSHIMUTA, Junichi HONDA, Minako HAMADA, Masashi HIROKAWA, Kazuto NODA, Hiroko ICHIKI & Hisamichi AIZAWA

Kurume University School of Medicine, First Department of Internal Medicine

In vitro全血培養系からの病原体検出の試み 689

平成15年 9 月20日