氏 名 ・（本籍） 蛇口 琢（秋田県）
専 攻 分 野 の 名 称 博士（医学）
学 位 記 番 号 医博甲第 899 号 学 位 授 与 の 日 付 平成 27 年 9 月 24 日
学 位 授 与 の 要 件 学位規則第 4 条第 1 項該当 研 究 科 ・ 専 攻 医学系研究科医学専攻
学 位 論 文 題 名 Massive bowel resection upregulates the intestinal mRNA expression levels
of cellular retinol-binding protein II and apolipoprotein A-IV and alters intestinal vitamin A status in rats
（大量腸管切除にて腸管細胞内レチノール結合タンパク質 II およびアポリポ タンパク質 A-IV の遺伝子発現が上昇しラット腸管におけるビタミン A 環境 を変化させる）
論 文 審 査 委 員 （主査） 教授 大森 泰文
（副査） 教授 髙橋 勉 教授 山﨑 正和
Akita University
学 位
論 文 内 容 要 旨
Massive bowel resection upregulates the intestinal mRNA expression levels of cellular retinol-binding protein II
and apolipoprotein A-IV and alters intestinal vitamin A status in rats.
大 量 腸 管 切 除 に て 腸 管 細 胞 内 レ チ ノ ー ル 結 合 タ ン パ ク 質
II
お よ び ア ポ リ ポ タ ン パ ク 質A-IV
の 遺 伝 子 発 現 が 上 昇 し ラ ッ ト 腸 管 に お け る ビ タ ミ ンA
環 境 を 変 化 さ せ る申 請 者 氏 名 蛇 口 琢
研
究 目 的
短 腸 症 候 群 に お い て は 広 範 囲 腸 管 切 除 に 伴 い タ ン パ ク 質 、 脂 肪 、 炭 水 化 物 、 無 機 質 、 ビ タ ミ ン と い っ た 様 々 な 栄 養 素 の 吸 収 不 良 が 起 き る 。 こ れ ら の ひ と つ で あ る ビ タ ミ ン A は 生 体 に お い て 多 様 な 生 理 作 用 を 持 つ 重 要 な 微 量 栄 養 素 で あ る 。 ビ タ ミ ン A は 腸 管 に お い て は 腸 管 上 皮 細 胞 の 増 殖 を 促 進 し 腸 管 順 応 （ 腸 切 除 時 の 腸 管 内 吸 収 面 積 の 減 少 を 絨 毛 の 細 胞 が 増 殖 し て 補 お う と す る 反 応 ） と の 関 連 （Wang JL et al. J Nutr. 127, 1297-1303, 1997） が 示 唆 さ れ て い る 。 こ れ ら の 報 告 や 基 礎 実 験 の 結 果 か ら 我 々 は ビ タ ミ ン A が 腸 切 除 時 に 吸 収 不 良 を 改 善 す る 上 で 重 要 な 働 き を す る と 考 え る に 至 り 、 広 範 囲 腸 管 切 除 時 に お き る ビ タ ミ ン A の 吸 収 不 良 を 補 う よ う な メ カ ニ ズ ム の 存 在 を 想 定 し た 。 そ こ で 広 範 囲 腸 管 切 除 が 腸 管 内 で ビ タ ミ ン A の 吸 収 、 輸 送 、 貯 蔵 へ 与 え る 影 響 を 検 討 す べ く 本 研 究 を 立 案 し た 。 そ こ で 得 ら れ た 知 見 か ら 短 腸 症 候 群 患 者 の 栄 養 管 理 に 資 す る こ と が 本 研 究 の 目 的 で あ る 。
研
究 方 法
短 小 腸 群 （75％ 小 腸 切 除 ラ ッ ト モ デ ル ） と コ ン ト ロ ー ル 群 （ 腸 管 切 離 ・ 再 吻 合 を 行 う ） を 作 成 し 術 後 1週 間 後 に 腸 管 お よ び 肝 臓 の 組 織 を 採 取 し た 。 遺 伝 子 レ ベ ル で の 影 響 を 調 べ る た め ビ タ ミ ン A代 謝 に 関 与 す る 細 胞 内 レ チ ノ ー ル 結 合 タ ン パ ク 質 （CRBP） I、CRBP II、 レ シ チ ン ： レ チ ノ ー ル ア シ ル 基 転 移 酵 素 （LRAT） 遺 伝 子 等 を リ ア ル タ イ ム PCR を 用 い て 定 量 し 各 群 間 の 発 現 量 の 差 を 比 較 し た 。 タ ン パ ク 質 レ ベ ル で の 変 化 を ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ り 検 討 し た 。 形 態 的 な 検 討 の た め 腸 管 組 織 に 対 し HE 染 色 、 免 疫 組 織 染 色 を 行 い 各 群 で の 比 較 を 行 っ た 。CRBP II と LRATの 協 調 作 用 の 検 討 の た め 培 養 細 胞 を 用 い CRBP IIな い し LRAT 単 独 と CRBP IIと LRATが 共 存 す る 環 境 下 で の ビ タ ミ ン A を 定 量 し 、 取 り 込 み の 効 率 を
比 較 し た 。 ま た 小 腸 と 肝 臓 の 組 織 に 含 ま れ る ビ タ ミ ン Aを 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ っ て 定 量 し 比 較 し た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 短 小 腸 状 態 が 腸 管 内 の ビ タ ミ ン A 吸 収 、 輸 送 、 貯 蔵 に 与 え る 影 響 に つ い て 検 討 し た 。
研
究 成 績
CRBP II は 空 腸 粘 膜 の 可 溶 性 タ ン パ ク 質 の お よ そ 1％ を 占 め る タ ン パ ク 質 で 、 腸 管 に 豊 富 に 存 在 し 、 腸 管 内 腔 か ら 腸 管 吸 収 上 皮 細 胞 内 へ の ビ タ ミ ン Aの 取 り 込 み に お い て 中 心 的 な 役 割 を 担 っ て い る と 考 え ら れ て い る 。 本 実 験 で は 短 腸 群 の 腸 管 組 織 に お い て CRBP II 遺 伝 子 の 発 現 が 有 意 に 上 昇 し て い た 。 腸 管 吸 収 上 皮 細 胞 内 へ 取 り 込 ま れ た ビ タ ミ ン A が エ ス テ ル 化 さ れ 生 成 さ れ た レ チ ニ ル エ ス テ ル は カ イ ロ ミ ク ロ ン に 組 み 込 ま れ リ ン パ 管 を 経 由 し て 大 循 環 に の っ て 肝 臓 に 運 ば れ 貯 蔵 さ れ る 。 カ イ ロ ミ ク ロ ン を 構 成 す る ア ポ リ ポ タ ン パ ク Aを コ ー ド す る Apoa4 遺 伝 子 が 短 腸 群 の 腸 管 組 織 に て 有 意 に 上 昇 し て い た 。
免 疫 組 織 染 色 で は CRBP IIが 絨 毛 の 吸 収 上 皮 細 胞 に よ り 強 く 発 現 し 、 ま た 短 腸 群 に て 強 く 発 現 し て い る よ う に 観 察 さ れ た 。CRBP II と LRATの 両 方 が 吸 収 上 皮 細 胞 に て 陽 性 で あ り 同 じ 細 胞 に ２ つ の タ ン パ ク 質 が 共 局 在 し て い た 。
培 養 細 胞 に よ る 実 験 で は HEK（human embryonic kidney） 293T細 胞 に CRBP II ま た は LRAT 単 独 、 な い し 両 方 を 発 現 さ せ レ チ ニ ル エ ス テ ル の 生 成 量 の 変 化 を 観 察 し た 結 果 、CRBP II や LRAT単 独 に 比 べ 、 両 方 を 発 現 さ せ た 細 胞 で レ チ ニ ル エ ス テ ル の 生 成 量 が 有 意 に 上 昇 し た 。
結
論
本 研 究 の 結 果 か ら 短 小 腸 ラ ッ ト で は CRBP II や Apoa4遺 伝 子 の 発 現 上 昇 を 介 し 腸 管 吸 収 上 皮 内 で の ビ タ ミ ン A の エ ス テ ル 化 や 大 循 環 へ の 輸 送 が 亢 進 さ れ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 免 疫 組 織 染 色 に よ る 形 態 学 的 な 検 討 お よ び 培 養 細 胞 に よ る 実 験 か ら CRBP II と LRAT が 協 調 的 に 働 く こ と で ビ タ ミ ン Aの エ ス テ ル 化 が 促 進 さ れ る こ と が 示 唆 さ れ た 。
Akita University
学位（博士－甲）論文審査結果の要旨
主 査： 大森 泰文 申請者： 蛇口 琢
論文題名：
Massive bowel resection upregulates the intestinal mRNA expression levels of cellular retinol-binding protein II and apolipoprotein A-IV and alters the intestinal vitamin A status in rats
（大量腸管切除にて腸管内 レチノール結合タンパク質II
およびアポリポタンパク質A-IV
の遺伝子発 現が上昇しラット腸管におけるビタミンA
環境を変化させる）要旨
小腸切除に伴う短腸症候群において、栄養吸収不良を代償するために腸管順応が生 じる。この腸管順応にビタミン
A
が重要な役割を担うことが知られていることから、著者は、ラットの
75%
腸管切除モデル(SB
ラット)
を使用し、ビタミンA
吸収関連因 子のmRNA
やタンパクの発現動態を詳細に検討した。その結果、SB
ラットの腸管でcellular retinol binding protein II (CRBP II)
とapolipoprotein A-IV (APOA4)
のmRNA
が有意に増加することを見出した。タンパクレベルでもSB
ラットの腸管上皮細胞内で
CRBP II
が増加すること、またこれらの細胞内ではCRBP II
に結合したレチノールをエステル化し、ビタミン
A
の体内への吸収に重要な役割を有するlecithin retinol acyltransferase (LRAT)
が共発現していることも確認された。以上より、短腸 症候群においては、腸管切除で減少したビタミンA
の総吸収量を補うために、腸管上 皮細胞におけるCRBP II
やAPOA4
の発現量を高めることで、腸管上皮細胞当たりの ビタミンA
吸収量を高めるという代償システムがあることが示唆された。本論文の斬新さ、重要性、実験方法の正確性、表現の明瞭さは以下の通りである。
１）斬新さ
短腸症候群で栄養吸収不良が生じることは良く知られているが、そのうちのビタミ ン
A
吸収量低下を代償するメカニズムは不明であった。本論文は、腸管切除によりCRBP II
とAPOA4
が有意に上昇するというビタミンA
吸収の代償メカニズムの一端を提示した初めての論文であり、斬新性は高いと考えられる。
２）重要性
短腸症候群は長期もしくは生涯にわたり高カロリー輸液に依存することもあり、患 者の「生活の質」を著しく害する。特に、腸管順応に必要なビタミン
A
自体が不足す ることも解決すべき問題である。本研究により不足したビタミンA
の吸収量を上げる システムが存在し、これに関与する分子を特定した点は、今後の治療戦略に重要な知 見を与えている。３）研究方法の正確性
ラットの
75%
腸管切除による短腸症候群モデルは確立されたものであり、腸管離断 吻合を陰性対照とした点も正しい選択である。定量的RT-PCR
やイムノブロッティン グ、免疫染色、液体クロマトグラフィー、トランスフェクションなどの方法も定法に したがって正しく施行している。さらにデータの統計学的解析およびその解釈も正し く行われている。データの信頼性は高いものと考えられる。４）表現の明瞭さ
研究の背景と目的、研究方法、実験結果の記載と図表の提示方法は明瞭で理解しや すい。また、考察も論理的に組み立てられているとともに、本研究において解明でき なかった点や解釈が困難な点など、いわゆる弱点に関しても丁寧に説明されており好 感が持てる表現となっている。
以上述べたように、本論文は学位を授与するに十分値する研究と判定された。
