実験方法 1.材料トウモロコシ種子(3)

(1)

ヘミセルラーゼ生産菌No.101の胞子形成

大宮満男・今里祥子・小川サチヨ・深掘知子

(昭和51年10月31日受理)

Spore Formation in a Hemicellulase‑Producing Bacterium No.101

Mitsuo OOMIYA, Shoko IMAZATO, Sachiyo OGAWA Tomoko FUKAHORI

Department of Home Economics, Faculty of Education Nagasaki University, Nagasaki

(Received Oct. 31, 1976)

Abstract

We have previously isolated a bacterium which produces a hemicellulase active toward corn seed hemicellulose. During the cultivation of this bacterium, it was found that the bacterium is quite resistnt to heat sterilization, since even after the 20 minute‑

shearing at 120℃, a significant number of bacteria appeared in the sterilized medium.

This suggests that this bacterium contains spores quite resistant to heat treatment.

緒言

乳酸を多量につくり,しかも耐熱性の胞子をつくる菌については,乳酸菌(1)あるいは有胞子育(2)として研究されてきている。我々は,前回より本菌の集積培養,細胞膜溶解について再検討を重ねていたところ,特に熱に対する抵抗が大であることが判明した。次いで染色法により胞子を有することを認めたので報告する。

実験方法

1.材料トウモロコシ種子(3)

*長崎女子短期大学Nagasaki Women′s Junior College, Nagasaki

(2)

130

大宮満男・今里祥子・小川サチヨ・深堀知子 2．集積培養における加熱処理

a 無菌水集積培養（4）

b 加熱処理条件

培養2日目のものを800C，90。Cでそれぞれ1，5，10，15分間加熱処理した。

また，1kg／cm2，120。Cで20分間加圧殺菌したものは，トウモβコシ種子が膨潤して溶液が採取できず，菌数を数えることが不可能であったため， 2日問培養し，グラム染色で明らかに菌の存在が認められるものについて，全体をよく混合し，溶液のみをあらかじめ殺菌ずみの試験管に移し取リオートクレーブにかけた。

c生菌数

処理前，処理直後，処理後24時間経過したものについて平面培養法（3）により生菌数を数えた。

3．胞子確認実験 a 培地の組成（1）脱ぺ基本培地（5）

（2）肉汁寒天斜面培地

第1表肉汁寒天斜面培地組成（％）

代

用肉

汁

肉

_工キス 1．0

ぺ

^フ。トン 1．0

Na C1 0．5

寒

天

2．0

肉エキス・一・唖鈴肉エキスペプトンー・・細菌培養用ペプトン

（3）代用麦芽汁

第2表代用麦芽汁組成 ^（％）

麦芽

糖 6．0 〜 7．0

デキストリソ 1．5 〜 2．6 グルコースおよびフルクトース 0．6 〜 0．9

シヨ糖 0．2 〜 0。6

（4）麦芽エキス（DIFCO LABORATORIES製） 1．5％

（5）酵母エキス（オリエンタル酵母工業K．K．製） 0．5％

いずれも水道水に溶解 b 培養

（1）これまで植え継いだ菌を脱ぺ基本培地に1コ・二一植え370Cで2日間培養し，その1 白金耳を肉汁寒天斜面培地に移植し，40。Cで培養し，毎日芽胞染色を施した。肉汁寒天斜面培地上のコ・二一を種菌として冷蔵庫（5土10C）に保存し，以下の実験に使用し

たo（2）代用麦芽汁に1コ・二一を植え，すぐに沸騰水浴中（970C）で加熱し，それぞれ加熱時間を0，10，20，40，50，60分間とし，流水で急冷の後400Cで培養した。

（3）麦芽汁に種菌1コロニーを植え，970Cで20分間加熱処理したものと処理しないものに

(3)

ついて40。Cで培養し，毎目芽胞染色を施した。

（4）麦芽汁に種菌1コ・二一を植え，石原ら（7）の方法によって16時間培養のものと，48時間培養のものを同時に採取でぎるようにした。

c 芽胞染色

液体培地のものは，1白金耳をプレパラート上に塗抹し，固定培地のものは1コ冒二一を無菌水10m1に懸濁し，その1白金耳を塗抹していたが，非常に菌が少なく顕微鏡観察が困難であるため，まずプレパラートに1白金耳無菌水を採り，そこに1コロニーを採り，

プレパラート上で混ぜ合わせる方法にした。各試料プレパラートにMO：LLER法（8）により芽胞染色を施し，顕微鏡観察した・

4，胞子形成条件

それぞれ酵母水，麦芽汁について行った。なお，どの培養も，上記種菌を脱ぺ基本培地で集殖培養し，毎目芽胞染色し，検鏡した。

a．通気度の影響

寒天斜面，穿刺，液層2mmおよび10mm b．pHの影響

酢酸およびリソ酸緩衝液でinitial pH4．4〜7．5まで調整し，その影響を調べた。斜面培養による。

c．グルコース濃度の影響

濃度を5種類0．1，0．25，0．5，1．0，5．0％のグルコースを添加し斜面培養した。

実験結果

第3表 80。C加熱処理における生菌数 ^{（105／m1）}

加熱時間（m1n）

1

5

10

15

処理前

18 81

37

14 22 10

7

19 19

5

112 11 174 288

処理直後 01

33

5

00

11

9 00

23

00

24 133

処理後24時間経過

14

28．8

2．2 5．8

1．1

多数

〃

(4)

132

大宮満男・今里祥子・小川サチヨ・深堀知子

第4表 90。C加熱処理における生菌数 ^{（10ヴml）}

加熱時間（min）

1

5

10

15

処理前

10，400 4，700

0 0 0 0 50

3，500 36，200

0 0 100 0

6，900 13，900

0 0 0 0

12，700 11，400

0 0

処理直後

10，100 7，800

0 0 0 3．8

15．4

00 02，2

02．9

00 00

50．10

00

14．2 13．5

6．1 0．3

14．9 多数

〃

1．8

10．1 多数

〃

0．4 1．4 7．8

25．6

多数

〃

第5表オートクレーブによる加熱処理における生菌数 ^{（102／ml）}

処理前

38，000 11，000

0

処理直後 0 0 0 1 4

34

5

0．4

1，020

2

1，000 7，610 4，500 11，020

1．集積培養における加熱処理の影響

ミセル・一ス分解菌によるトウモ・コシ種子細胞膜の溶解実験において殺菌の目的で800C 5分間加熱したところその処理効果はなかった。gO。Cにおいても，処理直後に顕れたり，加熱後24時間経過すると菌数が増加したりすること妥）あった。そこでオートクレーブにより加圧殺菌を試みたが，この場合ですら殺菌効果はなかった。

2．胞子確認実験

検鏡による結果は次のようであった。

a．肉汁寒天斜面培地では，短桿菌の存在は認められたが，胞子の有無は判然としなかった。

b．代用麦芽汁においては，970Cで40分加熱処理し，2日培養のもののみ，胞子らしきものを認めた。（第1図）

c．麦芽汁1％および5％の場合は，加熱処理しないものは，菌が認められず，麦芽汁濃度が1％のときは，菌が少なく，胞子もなく，5％のときは菌は小さいが，中心に胞子様のものおよび裸胞子様のものが見られた。（第2図）

(5)

d 麦芽汁培養で16時間，48時間経過した菌を混合したものでは，青い菌体の中心にピンク色の胞子があり，また菌体のみのもの，裸胞子状態のキ）のが見られた。（第3図）

3．胞子形成条件 a 通気度の影響

酵母水寒天斜面上，大気圧下に穿刺培養した場合は， 3日目くらいから菌が顕れたが非常に少なく，胞子も見られなかった。麦芽汁の場合も同様であった。10mm層2mm層の液体培養では，菌の生育はともに良好であるが，2mm層の方がやや数量的に多いようだが胞子は見られなかった。

》謡

梅蕪

磁

霊購癖一

第1図 970C加熱40分処理後培養 2日目（×1，500）

毒醗甥、繋嚢．、．，灘、鞭

撃擁・饗欝、美・＿

欝。績隆懸鋳

第2図麦芽エキス 596 970C加熱 20分処理後

1音養

^2日目

^{（×1，500）}

(6)

134

⁾ I f J: . ' i f . ,j,)ll ' ' >(' " j IIT

b . pH ) *." *{ l

+ i7J f ;L C pH 4 5 i )/t=Fil( FI ) I , 6, / i ) tjt ! f ( , + * ') Lf : ,‑‑, f.̲",, k F I i )';. ",/n* J+ 1 pH 4 4 ( l : /U j )i =F ( fJ ‑<, 5.0 fh>iC )+ ‑f.̲‑, L/j>L, 7.0iCt ) ft =FI i ;<H{2 r‑ )L ), f 7‑

) t ) .; ) t ) , pH 7.5 cf, % !T'iC ̲ L ,C( [J f : > t̲.‑. ( f:; 4[ I)

c. ;7"/L':'‑7 r,d =r***'o ) l' "" ;*r*

r ] cl)'t,=Fi] i O I % i ;C )‑ f nl}i r̲+･‑' r"'JL ; r fj 1 .O‑5.0% i j

= =; j

f' i'

3 l

+i += .7. 5 o

:; * 161Jlj= * ,

.‑̲..̲ ¥*

･ c , ¥

; ¥¥¥"

; :L " N; , . . ^ .̲̲¥'¥L' ¥]'‑ .

SS/ . S{.

48[ItJ= f**1 :) L ,+.̲'‑ C ) f 'Jt*(*

. i

( >< I , 500)

L̲

=, *..,* =

:･'･,** =

*+* *.. .

4 l

i

#: t

; ! (f:il‑ 'f : J r;ffrfi PH ‑' f o l' :T f t: 3 L fl

' ,'i

( x I , o OO)

(7)

纐

難

．澱

駕渉黙￠

簸，織欝職醗、、

蕪蕪難饗難

畿簿紺

灘礁灘膿繍、

難難1濠灘…

鑛藻馨…灘，，，灘灘

、．

懸、鯉螺、

≦鍵

第5図基本培地 ^{培養 2日目}

、戴奮

回

^癖

（×1，500）

体同じで濃度による差はなかった。酵母汁では胞子の着生は見られず，グルコース添加の場合，菌の伸長が特長的であった。麦芽汁では3日目になると，胞子の着生が見られ，

0．1〜0．5％が適当であった。（第5図）

胞子形成条件の実験中，冷蔵庫保存中の肉汁寒天培地から集殖培養を目的として脱ぺ基本培地に植えた菌では，培養の2日目に胞子の着生が見られた。

考察

本菌が熱に対して抵抗性が大であることは，胞子を形成しているためであることが判明した。また加熱処理前に菌が非常に少なく，処理後に表われることがあるなど，熱という物理的刺激が胞子から歯への成長を促しているといえる。はっきりとした胞子形成の条件は得られなかったが，代用肉汁寒天斜面，麦芽汁，脱ぺ基本培地の場合に胞子を着生し，酵母汁の場合は着生しないことがわかった。

総括

さきにトウモ・コシ種子から分離したヘミセルラーゼ活性を有する細菌が800C5分間の加熱条件では，完全には殺菌されないことから，本菌の胞子形成能を予想し，加熱条件を800Cと 900Cでそれぞれ，1，5，10，15分間更に1kg／cm2，120。Cで20分間加圧した場合に殺菌効果のないことを確めた。次いで各種培地の胞子形成確認をM6LLER芽胞染色を用いて行った。胞子形成条件について魂、，通気，pH，グルコース濃度の影響を検討した。pHについては，条件内で，7．0で胞ヂらしき4、のを認めることができた。

(8)

136