市販脱法ハーブ製品に混入される

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市販脱法ハーブ製品に混入される

薬物の化学構造と生物活性に関する研究

( 要約 )

中嶋順一

２０１３

(2)

第1章

1-1 1

1-2 2

第2章　

2-1 クロマトグラフ法 5

2-2 機器分析法 5

2-3 試料(市販脱法ハーブ製品) 6

2-4 試薬類及び使用動物 6

2-5 市販脱法ハーブ製品に含まれる薬物の単離方法 10 2-6 合成カンナビノイドのG-タンパク結合実験法 12 2-7 マウス耳殻TPA法抗炎症活性試験 12

2-8 DMBA及びTPAによる二段階発癌抑制試験法 13

3-1 市販脱法ハーブ製品に混入される薬物の単離精製法 14

3-2 単離成分の構造解析 14

3-3 LC/PDA/MS及びGC/MSによる分析 27

3-4 34

第4章

4-1 37

4-1-1 背景と意義 37

4-1-2 [³⁵S] GTPrSによる試験 37

4-1-3 結果および考察 38

4-2 抗炎症活性の評価 42

4-2-1 背景と意義 42

4-2-2 マウス耳殻TPA法抗炎症活性試験 42

4-3 抗がん作用の評価 48

4-3-1 背景と意義 48

4-3-2 DMBA及びTPAによる二段階発癌抑制試験 48

規制薬物成分の位置異性体に着目した分析と応用

G-タンパク結合実験によるカンナビノイド作用の検証目次

本研究の背景

本研究の目的及び結果の概要緒論 (課題設定)

実験の部 (方法論と実験)

市販脱法ハーブ製品に混入される薬物の単離精製、化学構造の決定、分析方法の検討及び薬物成分の含有実態調査 (解析と考察)

第3章

インドール類縁化合物の生物活性 (解析と考察)

(3)

第5章総括 (結果) 55 56 67 参考文献

謝辞

(4)

第１章緒論 (課題設定)

1-1. 本研究の背景

近年日本に於いて、向精神作用を有するいわゆる「脱法ドラッグ」と称される薬物が蔓延している。これは多幸感、快感を高めるとの目的で販売さてれており、別名「違法ドラッグ」または「合法ドラッグ」とも称され流通している製品を指すものである。

東京都の調査によると、「脱法ドラッグ」は平成 11 年頃より流行し始め、当初はフェネチルアミン類、トリプタミン類、亜硝酸エステル類に分類される化学物質が流行していた。これらは日本では「ケミカル系違法ドラッグ」とも称される。

一方、平成 17 年頃からは、麻薬成分メスカリンを含むサボテンであるウバタマ (Lophophora williamsii)¹⁾、指定薬物成分サルビノリン A を含むサルビア(Salvia

divinorum)²⁾ やモノアミンオキシゲナーゼ阻害作用成分であるハルミン又はハルマリ

ンを含むハルマラ(Peganum harmala)³⁾ 、平成19年頃にはウバタマと同じくメスカリンを含むサンペドロ(Trichocereus pachanoi)⁴⁾等、濫用すると幻覚作用を示す植物の乾燥物が、市販されるようになった。これらは先の「ケミカル系違法ドラッグ」に対比して「植物系違法ドラッグ」とも称される。また近年は発芽能力を有するアサ(Cannabis

SativaL.) 種子 ⁵⁾の流通や増え続ける大麻事件も社会問題となっている。

これら「脱法ドラッグ」について日本における規制に照らしあわせてその主な特徴を列挙すると以下のとおりとなる。

1. 麻薬及び向精神薬取締り法、覚せい剤取締り法など、現行の法規制成分に該当しない薬物成分である。

2. 芳香剤やお香、研究用試薬、植物標本などとして、人体への使用を目的とせず、

また医薬品または薬物としての効能を表示していないもので未規制である。

3. 規制薬物と化学構造が類似しており、生体への危険性は規制薬物と同等またはそれ以上と推測される未規制薬物が次々と販売される。

4. 一般の店舗、アダルトショップ、露店、更にはインターネット等を通じ流通しており、その入手は容易であることから広く社会に蔓延している。

5. 薬物の安易な使用は、麻薬・覚せい剤など不正薬物乱用の契機｢ゲートウエィドラッグ｣と位置づけられている。

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1-2. 本研究の目的及び結果の概要

近年の市販品の特徴は、従来の規制薬物または研究用にのみ合成されてきた化合物の構造を一部変化させたいわゆるアナログ化合物が次々に検出されることである。特に最近の「脱法ドラッグ」の特徴は、ある種の薬物を規制しても、化学構造の一部をわずかに変えた物質が直ぐに市場に現れる、俗に「イタチごっこ」といわれる状況が続いていることである。このことが正確な化学分析と迅速な規制を難しくさせているのが現状である ⁶⁾。

これらの物質は規制対象化合物と化学構造が僅かにでも異なれば、規制物質とはならないため、直ちに違法とは断定できない。しかし、基本骨格は同様のものであるため、薬物として濫用された場合は、深刻な健康被害が起きるものと推測される。実際に平成 24年度には、濫用により緊急搬送される事案が全国的に急増し、その濫用は一般人だけでなく専門的な知識を持つ医師 ⁷⁾や NHK 等の公的機関の職員 ⁸⁾、芸能人 ⁹⁾ にも及んでいる。

更には濫用による重大事件や事故の例として、大阪府での車の暴走 ¹⁰⁾、愛知県では濫用者による交通事故による高校生の死亡 ¹¹⁾、東京での女性の死亡等 ¹²⁾、がある。

このように濫用による事件は全国的に発生し極めて深刻な状況である。

これらに対処するためには、きめの細かい市場調査を実施し、規制または未規制薬物の早期発見、正確な化学分析に基づく実態調査 ¹³⁾ 並びに、生体影響への評価が極めて重要である。

これらの背景に鑑み、違法ドラッグの行政試験を実施する中で、世界的な流行にもなっているいわゆる「市販脱法ハーブ製品」に混入される合成カンナビノイドに焦点をあて、(ⅰ) 市販品に含まれる未規制薬物の単離精製及び化学構造の決定、(ⅱ) 分析方法の検討、(ⅲ) 薬物成分の含有実態調査、(ⅳ) 検出薬物の生物活性について研究を行った。

合成カンナビノイドによる中毒事例がドイツにおいて2009年に報告 ¹⁴⁾され、ドラッグとして流通している実態が初めて確認された。以降欧米諸国を中心に流行が確認されており、その対策は緊急の課題となっている。EUの薬物監視当局による2010年度の市場調査では新たに 11化合物の合成カンナビノイドが確認され、現在までの総数は 20化合物を超えたとの報告 ¹⁵⁾もある。一方、日本においても内山らにより合成カンナビノイドである cannabicicyclohexanol¹⁶⁾ や JWH-018(1)¹⁷⁾が同定され、日本における流通実態が初めて報告された。以降 JWH-073(12)、JWH-251(13)、JWH-200 (14)、

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JWH-081(15)、JWH-015(16)等¹⁸⁾、多数の合成カンナビノイドが同定されている。

筆者は都内にて流通していた市販製品について化学分析を行い、前述の合成カンナビノイドに加え 2011年には、JWH-250(2)¹⁹⁾、AM-694(3)、(4-methoxyphenyl)(1-pentyl -1H-indol-3-yl)methanone(RCS-4, 4)、JWH-210 (5)、JWH-122(6)、(2-methoxyphenyl)(1- pentyl-1H-indol-3-yl)methanone (7)、AM-2201(8)、[1-(5-hydroxypentyl)-1H-indol-3-yl](na phthalen-1-yl)methanone(AM-2202, 9) 、[1-(4-pentenyl)-1H-indol-3-yl](naphthalen-1-yl)me thanone(10) 、JWH-019 (11) 及び AM-2233 (28)等を市販製品から検出し各化合物の同定を行った ²⁰^～²³⁾。

本研究では合成カンナビノイドの生物活性として、カンナビノイド作用及び抗炎症作用と抗腫瘍作用について検証した。上記 4 と 7 はその化学構造からカンナビノイド作用があると推測されたが、活性に関する文献上の報告はなく、その作用については不明であった。そこでラット脳の膜画分における[³⁵S] GTPγSを用いたバイディング実験を実施し、強いカンナビノイド作用を示すことを明らかにした ²¹⁾。

一方、市販品に確認された合成カンナビノイドの生物活性は、中枢に対する作用以外については、十分に研究されていない。現在までに、一部の合成カンナビノイドについて、in vitro及び in vivoに於いて、抗炎症及び抗腫瘍作用が報告されているが、その構造活性相関の報告は少ない。上記合成カンナビノイドはいずれもインドール系化合物であり、抗炎症作用を持つインドメタシンと同じ骨格を有するので、合成カンナビノイドにも抗炎症作用があると推測した。そこでマウス耳殻 TPA法抗炎症活性試験による抗炎症作用について、被検物質の量が確保できた合成カンナビノイド25種について検討し、構造活性相関を考察した。

その結果、インドメタシンの ID₅₀ (nM/ear)は908 nM であるのに対し、JWH-018 (1) のID₅₀は168 nM、JWH-210 (5) のID₅₀は542 nM、JWH-122 (6) の ID₅₀は346 nM、

であり、1が最も抗炎症活性が高かった。構造活性相関について検討すると、骨格による相関は、naphthoylindole (indolyl-naphthyl-methanone) 系化合物に活性がある場合が多く、phenylacetylindole (indolyl-phenyl-ethanone) 系化合物や benzoylindole (indo-

lyl-phenyl-methanone) 系化合物には活性が低いことが判明した。

活性が見られた naphthoylindoles について構造活性相関を検討したところ、例えば、

インドール骨格の窒素から伸びるアルキル基では炭素数 5の時が最も活性が強く、炭素数が 5より増減すると活性は弱くなった。また炭素数が 5であってもJWH-022 (10) のように末端が二重結合となっているものは活性が大きく減少することが判明した。

(7)

TPA誘発の炎症を抑制する化合物は、TPAによる発癌プロモーションも抑制すると期待される。今回特にマウス耳殻 TPA 法抗炎症活性試験にて活性が確認された 1, 5 及び 6についてマウス皮膚二段階発癌実験を行った。すなわち(7,12-dimethylbenz[a]-

anthracene (DMBA) の単回塗布によるイニシエーション後に TPA 塗布によるプロモ

ーションを週 2回実施し、対照及び試験群各15匹とし、試験群においては被検物質を TPA 処理の30分前に塗布した。この結果、1はマウス皮膚におけるDMBA 及びTPA モデルに於いて発癌抑制効果を有することが判明した。更に5及び 6についても抑制効果を示し、その作用の強さは抗炎症の強さと相関していた。これらの詳細な作用メカニズムは不明であり、ヒトへの応用には慎重な検討を要するが、合成カンナビノイドは癌制御の研究に於いて重要な化合物であることが示唆された ²⁴⁾。

図. 1-2-1 JWH-018 (1), JWH-210 (5)及び

JWH-122 (6)

の化学構造

5: JWH-210 6: JWH-122

1: JWH-018 5: JWH-210 6: JWH-122

1: JWH-018

(8)

第

2

章実験の部 (方法論と実験)

本章では、本研究で使用したクロマトグラフ法、機器分析法、試料、試薬類及び使用動物、市販脱法ハーブ製品に含まれる薬物の単離方法、合成カンナビノイドの G- タンパク結合実験法、マウス耳殻TPA法抗炎症活性試験法及びDMBA及びTPAによる二段階発癌抑制試験法について述べた。

2-1 クロマトグラフ法

薄層クロマトグラフ (TLC) には Silica gel F254 (メルク製)、オープンクロマトグラフにはシリカゲルA [Silica gel 60N, 球状、中性、(株)関東化学製]、同B (40-50μm、球状、中性、同社製)、同 C [60μm、球状、中性、(株)三菱ケミカルメディエンス製]

を使用した。

中圧クロマトグラフは、充填済シリカゲルカラム[Chromatorex 27-100mm、Q-PACK SI 50(A)、同Q-PACK SI 20(B) 、(株)富士シリシア製] を使用したカラムに、ポンプ [PU-880 (株)日本分光製及びCCPS (株)東ソー製]、ミキシングモジュール[ MX-8070、

(株)東ソー製]、紫外部検出器[分取セル付UV-8010、(株)東ソー製]、フラクションコレ

クター[SF-2120、(株)アドバンテック製]、インテグレーター[807-IT、(株)日本分光製]

を使用して構成した。

オープンカラムによるクロマトグラフの溶離液系は、ヘキサン(Hex)-酢酸エチル(Ac OEt)系、またはクロロホルム(CHCl3)-メタノール(MeOH)系を適用した。

2-2. 機器分析法

核磁気共鳴(NMR)スペクトルは(株)日本電子製JEOL ECA-500 (¹H-NMR: 500 MHz,

13C-NMR: 125MHz)で測定し、重水素化クロロホルム(CDCl3)または重水素化メタノール(CD3OD)に化合物を溶解させ測定した。なお内部標準はtetramethylsilane を用いた。

高分解能質量分析は、内部標準をギ酸ナトリウムとし、Bruker 製 micro Tof LCで ESI positive modeにて、直接導入法により測定した。

質量分析機付ガスクロマトグフ(GC-MS)による定性分析は、GC はAgilent製 6890 GC システムを使用し、質量分析機は同社製 5973 電子イオン化(EI)-質量分析(MS) により測定した。カラムはAgilent社製 HP-5MS (30 m×0.25mm i.d., 0.25-μm film t

hickness) を使用した。キャリアーガスは Heを使用し、初期温度 50℃、10℃/min. の

(9)

昇温プログラムとし2-45℃ で 5分間維持した。EI-MS検出は m/z 20-600の範囲にて Scan mode で測定し、electron energy は70 eVとした。

質量分析器付超高速液体クロマトグラフは Waters 製フォトダイオードアレイ(PD A)検出器および質量分析機付 ACQUITY-TQDシステムを使用した。分析条件: カラムはACQUITY UPLC HSS T3 column (50 mm ×2.1 mm i.d. 1.8 μm; Waters) を使用し、

カラム温度は40℃とした。溶離液(A, B) は以下の組成とし、二種類のグラジエント溶出(LC condi- tions 1-2) により実施した。流速はいずれも0.6 mL/min.とした。溶離液 A [5 mM ギ酸アンモニウム緩衝液(pH 3.5):アセトニトリル (MeCN) (95:5, v/v)] 、溶離液B (0.1% ギ酸含有MeCN)。

LC condition 1 : 0-0.5分100% A 、0.5-6.85分10%A/ 90% B 、6.85-8.85分100%

B (以上いずれもリニアグラジエントを使用した)、 8.85-10.85分100% B。

LC condition 2 :同2: 0-2分70% A(アイソクラティック)、2-6分50%A/ 50%B (リニアグラジエント)、6–12分50%A/ 50%B (アイソクラティック)、 12-20分80% B (リニアグラジエント)。注入量: いずれの分析に於いても1 μLとした。 PDAの走査波長

は 200–400 nm とし、化合物の特徴的な極大波長(例. 315、305、320 nm 等)でのビー

ク高さにより検量線を作成し定量した。

ESI-MS条件はm/z 30-650のscan modeで測定し、desolvation temperature は400

℃、ion sourceは150 ℃とcone voltage 40 Vとした。

LC condition 3 : 高速液体クロマトグラフはWaters製ミレニアム2996 (PDA付)、カラム及びカラム温度は和光製 Fluofix 120E column (4.6 mm ×150 mm i.d.、5 μm)をカラム温度 50℃にて使用した。流速は1.0 mL/分とし、溶離液は、MeOH:H2O = (52:

48, v/v) とし、注入量は10 μLとし、PDAの検出波長は200 - 400 nmとした。

2-3. 試料(市販脱法ハーブ製品)

平成21年11月～24年1月の期間にて都内の店舗またはインターネットにて一般に市販されていた試料総数87 検体を使用した。

2-4. 試薬類及び使用動物

本研究に使用したギ酸アンモニウム、Hexane、AcOEt、CHCl3、MeOHは㈱和光試薬製試薬特級を使用した。0.1 %ギ酸含有アセトニトリルは同社製LCMS用、CDCl₃、C D3ODは同社製NMR測定用、ジメチルスルホキシド(DMSO) とJWH-015(31) は同社

(10)

製生化学用を使用した。JWH-250(2)、AM-694(3)、RCS-4(4)、JWH-210(5)、JWH-122(6)、

(2-methoxyphenyl)(1-pentyl-1H-indol-3-yl)methanone(7)、AM-2201(8)、[1-(5-Hydroxype ntyl)-1H-indol-3-yl](naphthalen-1-yl)methanone (AM-2202, 9)、[1-(4-Pentenyl)-1H-indol-3 -yl](naphthalen-1-yl)methanone(10)、(2-Iodophenyl)[1-(1-methylazepan-3-yl)-1H-indol-3-yl]

methanone(29)はいずれも市販製品から単離精製し、構造を確定した上で使用した¹⁹^～²

3)。また単離精製した化合物のうち、各種機器データを文献値と比較することで同定し、使用したものは、JWH-018(1)¹⁷⁾、4-Me-AM2201(22)²⁵⁾、AM-1220(23)²⁶⁾、AM-12 20-azepaneindol(24)²⁷⁾ 、APICA(25)²⁶⁾、APINACA(26)²⁶⁾である。

JWH-019(11)、JWH-073(12)、JWH-251(13)、JWH-200(14)、JWH-081(15)、JWH-015(16)、 JWH-203(17)、JWH-203のClの位置異性体であるJWH-203, 3-chloro isomer(18)、同4 -chlo-ro isomer(19) 、WIN-55212-2(21)、JWH-307(27)、 AM-2233(28)はCayman社製を使用した。Pravadoline(20) はBIOMOL International社製を使用した。次頁に本研究で扱った化合物 (1-28)の化学構造の一覧を図2-4-1, 2 に示す。

AM-281はTocris Bioscience 社製、guanosine 5’-diphosphate (GDP)、 8-cyclopentyl- 1,3-dipropylxanthine (DPCPX) 、fatty-acid free bovine serum albumin (BSA)はSigma- Aldrich製を使用した。[³⁵S]GTPγS (46.25 TBq/mmol) はPerkin Elmer社製、scintillati on cocktail はNational Diagnostics 製を使用した。

Male Sprague-Dawley (SD) ラットは300-400 g のものを日本Charles Riverより購入した。

12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)はCancer Research Inc. より購入し、7,12 -dimethylbenz[a]anthracene(DMBA) 、indometacin、hydrocortisoneはシグマアルドリッチより購入した。

Female ICR マウスは日本SLC(静岡)より購入した。その他実験に使用した試薬は、

入手できるもののうち最も純度が高いものを使用した。

(11)

N O

I

F

N O

図

2-4-1. 本研究で扱った化合物一覧

3: AM-694 4: RCS-4

5: JWH-210 6: JWH-122

N O

7: (2-methoxyphenyl)(1-pentyl-

1H-indol-3-yl)methanone 8: AM-2201

N O

9: [1-(5-Hydroxypentyl)-1H- indol-3-yl](naphthalen-1-yl) methanone (AM-2202)

10: [1-(4-Pentenyl)-1H-indol-3-yl]

(naphthalen-1-yl)methanone

N

O OMe

2: JWH-250 1: JWH-018

11: JWH-019 12: JWH-073

13: JWH-251 14: JWH-200 15: JWH-081 16: JWH-015

N

O O

N O

(12)

19: JWH-203, 4-chloro isomer 18: JWH-203, 3-chloro isomer

17: JWH-203 20: Pravadoline

21: WIN-55212-2 22: 4-Me-AM2201

N O

N

23: AM-1220 24: AM-1220-azepaneindol

26: APINACA

25: APICA 27: JWH-307 28: AM-2233

図. 2-4-2 本研究で扱った化合物一覧

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2-5. 市販脱法ハーブ製品に含まれる薬物の単離方法

JWH-250(2)、AM-694(3)、RCS-4(4)、JWH-210(5)、JWH-122(6)、(2-methoxyphenyl)(1 -pentyl-1H-indol-3-yl)methanone(7)、AM-2201(8)、[1-(5-Hydroxypentyl)-1H-indol-3-yl](na phthalen-1-yl)methanone (AM-2202, 9)、[1-(4-Pentenyl)-1H-indol-3-yl](naphthalen-1-yl)m

ethanone(10) はいずれも市販製品から単離精製し、構造を確定させて使用した ¹⁹^～²²⁾。

以下にこれら各化合物の単離方法と性状を記す。

2-5-1. JWH-250 (2) の単離

平成21年11月に入手した市販品の内容物約1 g をMeOH 100mLで超音波抽出し、

抽出液は減圧濃縮し、MeOH抽出物約45 mg を得た。MeOH抽出物をCHCl3 1 mL に溶解し、予めシリカゲル A を用いヘキサン(Hexane) にて平衡化させたオープンカラム(15cm × 10mm i.d.)に負荷し、Hexane-AcOEt 系でのグラジエント溶出を実施した。Hexane/AcOEt=100/0(V/V)、Fraction 1-7 (30 mL ずつ)、Fr. 8-15 (95/5、30 mL)、 Fr. 16-26 (90/10、10mL) の画分に分け、Fr.18-20より化合物2 (15 mg)を得た¹⁹⁾。

2-5-2. AM-694 (3) と(4-methoxyphenyl)(1-pentyl-1H-indol-3-yl)methanone(RCS-4,4) の単離

平成22年10月に入手した市販品の内容物約3 g をMeOH 100mLで超音波抽出し、

抽出液は減圧濃縮し、MeOH抽出物約250 mg を得た。MeOH抽出物をCHCl3 1 mL に溶解し、予めシリカゲルA を用い、Hexaneにて平衡化させたオープンカラム (27 cm × 25 mm i.d.) に負荷した。これをHexane-AcOEt系でのグラジエント溶出により精製した。

Fraction 1-7、Hex/AcOEt=100/0(V/V)、50 mLずつ)、Fr. 8-25 (100/10、30 mL)、Fr.

26-43 (100/15、30 mL) 、Fr. 44-61 (100/20、30 mL)、Fr. 62-79 (100/30、30 mL) の画分に分け、Fr.70-72 より化合物 3 (15 mg)、Fr.29-31 より化合物4 (18 mg)を得た

20)。

2-5-3. JWH-210 (5) の単離

平成 22 年 10 月に入手した市販品の内容物約 1.5 g を MeOH 50 mL で超音波抽出し、抽出液は減圧濃縮し、MeOH 抽出物約 200 mg を得た。MeOH 抽出物をCHCl₃ 1mL に溶解させ、予めシリカゲルB を用いヘHexaneにて平衡化させたオープンカラ

(14)

ム(26 cm × 25 mm i.d.) に負荷した。これをHexane-AcOEt系でのグラジエント溶出により精製した。Fraction 1-2、Hex/AcOEt [100/0 (V/V)、100 mL]、Fr. 2-47 (100/25、

100 mL)に分画した。Fr.5-6より化合物5 (42 mg)を得た²⁰⁾。

2-5-4. JWH-122 (6) の単離

平成 22 年 10 月に入手した市販品の内容物約 1.5 g を MeOH 50 mL で同様に抽出し、MeOH 抽出物約 300 mg を得た。MeOH 抽出物を CHCl3 1 mL に溶解させ、シリカゲルC を用い、予めHexaneにて平衡化したオープンカラム (26 cm × 25 mm

i.d.) に負荷しようと試みたが、この時のMeOH抽出物がCHCl3に充分溶解しないこと

が判明した。そこで、MeOH 抽出物に 1 mLの 0.1 mol/L-アンモニア水を加え溶解さ

せたのち CHCl₃ 1 mLを加え、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過した。CHCl₃層を減圧

濃縮し、この残留物を再びCHCl3 1 mLに溶解させたのち、これを上述のカラムに負荷し、Hexane-AcOEt系でのグラジエント溶出により精製した。Fraction 1、同(100/0(V /V)、100 mL)、Fr. 2 (100/5、100 mL)、Fr.3-4 (100/10、30 mL)、Fr.5-8 (100/20、50 mL)。Fr.6より化合物6 (60 mg)を得た ²⁰⁾。

2-5-5. (2-methoxyphenyl)(1-pentyl-1H-indol-3-yl)methanone (7)、AM-2201 (8) の単離平成 23年 1月に入手した市販品の内容物約 1.5 g をMeOH 100 mL で 2回超音波抽出しMeOH 抽出物約250 mg を得た。MeOH 抽出物をCHCl3 mL に溶解させ、ヘキサンで予め平衡化させた充填済シリカゲルカラム(A) に負荷し、Hexane-AcOEt系でのグラジエント溶出により精製した。Fraction 1-12、同(100/0(V/V)、15 mL)、Fr. 13- 35、(95/5、100 mL)、Fr.36-58 (92/8、15 mL)、Fr.59-69 (90/10、10 mL) 。Fr.61-64より化合物7 (10 mg)を得た。また Fr.45-48より化合物8 (8 mg)を得た²¹⁾。

2-5-6. [1-(5-hydroxypentyl)-1H-indol-3-yl](naphthalen-1-yl)methanone (AM-2202、9)、 [1-(4-pentenyl)-1H-indol-3-yl](naphthalen-1-yl)methanone (10)の単離

平成23年6月に入手した市販品の内容物約6 g をMeOH 100mLで二回超音波抽出し、抽出液は減圧濃縮してMeOH抽出物約250 mg を得た。MeOH抽出物をCHCl3

に溶解させ、Hexane で予め平衡化させた充填済シリカゲルカラム A に負荷し、Hexa ne-AcOEt系でのグラジエント溶出により精製した。Fraction 1-20 (同100/0(V/V)、20

(15)

mL)、Fr. 21-40 (97/3、20 mL)、Fr.41-60 (90/10、20 mL)、Fr.61-80 (80/20、20 mL)、

Fr.81-100 (70/30、20 mL)、Fr.101-120 (60/40、20 mL)、Fr.121-140 (50/50、20 mL)。F r.26-33より化合物10 (8 mg)を得た ²²⁾。

また Fr.121-140 を合わせ、減圧濃縮し、残留物を CHCl3 に溶解させ、充填済シリ

カゲルカラムB負荷し、Hexane-AcOEt系でのグラジエント溶出により精製した。Fra ction 1-2 (同100/0(V/V)、100 mL)、Fr. 3-4 (90/10、100 mL)、Fr.5-6 (80/20、100 mL)、

Fr.7-8 (70/30、100 mL)、Fr.9-10 (60/40、100 mL)、Fr.11-24 (55/45、20 mL)。Fr.12-1 6より化合物9

(7 mg)を得た²²⁾。

2-6. 合成カンナビノイドのG-タンパク結合実験法

ラット脳シナプトソームは、エーテル麻酔下切断したラット頭から脳を速やかに摘出後、サポニン処理後精製した。得られたシナプトソームは-80度で保存した。G-タンパク結合作用は、10 mM 8-cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX)含有緩衝溶液中で実施した。活性化値は、被検物質で活性化した[³⁵S]GTPγS結合値からコントロール値を差し引いて求め、活性化曲線を作成し、被検物質の50 %活性化濃度(EC50) を求めた。測定可能な最高濃度でも最大活性化値が得られなかった物質につては、basal な結合に対する活性化した割合 Emax(%)で示した²¹⁾。

2-7. マウス耳殻TPA法抗炎症活性試験法

マウスの右耳の内・外耳殻にアセトンに溶解させたTPA (1 μg, 1.7 nmol) を塗布し、

炎症を誘発させた。被検物質は TPA塗布前の 30 分前に可溶な有機溶媒に溶解し、同一部位に塗布した。抑制効果は、処置前と最大腫脹とされる6時間後に、pocket thick

ness gauge (株式会社ミツトヨ製)で測定した。対照は被検物質の代わりに、被検物質

を溶解させた溶媒のみを塗布した時の腫脹厚であり、その比較から一定濃度での50 % 抑制量「ID₅₀ (nM/ear)」を算出した²⁴⁾。

(16)

2-8. DMBA及びTPAによる二段階発癌抑制試験法

マウス(7週)の背中の体毛を電気カミソリで剃り、発癌物質であるDMBA 50mg を単回塗布しイニシエーションとした。次いでTPA 1 mgによるプロモーションを週二回実施した。被検物質はいずれも、CHCl3/MeOH = 1/1 (v/v) 混液に溶解させ、TPA 処理の30分前に塗布した。週一回背部の毛を剃り、また皮膚癌の数を一週間おきに測定し、これを20週間にわたり継続した。試験区と対象区はそれぞれ 15匹とし、統計処理はpercentage of mice with papillomas (%) は片側検定Fisher’s exact test法により、papillomas/mouse はSteel’s comparison test を用い、対照群との有意差 (**: p<0.

01, *:p< 0.05) を求めた ²⁴⁾。

(17)

第３章 (解析と考察)

市販脱法ハーブ製品に混入される薬物の単離精製法、単離成分の構造解析、

LC/PDA/MS及びGC/MSによる分析及び薬物成分の含有実態調査

3-1. 市販脱法ハーブ製品に混入される薬物の単離精製法

市販脱法ハーブ製品の詳細な製造方法は不明であるが、多くの製品の外観・性状の観察結果では、薬物が植物表面に留まっているように観察されることから、それらの製造方法は、合成薬物を可溶性の溶媒に溶かし、植物素材と混合し製造していると推測された。

従って薬物の単離に際しては、植物成分をできるだけ抽出しないことを意図し、製品を微粉末としないで行った。また多くの合成カンナビノイドが有機溶媒に溶ける性質があるため、抽出溶媒はMeOHを採用した²⁰⁾。溶媒量は試料の状態により適宜変更したが、およそ内容物の30～100倍量のMeOHを加え、30 分間超音波抽出した。MeOH 抽出液をろ過し、MeOH抽出液を合わせ、40℃の水浴中で減圧濃縮を行った。抽出物は、オープンまたは中圧カラムクロマトグラフで精製した。展開溶媒はTLCによる分離を指標にして決定した。

オープンカラムクロマトグラフィ－では、MeOH抽出物重量の約 100倍量のシリカゲルを用いた。

中圧カラムクロマトグラフィ－では、あらかじめ Hexane で平衡化した充填済シリカゲルカラムに MeOH 抽出物を MeOH または CHCl3に溶解させ負荷し、カラムクロマトグラフを実施した。

3-2. 単離成分の構造解析

単離した2～10は既出の論文²⁸^～³²⁾において、¹H-NMR及び¹³C-NMRシグナルの帰属がなされていないので、各種NMRスペクトルを測定し帰属を行った。

3-2-1. 2の構造解析

単離した2は無色油状物質であった。Electron Spray Ionization Mass Spectrometry (ESI-MS) [M+H]⁺ m/z: 336. Hig Resolution(HR) ESI-MS [M+H]⁺ m/z: 336.1956 (Calcd for C22H26NO2: 336.1958). Electron Impact - Mass Spectrometry (EI-MS) m/z: 335 (M⁺, 10),

(18)

214(100), 144(20), 116(10), 91(5). UV λ_max (MeOH) nm (log ε): 304 (4.2), 246(4.2), 212(4.5).

NMRデータは表3-2-1に、二次元NMRの相関は図3-2-1に記載した。構造解析の結

果2は既にHuffman らにより報告された合成カンナビノイドJWH-250であると同定

した ^{19, 28 )}。

3-2-2. 3 と4 の構造解析

3は淡茶色物質で、ESI-MS [M+H]⁺m/z: 436. HR-ESI-MS [M+H]⁺m/z: 436.0575 (Calcd for C₂₀H₂₀FINO: 436.0568). EI-MS m/z: 435 (M⁺, 70), 232(100), 220(50). UV λ_max (MeOH) nm (log ε): 315 (4.2), 252(4.2), 213(4.5).

4は淡茶色物質で、ESI-MS [M+H]⁺m/z: 322. HR-ESI-MS [M+H]⁺m/z: 322.1797 (Calcd for C21H24NO2: 322.1802). EI-MS m/z: 321 (M⁺, 100), 264(70), 135(60). UV λmax

(MeOH) nm (log ε): 321 (4.0), 263(4.0), 213(4.4).

以上 3-4 のNMRデータは表3-2-2に、二次元NMRの相関は図3-2-2に記載した。構造解析の結果 3はMakriyannis らにより報告された合成カンナビノイドであるAM- 694 (3) と同定した ^{20, 29 )}。4 は(4-methoxyphenyl)(1-pentyl-1H-indol-3-yl)methanone (RCS-4)であると同定した ^{20 )}。

3-2-3. 5 と 6の構造解析

5 は無色油状物質で、ESI-MS [M+H]⁺m/z: 370. HR-ESI-MS [M+H]⁺ m/z: 370.2163 (Calcd for C₂₆H₂₈NO: 370.2165). EI-MS m/z: 369 (M⁺, 100), 214(50), 144(30). UV λ_max (MeOH) nm (log ε): 316 (4.1), 246(4.0), 222(4.7).

6は無色油状物質で、ESI-MS: [M+H]⁺m/z: 356. HR-ESI-MS [M+H]⁺m/z: 356.2017 (Calcd for C₂₅H₂₆NO: 356.2009). EI-MS m/z: 355 (M⁺, 100), 214(64), 144(40). UV λ_max (MeOH) nm (log ε): 317 (4.1), 246(4.0), 221(4.7).

5-6 のNMRデータは表 3-2-3に、二次元NMRの相関は図 3-2-3に記載した。構造解析の結果、5 と 6 はいずれも Huffman らにより報告された合成カンナビノイド JWH-210(5) 及びJWH-122(6)と同定した^{20, 30 )}。

3-2-4. 7 と8 の構造解析

単離した7は文献未記載の化合物で、淡茶色油状物質であった。ドラーゲンドルフ試液に陽性で、ESI-MS [M+H]⁺m/z; 322、HR-ESI-MS [M+H]⁺ m/z: 322.1802 (Calcd

(19)

for C₂₁H₂₄NO₂: 322.1797). EI-MS m/z: 321 (M⁺, 100), 264(75), 135(50). UV λ_max (Me OH) nm (log ε): 314 (3.9), 253(3.8). 7は4と分子式が同じで、UV吸収スペクトルは

215, 252, 313 nmに極大吸収を示し、7は4のアナログ化合物であると考えられた。

そこで、各種 NMRスペクトルを測定し、7を構造解析したところ、RCS-4 (4) における4位のメトキシル基が2位のメトキシル体となった(2-methoxyphenyl)(1-pentyl-1H- indol-3-yl)methanone であると決定した ²¹⁾。

8は淡茶色油状物質であった。ESI-MS: [M+H]⁺m/z; 360. HR-ESI-MS [M+H]⁺m/z:

360.1753 (Calcd for C₂₄H₂₃FNO: 360.1758). EI-MS m/z: 359 (M⁺, 100), 232(80), 127(70).

UV λ_max (MeOH) nm (log ε): 315 (3.7), 248(3.5), 218(4.5). 8はMakriyannis らにより報告された合成カンナビノイドである AM-2201であると同定した^{21, 29)}。

以上7-8 のNMRデータは表 3-2-4に、二次元NMR の相関は図 3-2-4に記載した。

3-2-5. 9と10の構造解析

9は淡黄色油状物質であった。ESI-MS [M+H]⁺ m/z: 358. HR-ESI-MS [M+H]⁺ m/z:

358.1799 (Calcd for C24H24NO2: 358.1802). EI-MS m/z :357 (M⁺, 100), 284(53), 127(5 5), 230(50). UV λ_max (MeOH) nm (log ε): 316 (4.2), 247(4.1), 218(4.9).

10は淡黄色油状物質であった。ESI-MS [M+H]⁺ m/z: 340. HR-ESI-MS [M+H]⁺ m/z:

340.1694 (Calcd for C₂₄H₂₂NO: 340.1696). EI-MS m/z :339 (M⁺, 100), 155(60), 127 (45), 212(40). UV λ_max (MeOH) nm (log ε): 315 (3.7), 246(3.6), 218(4.6).

9-10 のNMRデータは表 3-2-5 に、二次元NMRの相関は図3-2-5 に記載した。

構造解析の結果、9はJWH-018 (1) のヒドロキシ体である[1-(5-hydroxypentyl)-1H- indol-3-yl](naphthalen-1-yl)methanone (AM-2202)であると同定した^{22, 31)}。

また10は1のインドール側鎖の末端が二重結合となった化合物 [1-(4-pentenyl)-1H- indol-3-yl](naphthalen-1-yl)methanone であると同定した ^{15, 32)}。

(20)

N o.

13

C ( 125M H z) 1 193 .1 2 41. 0 2' 135 .0 3' 116 .2 3' a 126 .9 4' 122 .9 5' 122 .4 6' 123 .1 7' 109 .7 7' a 136 .7 1' ' 124 .8 2' ' 157 .1 3' ' 110 .6 4' ' 128 .1 5' ' 120 .8 6' ' 13 1. 1 1' '' 47. 2 2' '' 29. 6 3' '' 29. 1 4' '' 22. 3 5' '' 14. 1 O -M e 55. 3 6. 93 (1H , br .t, J = 7. 4 H z) 4. 13 ( 2H , t, J = 7. 4 H z) 7. 28 ( 1H , m ) 1. 88 ( 2H , quint et, J = 7. 4 H z)

1

H ( 500 M H z) -

4. 18 ( 2H , s ) 7. 88 ( 1H , s ) - 7. 29 (1 H , m , ove rl appe d) 7. 29 (1 H , m , ove rl appe d)

8. 42 ( 1H , m )

- 3. 83 ( 3H , s )

1. 37 (2H , s ixt et like , ove rla pp ed)

7. 33 ( 1H , m ) - - - 1. 31 (2H , q ui nte t li ke , ov er la ppe d) 0. 91 ( 3H , t, J = 7. 4 H z)

6. 89 (1H , br .d , J = 8. 0 H z) 7. 24 (1H , td, J = 8. 0, 1. 7 H z)

表 3-2 -1 . JW H -2 50 ( 2 ) の N M R データ (C D C l 3 )

(21)

N

O O M e 1 2 2' 7'

3' a 4' 5' 6' 7' a 1''' 2''' 3''' 4''' 5'''

2''

3''

4'' 5'' 6'' 1'' 3' 図 3-2 -1 . JW H -2 50 ( 2 ) の N M R 相関 : H M B C : 1 H - 1 H C O S Y

(22)

表

3- 2- 2. A M -694 ( 3 )

と

(4 -m et ho xy ph enyl )( 1- pe nt yl -1 H -i ndo l- 3- yl )m et ha no ne (R C S -4, 4 )

の

N M R

データ

(C D C l

3

)

13 C13 C 1191.2189.8 2'137.9136.1 3'115.4115.6 3'a126.7127.5 4'122.9122.7 5'122.8122.3 6'123.7123.3 7'109.9109.8 7'a137.0136.8 1''146.3133.5 2'' 92.5131.0** 3''139.6113.5*** 4''130.5162.2 5''127.7113.5*** 6''128.0131.0** 1''' 47.0 47.1 2''' 29.4 29.6 3''' 22.7 (d, J = 4 Hz*) 29.0 4''' 29.8 (d, J = 20 Hz*) 22.2 5''' 83.5 (d, J = 165 Hz*) 13.9 1''''- 55.4

(4-methoxyphenyl)(1-pentyl-1H-indol-3-yl)methanone (4) 3.89 (3H, s)-

AM-694 (3) 1.26 (2H, m, overlapped) 0.87 (3H, t, J = 6.9 Hz)

1.88 (2H, quint, J = 7.5 Hz) 1.34 (2H, m, overlapped) 7.84**(1H, brd, J = 6.9 Hz) 4.15 (2H, t, J = 7.5 Hz)

- 6.99*** (1H, brd, J = 8.6 Hz) 7.84** (1H, brd, J = 6.9 Hz) 6.99*** (1H, brd, J = 8.6 Hz)

- -

7.32 (1H, m, overlapped) 7.39 (1H, m, overlapped) 8.37, (1H, m) 7.32 (1H, m, overlapped)

- -

- 7.58 (1H, s )

1 H 7.91 (1H, brd, J = 8.0 Hz) 7.14 (1H, td,J = 7.6, 2.3 Hz) 1.89 (2H, quint, J = 7.4 Hz)

7.35 (1H, m, overlapped)

1 HNo. 4.45 (1H, t, J = 5.7 Hz) 4.35 (1H, t, J = 5.7 Hz)

7.45 (1H, m, overlapped) ) 4.12 (2H, t, J = 7.5 Hz) 1.44 (2H, m, overlapped) 1.68 (2H, m, overlapped)

- -7.29 (1H, s ) - - **, *** : overlapped

- 8.34, (1H, m) *: C-F coupling

7.34 (1H, m, overlapped) 7.34 (1H, m, overlapped) 7.39 (1H, m, overlapped) -

(23)

1 2'

3' 3' a 4' 5' 6' 7' 7' a 1' '' 2' '' 3' '' 4' '' 5' ''

2' ' 4' ' 5' ' 6' '

3' ' 1' ' N O O 1' ''' ( 3 ) ( 4 ) 1 2'

3' 3' a 4' 5' 6' 7' 7' a 1' '' 2' '' 3' '' 4' '' 5' ''

2' ' 5' ' 6' '

3' ' 1' ' N O

I F

4' ' 図 3- 2- 2. A M -6 94 ( 3 ) と (4 -m et ho xy ph en yl )( 1- pe nt yl -1 H -i nd ol -3 -y l) m et ha no ne (R C S- 4, 4 ) の N M R 相関

: H M B C : 1 H - 1 H C O S Y

(24)

表

3- 2- 3 . J W H- 210 ( 5 )

と

JW H -122 ( 6 )

の

N M R

データ

(C D C l

3

)

13 C 1192.3 2'137.5 3'117.7 3'a127.1 4'123.0 5'122.7 6'123.8 7'109.9 7'a137.0 1''137.8 2''125.9 3''123.5 4''142.5 4''a132.0 5''125.8 6''126.2 7''126.8 8''126.0 8''a131.2 1''' 47.1 2''' 29.5 3''' 28.9 4''' 22.2 5''' 13.8 1'''' 26.2 2'''' 14.9

1.28, 2H, m, overlapped

- 8.13, 1H, d, J = 8.0 Hz 7.54, 1H, td,J = 7.8, 1.7 Hz 7.46, 1H, td,J = 7.7, 1.8 Hz

- -7.38, 1H, m, overlapped 1.44, 3H, t, J = 7.4 Hz

3.18, 2H, quartet, J = 7.5 Hz

0.85, 3H, t, J = 7.5 Hz

- 7.59, 1H, brd, J = 6.9 Hz 4.07, 2H, t, J = 7.5 Hz 1.80, 2H, quint, J = 7.5 Hz 1.26, 2H, m, overlapped

8.25, 1H, d, J = 8.0 Hz - 8.49, 1H, m 7.35, 1H, m overlapped 7.35, 1H, m overlapped 7.39, 1H, m, overlapped

No.JWH-210 (5) 1 H - 7.37, 1H, s, overlapped - -

13 C 192.3 137.9 117.8 127.2 122.9 123.17.36, 1H, m, overlapped 123.6 110.0 137.1 137.7 125.9 125.4 136.7 132.9 124.3 126.2 126.5 126.7 131.0 47.2 29.6 29.1 22.3 14.0 19.9 -

8.49, 1H, m 0.86, 3H, t, J = 7.4 Hz 2.79, 3H, s

1.32, 2H, m, overlapped 1.27, 2H, m, overlapped

- - -4.07, 2H, t, J = 7.4 Hz 1.82, 2H, quint, J = 7.4 Hz

- -7.48, 1H, ddd, J = 7.7, 6.9, 1.1 Hz 8.25, 1H, brd, J = 8.0 Hz

7.57, 1H, brd, J = 6.9 Hz 7.38, 1H, m, overlapped 8.08, 1H, brd, J = 8.6 Hz 7.56, 1H, td,J = 6.9, 1.1 Hz

- 7.37, 1H, brs, overlapped - - 7.36, 1H, m, overlapped 7.39, 1H, m, overlapped -

JWH-122 (6) 1 H

(25)

市販脱法ハーブ製品に混入される