卵巣

ヒト卵巣^ム チ ^ン性嚢胞腺癌 ^の特異抗原

金沢大学が ん 研究所 病 態生 理部 く主任^こ倉田自章 教 授ン

冨 田 哲 夫

く昭和^{5 9}年⁴ 月^{1 4} 日受 付1

本 論 文^の要旨は 日本 癌 学 会 第3 9 回 く1 9 8 0う^において発 表さ れ た．

ヒト卵 巣の m u cin o u s cystade n o c a r cin o ma く以 下M C C と略1 の不 溶性 分 画を デスオ キシコ ^ー ル酸 塩 で可 溶化した分 画を免 疫抗 原 とし て異 種 抗血 清を作製し た． 十 分な吸収を行った抗 血 清を使用 し， ゲ^ル 内^二重 拡散 法^で1部の M C C に特異的^{沈 降線の形 成を認め た．} 胎 児臓 器^を含む対 照 各組 織はいずれ も沈 降 線を 生 じ な かった．螢 光抗 体 法で は M C C 細 胞とく^にそ の細 胞膜が特 異 的^に陽性^であった^． e n zym e⁻1inked

im m u n o s o rbe nt a s s ay で は す^べて の M C C 標 品^に対 照組 織よ り高^い活 性が認め ら れ た． 抗原は Pl^．泳 動度

を も ち， S D S⁻ポ リ ア ク リ^ルア ミ ド^． グ^レジ^エント^． ゲ^ルで は分_子量 約^{6 5}，00 0 であった．

Key ^{w o r}ds m ucin o u s cy^stade n o c a r cin o m a， O V a ria n c a n c er

tu m o r⁻Sp^{e C}ific a nti_ge n

卵巣癌^のよ う な体 深 部の 腫瘍^{に つ い}て は免疫 学 的な 早期診 断法の確立が とくに望ま れ る が， そ の可 能 性は ひと えに特 異な腫 瘍 抗 原の有 無にか か って^いる． 卵巣 褒胞腺 病のマ ^ー カ^ー 抗 原^の研 究は19 7 0 年 代^に活 発^に 行わ れ， 幾^つかの腫 瘍 抗原が見^いだ さ れ た が， そ れ ら は柴液性 愛 胞 腺痛 くs e r o u s cystade n o c a r cin o ma， 以 下S C C と略l ^につい て のみの分析^刷や S C C と^ムチ^ン 性愛胞腺 痛 くm u cin o u s cystade n o c a r cin o m a， 以下 M C C と略つを区別せずに行った抗 原 分析^3一郎が か な り 多く， 両 者を区別し た分析^でも大部 分は特 異性の低^い 抗原の存 在を見いだ して いるのみ である⁶⁻⁹¹． わず^{か に} C ho w

l Olは M C C 特 異と思わ れ る抗 原の存 在を ゲル内 拡散 法^で示 し て^いる が， 抗 原^の性質や胎 児 分布^{に つ い} て は触れ るに至 ら なかった^．19 80 年 代^に入 り，B hat ta⁻ Cha ry^a ら^川が M C C ^{の ホ モ} ジ ネ^ー ト を抗 原と し て^モ ノク^ロ．ナ ^ー ル抗 体^の作 製^に成 功し， S C C と無 関 係な M C C 抗原の存 在を 明 らか にしてい る． しかし その抗 原は胎 児 腸^にも存 在^の示 さ れ るo n c ofetal な抗原で あ^った．

著 者は M C C の不 溶 蛋白 部 分を可 溶 化し て得た分 画 を免 疫抗 原と し て 異種 抗血清を作 製し，ゲ^ル内拡 散法，

免疫 螢 光法， e n Zym e⁻1inked im m u n o s o rbe nt _{a s s a}y

く以下E L IS A と略1 によって抗 原分 析を行^い， M C C

．特異と思わ れ る抗 原の存在を 示 し， 抗 原の二 ^．三の性 状を 明 ら かにし たのでこ こ に報 告す る．

材料お よ び方 法

1 ^． 材 料

M C C 7 例と対照の卵巣腰瘍くS C C 9例その他lは す

べて手術 時^に， 卵 巣以外の腫瘍は 主 と し て剖検 時^に， 一部は手 術 時^に得ら れ た． 正常臓 器は数例の非 痛 患者

から 死後8 時 間以内の剖検^に際して入手し， 胎 児臓 器 は4 ^へ 6 ヵ月胎 児3例^から得た^． これ らの組 織は使用 時まで ⁻3 0⁰Cに保 存し た． なお， 組織の小 片は包埋剤 T is s u eTek II， 0 ．C．T．Co mpo u nd のi visio n M ile s

In c．，U S Al ^に封入 し^て−4 0^QCに保 存し， 螢光 抗 体法^に 使用 し た^． 腫瘍 材 料は す^べて ^一部か らフ ォ ル^マリ^ン固 定， パ ラ フ ィ ン切片， へマ ト キシリン^． エオ ジン染 色 標 本を作 製し， 病理診 断を確 認し た^．

2 ^． 粗 抗 原 分 画の作製

凍 結 保 存 組 織を融 解^し， S mith ら^{1 2I}の方 法^の 変 法^{1 3句1 引に}よ り不 溶性蛋自 分画を抽 出し た^． こ の不溶 分 画に5 倍 容量の0^．2％デスオ キシコ ^ー ル酸 ナ ト リ ウ^ム 液 くs odiu m de s o xycholate， 以 下 D O C と略J を加え Tu m o r⁻S_{pe c}ific A nti_ge nく^sJ ^{in H um a n M u cin o u s C}y^stade n o c arcin o m a of the Ov a ry^． Tets u o To m ita， Dep^{a r}tm e nt of P athoph_ysiolog y く^{D ir e cto r こPr of． Y ． K u r ata}l， Ca n c e r

R e s e a r ch In stitute， K an a Z a W a U niv e r si_{t y}．

41 8

て^{ホ モ}ジ ナ イ ズ し， マグ ネ ティツタ ^{． ス}タ^ー ラ^ー を使 用 し て 4 8 時 間4 ^叫 8⁰C^で渡 拝 後， 10，0 0 0X g3 0 分 冷 却遠 心し て 上清を得た， 沈 漆^{に つい}て 0^．2％D O C によ る抽 出操 作を更^に2 回行^った． 抽 出3 回の上清^には そ れ ぞ れ 10 倍 容 量^の冷ア^セト^ンを加え て 1 夜以 上 ⁻ 2 0⁰C^{に お}き， 生じた沈澱を低 速 遠心によ り集め た^． 沈 澱を合せ て 小量の蒸 留水^に溶かし，3，0 0 0^X g 5 分 遠心 後^の上清を Sepha r o s e 4B くP ha rm a Cia Fin e C he mi⁻

c als，S^{w e}de nl ^のカ ラム に負荷し， 蒸 留水ま た は 0^．1 M リン酸緩 衝 液くpH 7．4Jで溶 出す る と小さ なp^{a s s} 分 画のピ^ー ク とr etain す る低 分子分 画の主ピ^ー ク が現

れ る． p^{a s s}分 画の ピ^ー ク は D O C によ る第1 回抽 出液

で は痕跡^かあ る^いは欠如す る． 低 分子分画の主 ピ^ー ク く^一でfr2^，，と呼^ぷ1 を プ ^{ー ル}し てセロ ファ ンチュ ^ーブに 入 れ，冷 室 内で扇風 機^{に か}け て濃 縮し，用暗まで ⁻2 0⁰C に保 存し た． 蛋白定 量は Lo wry 法^{1 61に}よ^っ た．

別^に抗 原と し て組 織の 2 0％ くWノVI 生 理食 塩 水^{ホ モ} ジ ネ^ー ト あ る^いは 2 5％くWノVlO^，0 1 M リン酸緩 衝 液^． 食 塩 水pH 7．2くpho sphate^．buffe r ed s alin e，以下P B S と略う ^{ホ モ}ジ ネ^ー ト も作 製し， 使用時ま で ⁻20⁰Cに保 存し た．

3 ． 部分精 製 抗原 分 画の作 製

下 記の家 兎 抗 血 清IgG 分 画を BrC N^{−a Ct}iv ated Sepha r o s e4 B くP ha r m a cial ^にメ ^ー カ^ー 記載^の方 法に

従って結 合させ， エタ ノ ^{ー ル}アミ ン処理^．洗 浄 後1^．5^X lO c m の カ ラ^{ム に つ}め， M C C の P f^r2く蛋 白 量5 m gl

を負荷し， 0．1M 重 炭酸^{ナ ト リ ウム}液で溶 出し， 波 長 28 0 n m の吸収ピ^ー ク を集め て濃 縮し た^．す^べて の操作 は 4 ^仙8 ⁰C^で行^った． 家 兎 抗血 清は 以下^{の 4} 種^の抗 原 液を 1 ml の Fr e u nd^，s c o mplete adju v a nt く以下，

F C郎 で乳 化し て そ れ ぞ れ別の成 熟 家兎の肩 甲骨 下 腔 に 0 ， 7 ， 1 4， 2 8 日目の 4 回注 射し， 最 終 注 射^の1 過 後^に全採^{血 し て 4} 種 類 作 製し た．く11正常卵 巣ホ モジ ネ ^ー ト 1 ml，く2肝ホ^モジ ネ ^ー ト 0^．5 ml， 腎ホモジ ネ ^ー ト 0^．5ml，ほ 肺^{ホ モ}ジ ネ^ー ト 0^．5 ml， 牌^{ホ モ}ジ ネ^ー ト 0．5 ml， 川正常^ヒト血 清^{1ml． ホ モジ ネ ー ト はい}ずれ も 2 0％ くWノVl 生理食塩 水ホ^モジ ネ ^ー ト を使用 し た^． 抗血清は ⁻2 0⁰Cに保 存し， 用時4 種の抗 血 清を等 量混 合し た ものか ら硫 酸アン モ ^ニ ウム5 0％ 飽 和によ り 工gG 分画を得た^．

4 ^． 抗血清^の作製

体重約4 0 0g のモ ル モ ット 9 匹にM C C 3例， S C C 6例のP fr2 標 品 各1 mlく5 m g蛋 釦 を F C A ^l ml で

乳 化し て肩 甲下 腔^に注射し た． 0 ， 7， 1 4， 2 8 日日^に 注射を行^い，3 5 日目^に心 採血^し，抗M C C 抗血清3種，

対 照の抗S C C 抗 血 清6種を作製し た^．抗血 清は小量 づ つ分割し て⁻2 0⁰Cに保 存し， 凍 結^．融 解を繰返 すこと

は極 力 避け た．

ゲル内拡 散 剛^こは^{モ ル モ} ット抗血清¹ ml に つき 正 常ヒト血 清0^．5 ml， 卵巣， 肝， 脾， 肺， 胃粘 膜， 大腸 粘 膜， 胎 児 肝の 2 n ％くWノVう 生理食塩 水ホ モジ ネ ^ー ト各0．5 ml 及 び大 腸 癌^の 2 0％くWノVう 生_理食塩 水ホモジ ネ^ー ト1 ml を加えて室 温^に1時 間^おき，つい で4 ^句 8 ⁰C で 1 晩 低 速回転し， 10，0 0 0X g2 0分冷却 遠 心後， 上清を M iⁿic o n B⁻1 5くAmic o n Co rpo r atio n，

U S AI によ り 1 ml に濃縮し て使用 し た．

螢 光 抗 体 法用 には抗血清0，1 mlに正常ヒト 血清 0．2ml，卵 巣と大 腸 癌の 25％ くWIVI P B S ホ モジ ネ^ー

ト を各0 ^．2 ml，胎 児腸^の 2 5％くWIVIP B S ホ モジ ネ ^ー ト 0．3ml を加え，室 温1時 間， 冷 室での回転1夜 後遠 心して上清を と り， P B S を加え て 1^．6 ml く最 終 濃度

1 ニ1 61 あるいは 3^．2 mlく最 終 濃 度1 ニ3 21 と して使 用 し た．

E L I S A 用^に は抗M C C 抗血清0．01 mlに つ き 正常

ヒト血 清7^．5 ml， ヒト 血清 凍 結 乾 燥品 2 0 0 m g^， 卵巣 2 5％くWIVIP B S ホ^モジ ネ ^ー ト1 ^ml， 胎児腸2 5％ホ モジ ネ ^ー ト 2 ^ml， 粗C E A 標品^{4 m}g くC E A と し て¹3 0_JLg

l ，S C C ^のP fr2標 品3 m g を加え，上記 同様^の操 作^で吸 収を行^い， 最 終上清に等量の0^．2 M 酢 酸ナ ト リ ウ^ム液 を加え て室 温3 0 分 放 置 後¹0，0 0 0X g30 分 冷 却 遠心 し， その上滞を P B S で透 析 後， P B S で1 0 mlく最 終濃 度1 ^ニ10 0 0うと し て使用 し た． な お， 粗C E A 標 晶は大 腸 癌^の剖 検 材 料^から K^{r u}p^ey ら^{1 71}の方 法^によ り抽 出し た．

5 ． 免 疫 学 的検 査法

ゲ^ル内^二重拡 散 法くOu chte rlo ny 法l ^には厚さ1．5⁻ 2^．O m m の．寒天層に直 径3m m ， 間 隔3 m m ま た は直 径3 m m ，間 隔⁴ m m の抗 原^．抗 体孔 を作 製し た． 抗原 標 品^の蛋白 濃 度は 3 m gノml と し た． 湿潤 状 態^で4 ^へ

8 ⁰Cに おき1 週 間観 察し た^． 免 疫 電 気 泳 動^には厚さ 1 ⁻ 1^．5 m m の Ag^{a r o s e} H E tF M C Co rp^{o r a}tio n，

M a rin e Colloi ds In c．， U S Al 層に作っ た抗 原孔^に M C C P fr2 を加えて2 0 m A く定 電流l ^で約2時 間電気 泳 動後， 抗原 孔 よ り^{4 m m} 離れ た槽 く幅1 ^．5 m mうを作 製し て吸収 抗M C C 抗血清を 入 れ， 4 ^句 8^OC^で反応さ せ た．

螢 光 抗 体 法は未 固 定^{c r}y^{o s}tat 切 片^{につ い て}間接 法 を行^った^．終 濃度1 ニ 16 ま た は 1 ^ニ3 2 の吸収抗 血 清を 室 温¹ 時 間， F I T C 標 識 抗^{モ ル モ ッ} L IgG亡家 財 くBehring^w e rke A G， Ge r m a nyl の 1 ニ25 稀釈を室 温 3 0 分反応さ せ た． 観 察^．撮影は 0 1ympu s 落射 螢光 顕 微 鏡B B−^{R F し B によった．}

E LI S A は V olle r ら^1別の操 作^の小 変 法^{1 91に}従^って 行った． 2 次 抗 体^{にはパ ー オ キシダ ー ゼ}標 識 抗^{モ ル}

モットIgG アフ ィ ^ニチイ ^ー精 製 抗体 仙 羊j く^{K irk}e⁻ ga a rd 8t Pe r ry Labo r at_{o r}ie sIn c．，U S Al を使用 し，

0⁻phe nyle n ed ia mi n e によ る反 応を室 温1 5分と し直 ちにEI A Re ade r E L 3 07 くB io^．Tek In str u m e ntsln cり

U S Al ^によ り 比色 定量を行った．

6． 物理化 学 的分析

分析用 デ^{ィ ス}ク電 気 泳 動^{は 7．5}％ポ リ ア ク リルア ミ ドゲ^ルカ ラ^ムく分離ゲル pH 8^．9，重層ゲル pH 6^．71 を 使用 し， ト リス^．グ リシ ン緩衝 液pH 8^．3 を溶媒と し，

泳 動は4 mAノ^tube で約7 5 分 間行った^． 泳動 後の ゲ^ル カ ラム に つき 以下の操作を行^っ た．く11Co o ma s siebril⁻ 1ia nt b lu e R⁻2 5 0 ^によ る染 色． t2げ^ルをaga r o s e H E CF M C Co rp⁻1 の薄層^に作っ た槽 内に おき， 免疫 電 気 泳 動^の場 合と同 様^に4 m m 離れ た平 行 槽^を作って吸 収 抗 血 清を 入 れ， 湿潤 状態^{で 4 − 8 0}c l週 間反応． 刷 ゲルを 2 m m 間 隔で横 断し， 各スラ イスを 0^．0 5 M 炭 酸 緩衝 液 くpH 9^．6うの 0^．3 ml で抽 出し， 各 抽 出液^{に つ} き E L I S A によ る抗原 活性^の測 定．

F ig^．1． Ex a m ple s of im m u n odiffu sio n p^at te r n s of abs o rbed a ntis e r u rn tO O V a ria n m u cin o u s cy^stade n o c a r cin o m aくM C CI ^{e xtr a ct}in c e nte r w ells ag^ain st M C C e xtr a ct a nd v a rio u s c o ntr oI s a mple s．

く^a1 ¹，M C C e xtr a ct ニ2，n O r m al hu m a n s e r u 町 3，1iv e r e xtr a ct ニ 4，Sple e n e xt_{r a c}t ニ5，

1u ng e xtr a ct i 6，O V a ry e Xtr a Ct．

くbJ l， M C C e xtr a ct ニ2，fetal lu ng ho m oge n atei3，fetal liv e r ho moge n ate三4，fetal

SPle e n ho m oge n atei 5，fetalsto ma ch ho m oge n ate三6，fetal inte stin e ho m oge n ate．

く^cll，M C C e xtr a ct i 2_，Kr uke nbe rg tu mo r e xtr a ct i 3，gr a nul o s a c elltu mo r e xtr a ct i 4，

O V a ria n m u cin o u s cystade n o m a e xtr a ct I5，e mbryo n alc a r cin o m a e xtr a ct i 6，O V a ria n S e r O u S CyStade n o c a r cin o m a e xtr a ct．

くd1 ¹，M C C e xtr a ct ニ2， C Olo n c a n c e r e xtr a ct I3， ga Stric c a n c e r e xtr a ct ニ 4， ute rin e C e r Vic al c a n c e r e xtr a ct ニ5， r e n al c e11 c a r cin o ma e xtr a ct 三6，1u ng ade n o c a r cin o rn a e xtr a ct．