技術論文
液状化検体細胞診 TACAS による HPV DNA 検査の
有用性―HPV DNA「キアゲン」HC II 専用検体採取
キットとの比較―
二谷 悦子
1)志賀 朋子
2)東岩井 久
2)高橋 正宜
3) 1) 株式会社医学生物学研究所研究開発本部診断薬開発部（〒 173-0004 東京都板橋区板橋 2-9-3 埼京ビル 4F） 2) 医療法人社団進興会せんだい総合健診クリニック 3) 医療法人社団天宣会健診センター汐留健診クリニック 要 旨 子宮頸がんの原因である Human papillomavirus（HPV）の検出には様々な HPV 検出試薬が用いられている．子宮膣頸部 擦過材料から HPV 検査を行う際，従来塗抹標本作製後に残った細胞から検出する方法と，液状化検体細胞診 liquid-based cytology（LBC）検体から標本作製と HPV 検出検査を実施する方法が主に使用されている．今回，同一患者から 2 回の細 胞採取を行い，2 法の細胞診判定と HPV 検出結果の比較を行った．HPV 検出検査は HC II で行い，専用の HPV サンプ ラー採取の検体と LBC システムの 1 つである TACAS に固定した検体を用いた．前者は試薬添付文書に則り，後者は前処 理キット HC2 Sample Conversion Kit を使用してから既定のプロトコールに則り測定を行った．従来塗抹標本と TACAS 標 本の細胞診判定結果一致率は 94.8%であり不一致率は 5.2%であった．HC II 測定結果一致率は 93.1%であった．HC II 測定 結果が不一致であった例はいずれもインデックス値のカットオフ値付近であり，全体の 6.9%であった．今回の結果より， TACASバイアルを用いた HC II 測定は HPV サンプラーと同等もしくは同等以上の測定が可能であり有用な方法であるこ とが確認された． キーワード 液状化検体細胞診，TACAS，HC II，HPV 子宮頸がんの原因である Human papillomavirus （HPV）は，多くは一過性感染であり自然消退するが 子宮頸部に継続感染をした場合に子宮頸がんを引き 起こす1),2)．HPV の検出には様々な検出試薬が用い られており，子宮頸がんハイリスク HPV グルーピン グ検査と HPV ジェノタイプ検査とに分けられる．本 邦において広く用いられている HPV DNA「キアゲ ン」HC II（株式会社キアゲン，以下 HC II）はハイ ブリッドキャプチャー法により検体中の中～高リス ク型 HPV-DNA を検出する試薬である．試薬添付文 書における推奨使用法は専用検体採取キット HPV サンプラー（以下 HPV サンプラー）での採取または 液状化検体細胞診法 liquid-based cytology（LBC） （ ThinPrep （ Hologic ） ま た は SurePath （ Becton,Dickinson and Company））であり，LBC 検体を用い る際はそれぞれ指定の前処理を実施した後にハイブ リダイゼーションから反応を始める必要がある3)． 本邦での LBC 法は前述 2 種以外に TACAS（株式 会社医学生物学研究所），LBC PREP（武藤化学株式 会社）がある．しかし，添付文書以外の LBC 法での 検討は試薬製造元において行われていないため，各 施設での検証が必要となっている．今回我々は同一 患者から同一時に 2 回の細胞採取を行い HPV サン プラーと TACAS 検体での細胞診判定結果及び HC II 結果の相関を確認した． （平成 26 年 4 月 10 日受付・平成 26 年 6 月 6 日受理）
I 対象及び方法 1．対象 2011年 9 月～2011 年 12 月に医療法人社団進興会 せんだい総合健診クリニックにおいて採取された子 宮膣頸部擦過材料 116 例を用いた．平均年齢は 44.1 歳（22 歳～65 歳）であった． 検体採取は同一患者より 2 回実施した．まず，HPV サンプラーで膣頸部細胞を採取し，従来塗抹標本を 作製後，HC II 採取キット内に回収した．次に Cervex ブラシ（株式会社医学生物学研究所）を用いて再度 膣頸部細胞採取を実施しブラシ先端を TACAS GYN バイアルに回収した（Figure 1）． 2．方法 1）従来塗抹標本作製・判定 HPVサンプラーで採取し塗抹した従来塗抹標本 は，パパニコロウ染色を行い，ベセスダシステム 2001準拠子宮頸部細胞診報告様式4),5)に則って細胞 診判定した． 2）TACAS 標本作製・判定
TACAS GYNバイアルに回収した検体から TACAS
標本作製プロトコール（Table 1）に則って標本作製 を行った．パパニコロウ染色を行い，ベセスダシス テム 2001 準拠子宮頸部細胞診報告様式に則って細 胞診判定した． 標本作製後の残検体は室温にて保存した． 従来塗抹標本と TACAS 標本の判定をそれぞれ比 較し一致率，不一致率を算出した． 3）HC II 測定 HC IIは検体中の DNA を検体抽出液で抽出し， HPV DNAが存在すると DNA/RNA ハイブリッドが 形成される．これを抗 DNA/RNA 抗体により捕捉 し，更にアルカリフォスファターゼ標識抗 DNA/RNA 抗体を反応させ，得られた抗原抗体反応複合物と化 学発光基質を反応させ，その化学発光を測定するこ とにより検体中の HPV DNA を検出する． HPVサンプラーで採取した検体は採取キット添付 文書に従って検体の抽出，ハイブリダイゼーション， ハイブリッドキャプチャー，検出反応を実施し結果 判定を行った．標本作製後の TACAS GYN バイアル 検体は ThinPrep 検体（PreservCyt 溶液）用検体前処 理キット HC2 Sample Conversion Kit（株式会社キア ゲン）を使用して前処理を実施した．処理工程は検
体 2 mL を使用し試薬内添付文書3)に則り（Table 2）
実施した．前処理終了後はハイブリダイゼーション，
TACAS slide procedure
1 Transfer 1.5 mL of fixing fluid to centrifuge tube per one sample 2 Centrifugation for 800 × g, 5 minutes
3 Remove supernatant and mixed with 3 mL deionized water 4 Centrifugation for 800 × g, 5 minutes
5 Remove supernatant and mixed with 300 μL deionized water 6 Dispense 300 μL cell suspension on TACAS slide
7 Incubate for 10 minutes and wash with 100% ethanol 8 Put slide into 95% ethanol jar
Table 1 HCⅡ test
Patient
1st：HPV sampler
Sampling with HPV sampler
Preparation for conventional slide
2nd：TACAS
Sampling with Cervex brush
Put brush head into a vial
Preparation for TACAS slide
HCⅡ test Step for cell sampling to HC II test
ハイブリッドキャプチャー，検出反応を添付文書に 則り実施し結果判定を行った．
II 結 果
1．細胞診判定結果
全 116 例中，従来塗抹標本と TACAS 標本で細胞 診 判 定 が 一 致 し た 例 は NILM （ Negative for intraepithelial lesion or malignancy）105 例，ASC-US （Atypical squamous cells of undetermined significance）
1例，LSIL（Low grade squamous intraepithelial lesion）
2 例 ， HSIL （ High grade squamous intraepithelial
lesion）2 例の 110 例であった．2 法の細胞診判定の 一致率は 94.8%（110/116），不一致率 5.2%（6/116） であった（Table 3）． 2．HC II 測定結果 HC II測定結果はインデックス値で判定され，イ ンデックス値＜1.0 を陰性，1.0≦インデックス値を
Pretreatment step for HC II
1 Add 0.4 mL Sample Conversion Buffer for sample 2 Centrifugation for 2,900 × g, 15 minutes
3 Remove supernatant and add to buffer with Specimen Transport Medium and Denaturation Reagent
4 Incubation for 65°C, 15 minutes 5 Mixing for 1 minute
6 Incubation for 65°C, 30 minutes 7 Mixing for 10 seconds
Table 2 陽性とした．全測定数は 116 例で，HPV サンプラー 検体および TACAS GYN バイアル検体の両法が陽性 であった例数は 7 例，HPV サンプラー検体で陰性， TACAS GYNバイアル検体で陽性であった例数が 8 例であった．HPV サンプラー検体で陽性，TACAS GYNバイアル検体で陰性であった例は 0 例であった （Table 4）．判定一致率は 93.1%（108/116）であり， 測定法間の有意差は p = 0.81（t-test）であった． 2法で測定結果が陽性となった 7 例中 6 例が，HPV サンプラー検体と比べて TACAS バイアル検体で高 いインデックス値を示した．TACAS 標本の細胞診判 定は 7 例すべてが ASC-US 以上であったが，HPV サ ンプラー検体従来塗抹標本では 7 例中 2 例が NILM であり TACAS 標本と不一致であった（Table 5）．2 法で測定結果が不一致となった 8 例は全例で HPV サンプラー検体陰性，TACAS GYN バイアル検体陽 性であった．TACAS GYN バイアル検体での測定イ ンデックス値は 8 例いずれもインデックス値のカッ トオフ値（1.0）付近で，1.24–3.17（平均 1.97）で
HC II result of TACAS GYN vial and HPV sampler sample
HPV sampler sample Positive Negative Total
TACAS GYN vial sample Positive 7 8 15 Negative 0 101 101 Total 7 109 116 Table 4
Cytological diagnosis of TACAS and conventional method
TACAS slide
NILM ASC-US ASC-H AGC LSIL HSIL SCC Others Total
Conventional slide NILM 105 4 — — — — — — 109 ASC-US — 1 — — 1 — — — 2 ASC-H — — — — — — — — 0 AGC — 1 — — — — — — 1 LSIL — — — — 2 — — — 2 HSIL — — — — — 2 — — 2 SCC — — — — — — — — 0 Others — — — — — — — — 0 Total 105 6 0 0 3 2 0 0 116
NILM: negative for intraepithelial lesion or malignancy ASC-US: atypical squamous cells of undetermined significance ASC-H: atypical squamous cells cannot exclude HSIL LSIL: low grade squamous intraepithelial lesion HSIL: high grade squamous intraepithelial lesion SCC: squamous cell carcinoma
AGC: atypical glandular cells
あった（Table 6）．細胞診判定は 8 例中 7 例で NILM であった． III 考 察 今回同一患者から 2 回の細胞採取を行い，TACAS GYNバイアルと HPV サンプラーで細胞診判定と HC II測定の比較検討を行った．細胞診判定一致率は 94.8%，HC II 測定結果一致率は 93.1%であり，細胞 診判定および HC II 測定結果のどちらにおいても高 い一致率を示した．HC II 測定結果が不一致であっ た例はいずれも HC II 測定インデックス値のカット オフ値（1.0）付近（1.24–3.17）であり全体の 6.9% であった．不一致となった理由として，次の理由が 考えられた．HC II サンプラー検体での測定は，細 胞採取後に一度スライドガラスへ細胞を塗抹して従 来塗抹標本を作製し，塗抹後の HPV サンプラーブラ シを HC II 検査用として用いるため細胞数が少な かったことが考えられる．一方で 2 度目の細胞採取 時は採取条件としては不利ではあったが，Cervex ブ ラシ採取後に採取細胞すべてを TACAS GYN バイア ル内に回収していることにより，細胞診標本だけで なく HC II 測定に用いた細胞数が十分量であった可 能性が考えられた．このことは，HPV サンプラー検 体と TACAS GYN バイアル検体で HC II 測定結果が 陽性であった 7 例中 6 例で，インデックス値が HPV サンプラー検体よりも TACAS GYN バイアル検体で 高かったことからも推測可能である． HC II測定時のインデックス値と病変との間に相 関はないため，数値の高低と病変の有無を関連付け
Index value and cytological diagnosis of HC II positive sample
Sample no.
Index value Cytological diagnosis HPV sampler
sample
TACAS GYN vial sample
Conventional
slide TACAS slide 1 44.95 57.79 ASC-US ASC-US 2 48.89 34.54 HSIL HSIL 3 42.33 135.51 NILM ASC-US 4 160.78 168.44 LSIL LSIL 5 46.92 60.22 NILM ASC-US 6 945.01 2011.55 ASC-US LSIL 7 210.96 898.00 HSIL HSIL NILM: negative for intraepithelial lesion or malignancy
ASC-US: atypical squamous cells of undetermined significance LSIL: low grade squamous intraepithelial lesion
HSIL: high grade squamous intraepithelial lesion
Table 5
Index value and cytological diagnosis of HC II disagreement sample
Sample no.
Index value Cytological diagnosis HPV sampler
sample
TACAS GYN vial sample
Conventional
slide TACAS slide 8 0.17 2.21 NILM NILM 9 0.21 1.40 AGC ASC-US 10 0.82 2.18 NILM NILM 11 0.26 3.17 NILM NILM 12 0.20 1.36 NILM NILM 13 0.35 1.93 NILM NILM 14 0.14 2.27 NILM NILM 15 0.16 1.24 NILM NILM NILM: negative for intraepithelial lesion or malignancy
ASC-US: atypical squamous cells of undetermined significance AGC: atypical glandular cells
ることはできない．しかしインデックス値がカット オフ値付近（1.0～10.0）と 10.0 以上の ASC-US 検体 を比較した際に 10.0 以上の検体において有意に CIN （Cervical intraepithelial neoplasia）2，3 の罹患率が高
いことが報告されている6)．今回の結果でもカット オフ値付近の検体において 87.5%が細胞診判定 NILMであった． HC II法は臨床研究ならびに国内の報告から，CIN2 以上の病変検出に高い感度を有することが報告され ている7),8)定性検査法である．LBC は Cervex ブラシ のようなブラシタイプの採取器具と組み合わせるこ とで，標本の均一化・標準化が可能である．その結 果として不適正標本の減少となり，精度向上につな がることが報告されている9),10)．また，細胞を全て 回収するため，標本作製後に残検体を用いて免疫細 胞化学検査や遺伝子検査を行うことが可能であり11)， 本邦においても普及が広がっている12)．LBC と従来 塗抹標本の比較検討を行う場合，一般的には患者 1 名から採取は 1 度のみで，従来塗抹標本作製後に採 取器具の残った細胞を LBC 固定液に回収して検討・ 検査を行うことが一般的である（スプリットサンプ ル法）．そのため，細胞量が従来塗抹標本に比較して 少ない塗抹量となることが懸念されるが，TACAS GYNバイアルと Cervex ブラシを組み合わせて使用 することで回避できる可能性がある． また，HC II 測定陽性例での細胞診結果は従来塗 抹標本では 7 例中 2 例が NILM であるのに対し，
TACAS GYNバイアル検体では全例が ASC-US 以上
の結果であった．細胞診検査と HPV 検査の併用検診 で細胞診検査 ASC-US と判定され，ハイリスク HPV 検査陽性である場合はコルポ診（精密検査）となる． 一方細胞診検査 NILM と判定され，ハイリスク HPV 検査陽性である場合は 6～12 ヵ月後の再検査とな
る13)．例数は少ないが，Cervex ブラシと TACAS GYN
バイアル検体を使用した検査では陽性例拾い上げお よび見落としの減少へ繋がり，確実な患者フォロー へ寄与すると考えられた． 今回の検討では，国産試薬である TACAS GYN バ イアルと Cervex ブラシの組み合わせによる検体採取 により，適切な細胞量回収が可能となり，TACAS が 細胞診検査および HPV DNA 検査への運用に有用な 手法であることが示唆された． IV 結 語 同一患者から 2 度の細胞採取を行い，HPV サンプ ラー検体と TACAS GYN バイアル検体での細胞診判 定結果と HC II 測定結果を比較し高い一致率が確認 された．今回の検討より，TACAS GYN バイアルを 用いた HC II 測定は HPV サンプラーと同等もしくは それ以上の測定が可能であることが示唆された． ■文献
1) zur Hausen H: Papillomaviruses in human cancer, Appl Pathol 1987 ; 5 : 19–24.
2) Walboomers JM et al.: Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide, J Pathol 1999 ; 189 : 12– 19. 3) キアゲン：パピローマウイルス核酸キット HPV DNA「キア ゲン」HC II，添付文書，2010. 4) 日本産婦人科医会：ベセスダシステム 2001 準拠子宮頸部細 胞診報告様式の理解のために，5–7，社団法人日本産婦人科 医会，東京，2008. 5) 日本産科婦人科学会，他：子宮頸癌取扱い規約，第 3 版， 13–14，金原出版，東京，2012.
6) Jarboe EA et al.: A weakly positive human papillomavirus Hybrid Capture II result correlates with a significantly lower risk of cervical intraepithelial neoplasia 2,3 after atypical squamous cells of undetermined significance cytology, J Low Genit Tract Dis 2010 ; 14 : 174–178.
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8) 岩成 治：子宮頸がん検診受診率向上への取り組み―日本初 の細胞診・HPV 検査併用検診で受診率向上・高精度化・効率 化達成―，臨床婦人科産科 2010；64：288–297.
9) 赤松 節，他：子宮頸がん検診標本の適否状況と発見病変― Liquid based cytology法と conventional 法の比較―，日臨細胞 会誌 2008；47：420–424. 10) 小澤信義，他：ベセスダシステムを用いた子宮頸癌検診の課 題とその解決―不適正標本と ASC-US に対する宮城の対応に ついて，産婦の実際 2010；59：597–603. 11) 杉山裕子：細胞診―検体採取と検体処理―，臨床検査 2011；55：1413–1416. 12) 日本臨床細胞学会：子宮頸がん検診における細胞診の精度管 理に関するワーキンググループ調査報告書，日臨細胞会誌 2012；51：xxv–xlv. 13) 日本産婦人科医会がん対策委員会：子宮頸がん検診リコメン デーション，2011.
Technical Article
Efficacy of human papillomavirus DNA assay using liquid-based
cytology system TACAS—Comparison between TACAS and HC II
sampling kit—
Etsuko FUTAYA1) Tomoko SHIGA2) Hisashi HIGASHIIWAI2) Masayoshi TAKAHASHI3)
1)Department of IVD Development, Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.(Saikyo Bldg. 4F, 2-9-3, Itabashi, Itabashi-Ku, Tokyo 173-0004, Japan)
2)Sendai Health Evaluation and Promotion Clinic 3)Tensen-kai Shiodome Kenshin Center
Summary
Various assays are used for human papillomavirus (HPV) detection. The primarily used method of preparing samples for these assays is the split-sample method, in which the sampling device after preparing conventional slides is placed into a vial and a reflex HPV test kit. Another method is liquid-based cytology (LBC), in which an LBC slide is prepared and HPV is detected from the same residual LBC sample. We collected cell samples twice from one patient for the TACAS sampling device and HCⅡ (HPV sampler) then compared the results with those of cytological analysis and HPV DNA detection. HPV DNA detection was performed using HCⅡ. The concordance rate of cytological results between the conventional slide using the HCⅡ device and the TACAS slide was 94.8%, whereas the disagreement rate was 5.2%. HCⅡassay results were concordant between both sample types in 93.1% of patients, whereas the disagreement rate was 6.9%. The HCⅡ assay values showing disagreement were close to the cut-off values. Our results suggest that TACAS is a useful method equivalent to the conventional method using the HPV sampler.
Key words: Liquid-based cytology, TACAS, HC II, HPV
