九州大学学術情報リポジトリ

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Kyushu University Institutional Repository

RNA部位特異的な修飾能をもつ人工核酸の創製と核酸 構造および機能制御への応用

菊田, 健司

http://hdl.handle.net/2324/2236162

出版情報：九州大学, 2018, 博士（創薬科学）, 課程博士 バージョン：

権利関係：やむを得ない事由により本文ファイル非公開 (3)

1

RNA 部位特異的な修飾能をもつ人工核酸の創製と核酸構造および機能制御への応用

【序論】DNAやRNAなどの核酸塩基の化学修飾は遺伝子の発現を精密に制御している。例えばmRNAの コドン情報が RNA 修飾によって変換されると、改変されたアミノ酸配列を持つタンパク質が発現される。

このように修飾部位が核酸塩基の認識に直接的に干渉するため、核酸塩基の化学修飾法はその構造・機能解 析に加え遺伝子発現を制御する画期的な医薬品やバイオツールに展開できる。本研究の目的は RNA の核酸 塩基を部位特異的に化学修飾可能な人工核酸の創製である。その特色は人工核酸を含むオリゴ核酸と相補的 な RNA の二本鎖形成によって反応点と標的塩基を選

択的に近接させる点である（Fig. 1）。クロスリンク核酸 は標的RNAとの間に化学架橋（クロスリンク）を形成 し、官能基転移核酸は標的RNAをピンポイントに低分 子で修飾することが可能である。最終的には従来の遺 伝子発現の促進や抑制に加えmRNAの化学修飾によっ てコドン情報を編集することを狙っている。

【方法と結果】1. 反応系中でT-vinylへ活性化されるスルフィド誘導体の開発

既に4-ビニルチミジン（T-vinyl）が開発され、標的RNA中のウラシルもしくはその隣接するアデニンと

化学架橋を形成することが見出された ¹⁾。核酸医薬と標的間の架橋形成はその効果を向上でき、従来の核酸 医薬が制御できない標的に対しても適用できると考えられる。しかし T-vinyl は不安定であり細胞応用は困 難であった。そこで安定性と反応性を満たすために T-vinyl を基に誘起反応性をもつスルフィド誘導体を設 計した（Fig. 2）。T-vinylのビニル基をスルフィドで保護することに加えチオールの β 脱離反応による活性 化を狙った。T-vinylを含むオリゴ核酸に種々のチオールを反応させてスルフィド誘導体を合成した。その結 果、チオピリミジン誘導体（S-Pym体）は精製できたがチオピリジン誘導体（S-Py 体）では精製直後にT-

vinylが生成した。これらの活性化は環内窒素によって分子内 β 脱離反応が進行しビニル基が再生する機構

を考えている。S-Py体の高い活性化能はピリジンの塩基性がピリミジンに比べ強く脱保護反応が顕著に促進 されたためだと考えられる。mRNA との反応を検討した結果、S-Pym 体が T-vinyl やチオフェニル誘導体

（S-Ph体）に比べ高収率に反応した（Fig. 3）。S-Pym保護基によってT-vinylの失活が抑制され、さらに環 内窒素によってビニル基の再生反応が促進されたためだと考えられる。S-Pym体は反応性と安定性を両立し た画期的な分子であると考えている。

2. 鎖内クロスリンクによるi-motifの安定化²⁾

i-motifはシトシン豊富な配列で形成される四本鎖構造であり、その細胞内形成が2018年に初めて蛍光性 抗体によって確認された³⁾。これを契機にi-motif機能や新たな遺伝子発現の機構が解明されることが期待さ

れる。しかしi-motifは中性緩衝液中で不安定であり、その結合分子の創製は困難である。そこで架橋形成に

よって中性条件で安定なi-motif 構造を構築することを目指した（Fig. 4A）。分子モデル計算を基に i-motif 形成配列の5’末端にS-Py体を導入し、酸性条件でのi-motif形成と同時にインターループ領域のアデニンも しくはチミジンに対する架橋形成を狙った。反応生成物をHPLCで精製し、質量分析と酵素加水分解によっ

N X NH2

N X

HN RNA

N X NH2

β

O O HN N N N

O

T-vinyl

O O HN N

Uracil

N N O

S N X H

S-Py(X=CH) S-Pym(X=N)

14 27

70

0 20 40 60 80 100

T-vinyl S-Ph S-Pym Yields with mRNA [%]

5’r- …GGGCGUUAAUCAGAG… -3’

3’OMe- CCCGCAAUUXGUCUC -FAM-5’

Luc mRNA Luciferase coding regions AUG

N N

O N

N O SR

T-vinyl

N N

S-Ph S-Pym R =

0.5 μM Luc mRNA, 7.5 μM ORN 1,50 mM MES, 4 u/μl RNase OUT, pH 7.0, 37^oC, 3 h.

ORN 1

Figure 1. 人工核酸によるRNA部位特異的な修飾反応

Figure 2. S-Py体, S-Pym体の活性化 Figure 3. ルシフェラーゼmRNAに対する架橋形成反応

2

てアデニンと反応した架橋i-motifであることを確認した。架橋i-motifの円偏光二色性スペクトルを測定し、

pH変化に対する286 nmの楕円率の変化を調べた（Fig. 4B）。286 nmの楕円率の低下はi-motifの解離を 示し、架橋型は天然型に比べて中性条件でi-

motifを形成した。さらにi-motifの熱的安定 性も架橋によって向上し、その要因がエント ロピー変化の減少であることを熱力学的に 明らかにした。i-motifを中性条件で安定化で きたことは生理的条件で結合する分子の開 発や結晶構造解析に繋がると考えている。

3. 人工的なmRNA修飾による遺伝子発現制御法への展開

3-1. クロスリンク修飾によるルシフェラーゼmRNAの翻訳阻害

S-Pym体を組み込んだオリゴ核酸とルシフェラーゼmRNA（Luc mRNA）をインキュベーションした後、

小麦胚芽抽出液を用いて翻訳を行った。翻訳反応液を20 % SDS-PAGEで分析した結果、Luc mRNAのみ、

天然塩基配列をもつORN 2 を用いた場合にはルシフェ ラーゼ（61 kDa）が産生された（Fig. 5A）。一方、S-Pym

体を含むORN 3 を用いた場合にはルシフェラーゼに加

え45 kDa程度の短鎖タンパク質が産生された。この分 子量はLuc mRNA中の標的配列とORN 3が架橋を形成 し、その位置で翻訳が停止したことによって産生される タンパク質の分子量と一致する。さらに翻訳産物のルシ フェラーゼ活性を評価した（Fig. 5B）。その結果、S-Pym 体を含むORN 3は天然塩基配列をもつORN 2に比べ高 効率にルシフェラーゼ活性を抑制し、架橋形成によるア ンチセンス効果の増強が示された。

3-2. 化学修飾による人工mRNAの翻訳制御

人工 mRNA から産生されるペプチドを質量分析可能な評価系を構築し、クロスリンク反応と官能基転移 反応による人工的修飾が翻訳系に及ぼす影響を詳細に調べた。官能基転移反応では人工核酸に6-チオグアニ ン、転移官能基にピリジンモノケトン型構造を用いて中性条件、塩化ニッケル存在下でシトシンを部位特異 的に修飾可能である（Fig. 6）⁴⁾。部位特異的な修飾反応が翻訳系に及ぼす影響評価法の概要図をFig. 7に示 す。人工mRNAはN末側にT7-tag、C末側にFlag tagの二つのタグをもつペプチドが産生されるように設 計されている。タグ間のスペーサー領域中の標的配列に対

して修飾反応を行った後に翻訳を行う。修飾部位で翻訳が 阻害された場合、N末側のT7-tagのみをもつペプチドが 産生され、その定量化がイムノブロットにより可能であ る。一方、修飾位置でコドン変換が起きた場合、T7-tagを 利用したアフィニティ精製による免疫沈降と MALDI-

TOF MSによりその検出が可能である。

人工核酸を組み込んだオリゴ核酸と人工mRNAをイン キュベーションした後、無細胞系タンパク質合成キットで 翻訳を行った。T7-tag を利用したアフィニティ精製を行 い、MALDI-TOF MSで分子量を測定した。その結果、天 然塩基配列をもつオリゴ核酸を用いた場合、完全長のペプ チドが産生された。T-vinyl、S-Pym 体を含むオリゴ核酸 を用いた場合、短鎖ペプチドが産生された。これらの短鎖

cc c c cc ccc

cc c

C-C⁺

i-motif

O N

N N H H

DNA O

N N

N H H DNA

H

i-motif

N N

N N HN

O N

N

cc c c cc ccc

cc c

0 0.4 0.8 1.2 1.6

5 5.5 6 6.5 7 7.5

pH

CD at 286 nm [mdeg]

6.8 6.1

i-motif

Figure 4. (A) 鎖内架橋の形成によるi-motifの安定化, (B) 天然型と架橋i-motifの286 nmの楕円率のpH依存性

(A) (B)

5’

ORN 2, 3

~45 kDa

Stop codon Luciferase 61 kDa

Target site Ribosome

ORN 2,3 3’OMe- CCCGCAAUUXGUCUC -5’

Target site 5’r- …GGGCGUUAAUCAGAG… -3’

ORN 2 (X= A), ORN 3 (X= S-Pym)

A S-Pym

Luciferase→

Truncated

protein → ²⁰₀

40 60 80 100

A S-Pym Control

Relative luciferase activity [%]

(A) (B)

Figure 5. 翻訳産物の(A) SDS-PAGE, (B) ルシフェラーゼアッセイ

Figure 6. シトシン部位特異的な官能基転移反応

SD T7 tag Target region Flag tag

5’ UTR 3’ UTR

mRNA

T7 FLAG

T7

MALDI-TOF MS mRNA SD T7 tag Target region Flag tag

in vitro N

N N N

S NH2

O N

DNA

N N H2N

O RNA Ni²⁺

L L L L

C

5 μM NiCl₂ pH 7.0, 37 ^oC

NH N N N

S NH2

O N

DNA

N N HN

O RNA

Figure 7. mRNA修飾の翻訳に対する影響評価法

3

ペプチドは人工 mRNA 中でクロスリンクを形成した位置でなく、二本鎖を形成した位置で翻訳が停止した ことによって産生されるペプチドと一致する。本結果からクロスリンク修飾は mRNA とアンチセンス鎖の 二本鎖を安定化させる効果があり、その二本鎖でリボソームが停止することによって短鎖ペプチドが産生さ れることが明らかとなった。一方、人工mRNA中のシトシンの官能基転移修飾が翻訳に及ぼす影響を調べた 結果、翻訳阻害やアミノ酸置換が誘発されず完全長のペプチドが産生されることを確認した。本結果から官 能基転移修飾を核酸の遺伝情報に影響しないラベル化法として応用できる可能性を示された。

4. 光誘起反応性をもつアシル転移核酸の開発

4-1. 光誘起反応性をもつアセチル化核酸の設計：シトシン部

位特異的なアシル化法の確立を目指し、光誘起反応性をもつ アシル転移核酸の開発を検討した。N⁴-アシルシトシンの脱ア ミノ化によってウラシルが生成するため ⁵⁾、シトシンのアシ ル化法は塩基編集技術になり得る。そこで N-アシル-7-ニト ロインドリンによるアミンの光アシル化反応に着目し⁶⁾、N- アセチル-7-ニトロインドリン5位と糖1’位を結合させた人工 核酸（5位カップリング体）を設計した（Fig. 8）。その特色 は安定前駆体の光活性化、近接効果によるシトシンアミノ基 特異的なアセチル化反応である。

4-2. 5位カップリング体のRNAに対する光反応検討

5位カップリング体を含むオリゴ核酸の合成をScheme 1に示す。ヘック反応でN-アセチル-5-ブロモ-7- ニトロインドリン1をグリカール2とカップリングさせた。次に糖部ケトンをアルコールへ立体選択的に還 元した。ホスホロアミダイト4へ誘導しオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）に組み込んだ。5位カップリ ング体を含むODN 4と相補的なRNA（RNA 5 (N)）の光反応（λ= 365 nm, 4W）を中性条件、室温で検討 した（Fig. 9）。反応液をHPLC で分析した結果、アセチル化RNA（RNA 7 (N)）は得られなかった（Fig.

9A）。ただし光照射した場合のみ7-ニトロソインドールを含むODN 8が主に生成した。N-アセチル-7-ニト

ロインドリンの光反応はアセチル交換反応（機構 A）と分子内酸化還元反応（機構 B）があり、溶媒の含水 率が高いほど機構Bが優先することが報告されている（Fig. 9B）⁷⁾。これらの結果や知見から活性中間体が 生成したが、そのアセチル基にシトシンアミノ基が接近しないことが考えられる。そこで近接効果の向上を 目指し、柔軟な配向性をもつ非環状体、グアニン類似な配向性をもつ3位カップリング体を設計した。

4-3. 非環状体のRNAに対する光反応検討：非環状体を含むオリゴ核酸の合成をScheme 2に示す。7-ニト

ロインドールをブロモアセチル化し、不斉アルコールとカップリングさせた。次にアセトニド基の脱保護、

ケトンとインドールの還元を行い（インドリン3位dr = 50:50）、インドリン窒素選択的にアセチル化した。

ホスホロアミダイト体8へ誘導しODN 9に組み込んだ。非環状体を含むODN 9と相補的なRNA 5 (N)の光 反応（λ= 365 nm, 4W）を検討した（Fig. 10）。その結果、アセチル化されたRNA 7 (N)は得られなかった

O O DMTrO

N NO2 O

P iPrN

O CN 4

O OH HO

N NO2 O

3 2) Et3N 3HF, THF

1) Pd(PPh3)4, Ag2CO3

1,4-Dioxane, 60 ^oC

3) NaBH(OAc)3, AcOH CH₃CN, 0 ^oC

ODN 4 N

NO2 O

Br O OTBS HO

2 +

1

O O O

N NO2 O

DNA 1) DMTrCl DNA

Pyridine

Cl PO

i-Pr2N CN

2)

DIPEA, CH2Cl2, 0 ^oC

1) DNA synthesizer 2) K2CO3, MeOH 3) aq. AcOH

N= A, G, U, C ODN 4

RNA 5 (N)

5’d-CTTT TTCTCCTTTCT 3’r-gaaa aagaggaaaga

N

N NO2 O

ODN 6

RNA 7 (N)

5’d-CTTT TTCTCCTTTCT 3’r-gaaa aagaggaaaga

N

NH NO2 O

pH 7.0, rt, 7 h hv(365 nm)

5 μM ODN 4, 5 μM RNA 5 (N), 50 mM Phosphate buffer (pH 7.0), 100 mM NaCl, rt, hv(4W, 365 nm)

ODN 4 N

N O O O

DNA HHB ANu

A

B hv

+

ODN 6

ODN 8 N

NO2 O

DNA

O Nu

N NO DNA

NH NO₂

DNA

NH NO

DNA

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Time(min)

RNA 5 (N)

ODN 4 ODN 8 ODN 6

NH NO2 DNA NH

NO DNA→ N

A G U C

Scheme 1. 5位カップリング体を含むオリゴ核酸の合成 Figure. 9 5位カップリング体による RNA の光アセチル化反応

(A) (B)

Figure 8. RNAの光アセチル化反応と塩基編集

N N

O RNA N

N NH2 O O O

DNA

N-Ac-7-NO2indoline

N⁴-Ac-rC

U

O RNA N

N H₂N N

NO₂ O

DNA

) 365nm

O RNA HN N

O

(

NH NO2

O RNA N N O NH

DNA

rC

4

（Fig. 10A）。ただし光照射した場合のみ脱アセチル化されたODN 10, ODN 11、さらに光生成物が得られ た。これらを単離しMALDI-TOF MSを測定すると約1万の値が検出された。この値はRNA 5 (C)とODN 11の分子量の総和に相当し光架橋体の形成が示唆された。そこで光生成物を変性ポリアクリルアミドゲル電 気泳動で分析した（Fig. 10B）。その結果、RNA 5 (C)に比べ分子量の大きい光架橋体の生成が確認された。

4-4. 3位カップリング体のRNAに対する光反応検討：3位カップリング体を含むオリゴ核酸の合成をScheme

3に示す。化合物9とグリカール2をヘック反応で結合し、糖部ケトン、インドールをそれぞれ還元した（イ ンドリン3位dr = 50:50）。次にブロモ化で反応点を制御し位置選択的にニトロ化した。脱ブロモ化した後に ホスホロアミダイト体13へ誘導しODN 12に組み込んだ。3位カップリング体を含むODN 12と相補的な RNA 5 (N)の光反応（λ= 365 nm, 4W）を検討した（Fig. 11）。その結果、どの相補的な塩基に対してもアセ チル化されたRNA 7 (N)がMALDI-TOF MSで検出された。ただしRNA 5 (N)とRNA 7 (N)の混合物として 検出され、アセチル修飾の有無をHPLCで検出することは困難であった。相補的な塩基によらずアセチル化 反応が進行したことから、相補的な塩基に加えその前後のアデニンがアセチル化された可能性が示唆された。

【結論】本研究ではクロスリンク修飾が核酸構造の安定化とmRNAの翻訳阻害に有用なことを立証した。さ らに人工mRNAから産生されるペプチドを質量分析可能な評価系を構築し、mRNAコドン中のシトシンの 官能基転移修飾が翻訳に影響しないことを見出した。また、光誘起反応性をもつアセチル転移核酸を創製し アセチル化RNAの生成を示唆する結果を得た。今後詳細な構造決定が必要であるが、RNA塩基の人工的な アセチル化は世界的にも類例が無く、独創的な反応になり得る。本研究で見出した技術が RNA の化学修飾 法や編集技術として確立され、核酸医薬品や生化学的ツールの基盤研究として貢献できることを期待する。

【引用文献】1) Nishimoto, N. , et al. Nucleic Acids Res. 2013, 41, 6774. 2) Kikuta, K., et al. Bioorg. Med. Chem. Lett.

2015, 25, 3307. 3) Zeraati, M., et al. Nat.Chem. 2018, 10, 631–637. 4) Jitsuzaki, D., et al. Nucleic Acids Res.,2014, 42, 8808. 5) Nowak, I.; Robins M. J. Org. Lett. 2005, 7, 4903. 6) Helgen, C.; Bochet, C.G. Synlett, 2001, 12, 1968. 7) Morrison, J., et al. Photochem. Photobiol. Sci. 2002, 1, 960.

6

NH NO₂ O O

O O

1) NaBH3CN, TFA 2) AcCl, AlCl3

DCE, 80 ^oC,

7 (dr= 50:50) CH2

N NO₂ O

OH HO

O

8 (dr= 50:50) N NO2 O

O DMTrO

O

PO

i-Pr2N CN

1) DMTrCl, DMAP Pyridine

2) ^Cl

PO

i-Pr2N CN

DIPEA, CH2Cl2, 0 ^oC

1) DNA synthesizer 2) K2CO3, MeOH 3) aq. AcOH

N NO₂ O

O DNA O DNA

O

ODN 9 (dr= 50:50) 7-Nitroindole

HN

NO₂ Cl, AlCl3

O Br

DCE, 80 ^oC

O O ONa

THF 5

NH NO₂ O

Br

Scheme 2. 非環状体を含むオリゴ核酸の合成 Figure. 10非環状体による RNA の光アセチル化反応

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Time(min)

N A G U C

RNA 5 (N) ODN 11 ODN 10 Photo-

products

HN NO

DNA HN

NO2

DNA

RNA 5 (C)

Photo- products 5 μM ODN 9, 5 μM RNA 5 (N), 50 mM Phosphate buffer (pH 7.0), 100 mM NaCl, rt, 6h, hv(4W, 365 nm).

N= A, G, U, C 5’d-CTTTXTTCTCCTTTCT 3’r-gaaaNaagaggaaaga ODN 9

RNA 5 (N) X=

N NO2 O

O DNA O DNA

O

(A) (B)

N NO2 O

O O O DNA

DNA

ODN 12 13 (dr= 50:50)

N NO2

DMTrO O O

O PO

i-Pr2N CN

1) DNA synthesizer 2) K2CO3, MeOH 3) aq. AcOH 1) DMTrCl, Pyridine

2) ^Cl

PO

i-Pr2N CN

DIPEA, CH2Cl2, 0 ^oC

9 2

+ ^O

OTBS HO N I

O

10 N O OH HO

O

3) NaBH(OAc)3, AcOH CH3CN, 0^oC

1) Pd(OAc)2, Ag2CO3, P(C6F5)3

1,4-Dioxane, 60 ^oC 2) Et3N 3HF, THF

11 (dr= 50:50) N O OH HO

O

Br

12 (dr= 50:50) N

NO₂

HO O O

OH

H 1) Pd/C, H2

MeOH

CH2Cl2 O N O 2) Br

1) NaNO3

TFA 2) Pd/C, H2

NaHCO3

MeOH

N= A, G, U, C ODN 12

RNA 5 (N)

5’d-CTTT TTCTCCTTTCT 3’r-gaaa aagaggaaaga

N _{ODN 13}

RNA 7 (N)

5’d-CTTT TTCTCCTTTCT 3’r-gaaa aagaggaaaga

N

O pH 7.0, rt, 6 h

hv(365 nm)

5 μM ODN 12, 5 μM RNA 5 (N), 50 mM Phosphate buffer (pH 7.0), 100 mM NaCl, rt, hv(4W, 365 nm) N

O NO2 H

N NO2

6 8 10 12 14 16 18

Time(min)

RNA 5 (N) RNA 7 (N)

ODN 13 ODN 14→

HN NO

DNA HN

NO2

DNA N

A G U C

MALDI-TOF MS (m/z)

N Found Calculated [M-H]^-

RNA 5 (N) RNA 7 (N) A 5288.21,5326.74 5281.85 5323.05 G 5300.69, 5338.97 5297.85 5339.05 U 5261.97, 5300.47 5258.83 5300.03 C 5257.45, 5296.07 5257.84 5299.04

Scheme 3. 3位カップリング体を含むオリゴ核酸の合成 Figure. 11 3位カップリング体による RNA の光アセチル化反応