403 〔澱 粉 科 学(Denpun Kagaku)第40巻 第4号p.403∼406(1993)〕 ノ ー ト
ヒ トで の グ ル コ シ ル ラ ク ト シ ド(O-β-D-Galactopyranosyl
(1→4)-O-β-D-Glucopyranosyl
α-D-Glucopyranoside)
の 消 化 性 と腸 内 細 菌 に よ る 資 化 性
原
浩 司**,藤
田 孝 輝**,中
野 博 文*,桑
原 宣 洋**,北
畑 寿 美 雄*
Digestibility of Glucosyl Lactoside (O-ƒÀ-D-Galactopyranosyl- (1•¨4)-O-1S-D-Glucopyranosyl ƒ¿ -D-Glucopyranoside) in Human and Its Utilization on Intestinal Flora
Koji HARA,** Koki FUJITA,** Hirofumi NAKAN0,* Nobuhiro KUWAHARA** and Sumio KITAHATA*
* Osaka Municipal Technical Research Institute (1-6-50, Morinomiya, Jyoto-ku, Osaka 536, Japan) ** Carbohydrate Research Laboratory
, Ensuiko Sugar Refining Co., Ltd. (13-46, Daikoku-cho, Tsurumi-ku, Yokohama 230, Japan)
O-ƒÀ-D-Galactopyranosyl-(1•¨4)-jS-D-glucopyranosyl ƒ¿-D-glucopyranoside(glucosyl lactoside, GL-95) was hardly hydrolyzed by human saliva, artificial gastric juice and porcine pancreas , but was hydrolyzed about 30% by rat intestinal aceton powder in vitro.
GL-95 was selectively utilized by Bifidobacterium, and hardly utilized by Clostridium, Eubacterium and Escherichia.
近 年,ビ フ ィズ ス 菌 の 選 択 的 な 増 殖 促 進 機 能1)を 有 す る さ ま ざ ま な オ リゴ糖 につ い て の 研 究 が 盛 ん に行 わ れ て い る.こ れ ら の オ リゴ糖 は,主 に 酵 素 の 糖 転 移 反 応 を利 用 し て合 成 され て い る.た と え ば,シ ョ糖 か ら β一フ ラ ク トフ ラ ノ シ ダ ー ゼ を 用 い て フ ラ ク トオ リ ゴ糖2),ま た 乳 糖 か ら β一ガ ラ ク トシ ダ ー ゼ に よ りガ ラ ク トオ リゴ糖3), マ ル トー ス か ら α一グル コ シ ダ ーゼ に よ りイ ソ マ ル トオ リ ゴ糖4),乳 糖 と シ ョ糖 か ら β一フ ラ ク トフ ラ ノ シ ダ ー ゼ に よ り乳 果 オ リ ゴ5)(商 品 名)が,そ れ ぞ れ 工 業 的 規 模 で大 量 に 生 産 され,ビ フ ィズ ス菌 の 増 殖 因 子 と し て利 用 され て い る. 最 近,著 者 らは シ ク ロマ ル トデ キ ス ト リン グ ル カ ノ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ(以 下,CGTaseと 略 称 す る)の 分 子 間 転 移 反 応 を 利 用 し て,澱 粉 と乳 糖 よ り非 還 元 性3糖 グ ル コ シ ル ラ ク ト シ ド(0一 β一D-galactopyranosyl-(1→4)-β-D-91ucopyranosyl α-D-glucopyranoside,以 下GLと 略 称 す る)が 効 率 よ く合 成 され る こ とを 報 告 し た6).本 報 文 で は,GLの 消 化 性,な らび に 腸 内細 菌 に よ る資 化 性 につ い て 報 告 す る. 実 験 材 料 と 方 法 1.酵 素 お よ び 糖 質 唾 液 は ヒ トの 唾 液 をMcllvaine緩 衝 液(pH6.0)に 対 して 十 分 透 析 した も の を 用 い た.人 工 膵 液 と して は ベ ー リン ガ ー ・マ ン ハ イ ム 山 之 内 ㈱ 製 の ブ タ膵 臓 α一ア ミ ラ ーゼ をMcllvaine緩 衝 液(pH6.6)に 対 して 十 分 透 析 した もの を 用 い た.小 腸 粘 膜 酵 素 は シ グ マ 社 製 の ラ ッ ト小 腸 ア セ トン粉 末 を 用 い た.Bacillus stearothe-*大 阪 市 立 工 業 研 究 所(536大 阪 市 城 東 区 森 之 宮1-6-50) **塩 水 港 精 糖(株)糖質 研 究 所(230横 浜 市 鶴 見 区 大 黒 町 13∼46)
404澱 粉 科 学 第40巻 第4号(1993) rmophilus由 来 のCGTaseは,(株)林 原 生 物 化 学 研 究 所 製 の も の を 用 い た. メ イ オ リゴ ・P(糖 組 成:単 糖,1 .5%;シ ョ糖,2.6%; 1一ケ ス トー ス,41.0%;ニ ス トー ス,45.8%;1F一 フ ラ ク トシ ルーニス トー ス,9.0%)は 明 治 製 菓 ㈱ 製 の もの を 用 い た. 2.分 析 方 法 全 糖 量 は フ ェ ノ ー ル ー硫 酸 法7),還 元 糖 量 はSomogyi-Nelson法8・9)で そ れ ぞ れ 測 定 した .高 速 液 体 ク ロマ トグ ラ フ ィ ー(HPLC)は 以 下 の よ うな 条 件 で行 った.カ ラ ム:Asahipak NH2P-50(4 .6×250mm,旭 化 成 工 業 ㈱ 製),溶 媒:ア セ ト ニ ト リ ル:水=70:30,流 速:1.O ml/min,カ ラ ム温 度:35℃,検 出 は示 差 屈 折 計 を 用 い て 行 っ た. 3.グ ル コ シ ル ラ ク トシ ドの 調 製 B.stearothermophilus CGTase(70,000U)を 可 溶 性 澱 粉1009と 乳 糖1009の 混 合 液lz(pH6.0)に 加 え, 50℃ で20時 間 反 応 させ た.そ の 反 応 液 を 酢 酸 ア ニ リン で 処 理 し,還 元 糖 を 除 去 した 後10),活 性 炭 ク ロマ トグ ラ フ ィ ー,高 速 液 体 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー に て 分 画 し,GL 標 品(179)を 得 た.そ の全 糖 量 と還 元 糖 量 を 測 定 した 結 果,グ ル コー ス に換 算 し て約5%の 還 元 糖 を 含 ん で い た.以 後,用 い る標 品 をGL-95と 表 記 す る. 4.酵 素 活 性 測 定 法 唾 液 お よび 膵 液 の 酵 素 活 性1単 位 は,1.0%の 可 溶 性 澱 粉 か らpH6.0,37℃ で1分 間 に1.0μmolの グ ル コー ス に相 当 す る還 元 力 を 与 え る酵 素 量 と した .小 腸 粘 膜 の 酵 素 活 性1単 位 は,1.0%の マ ル トー ス か らpH 6.0,37℃ で1分 間 に1.0μmolの マ ル トー ス を 加 水 分 解 す る酵 素 量 と した. 5.消 化 性 試 験 消 化 試 験 は 岡 田 らの方 法11)に準 じた.す なわ ち,GL-95を209摂 取 した 場 合 で 条 件 を 想 定 し,以 下 の よ うに 行 っ た. 1)唾 液 に よ る加 水 分 解 400μ1の2%GL-95(1mM塩 化 カ ル シ ウ ム を 含 む 50mM McIlvaine緩 衝 液,pH6.0)に50μ1の ヒ ト唾 液(8単 位/ml)を 加 え37℃ で30分 間 反 応 後,100℃ で5分 間 加 熱 し反 応 を停 止 し た. 2)胃 酸 に よる加 水 分 解 400μ1の2%GL-95に200μ1の50mM塩 酸 一塩 化 カ リウ ム緩 衝 液(pH2.0)を 加 え,37℃ で100分 間 反 応 後,10mMの 水 酸 化 ナ トリ ウ ムで 中 和 し,反 応 を 停 止 し た. 3)膵 液 に よ る加 水 分 解 400ulの1%GL-95(1mM塩 化 カ ル シ ウ ム を含 む 50mM McIlvaine緩 衝 液,pH6.6)に120μ1の ブ タ 膵 臓 α一ア ミラ ー ゼ(7.8単 位/m1)を 加 え,37℃ で6時 間 反 応 後,100℃ で5分 間 加 熱 し反 応 を 停 止 した. 4)小 腸 粘膜 酵 素 に よ る加 水 分 解 400μ1の1%GL-95(50mMMcllvaine緩 衝 液, pH6.6)に40μ1の 小 腸 粘 膜 酵 素 液(4.5単 位/m1)を 加 え,37℃ で5時 間 反 応 後,100℃ で5分 間 加 熱 し反 応 を 停 止 した. 以 上 の処 理 後,HPLCに よ り 糖 組 成 を 分 析 し,加 水 分 解 率 を次 式 に よ り算 出 した. 加 水 分 解 率(%)=(Po×Co-Pr×Cr)/(Po×Co)×100 な お,Po,Prは そ れ ぞれ 消 化 処 理 前 後 の 糖 組 成 か ら見 たGLの 純 度,Co,Crは そ れ ぞ れ 消 化 処 理 前 後 の 糖 濃 度 を示 す. 6.腸 内細 菌 に よ る 資 化 性 In vitroで の腸 内 細 菌 に よ るGL-95の 資 化 性 試 験 は, ヒ ト由 来 腸 内細 菌 の代 表 株71株 を用 い て 行 った.そ れ ぞ れ の菌 株 を 日水 製 薬 製GAMブ イ ヨ ン にFildes solu tionO.4%を 添 加 した 培 地 で37℃,24時 間 前 培 養 し, そ れ を 各 試 料0.5%を 含 む 滅 菌 したPYF培 地12)に1/50 量 接 種 し た.37℃,96時 間 嫌 気 培 養 後pHを 測 定 しpH が どれ だ け低 下 し た か で 資 化 性 の有 無,ま た は強 弱 を 判 定 した. 判 定 基 準 6.0≦pH...-5.5≦pH<6.0...± 5.0≦pH<5.5....十 4.5≦pH<5.0…〓 pH<4.5…〓 実 験 結 果 と 考 察 1.消 化 性 試 験 試 験 は それ ぞ れ3回 行 った が,GL-95は ヒ ト唾 液,人 工 胃液,ブ タ膵 臓 α一ア ミラ ー ゼ に よ っ て ま っ た く 分 解 され な か った.し か し ラ ッ ト小 腸 粘 膜 酵 素 に よ り平 均 約 30%(±4%)分 解 さ れ た.こ れ ら の こ どか ら,摂 取 し たGL-95の 半 量 以 上 は 生 体 内 で 大 腸 に まで 達 す る も の と推 定 さ れ た が,さ ら にin vivoで の 検 討 の 必 要 性 も 示 唆 され た. 2.腸 内細 菌 に よ るin vitroで のGL-95の 資 化 性 In vitroで の 腸 内 細 菌 に よ るGL-95の 資 化 性 の 結 果 を 表1に 示 した.ま た,対 照 と して 行 った メ イ オ リ ゴ ・
ヒ トで の グ ル コ シ ル ラ ク トシ ドの 消 化 性 と腸 内 細 菌 に よ る 資 化 性405
406澱 粉 科 学 第40巻 第4号(1993) P,グ ル コ ー ス の 結 果 も同 様 に示 した.GL-95はBifi dobacterium属5株 に よ り比 較 的 よ く資 化 さ れ た .ま た ヒ トの健 康 に望 ま し くな い とい わ れ るBacteroidesで 資 化 性 が認 め ら れ る が,Clostridium,Eubacterium, Escherichiaで は ほ とん ど資 化 され な か った.こ れ らの 結 果 は,対 照 と し て用 い た メ イオ リ ゴ ・Pと 類 似 し て い た.し か し ヒ トの 健 康 に 望 ま しい と い わ れ るLactoba cillusに つ い て は,メ イ オ リゴ ・Pよ り資 化 性 が 劣 っ て い た. 以 上 の よ うに,グ ル コ シ ル ラ ク ト シ ド(0-β-D-gala-ctopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl α-D-glucopy-ranoside)は,人 工 消 化 酵 素 系 で の 消 化 試 験 で は,小 腸 粘 膜 の酵 素 系 で の み 約30%分 解 され た.ま た,Invitro で の腸 内 細 菌 に よ る資 化 性 試 験 で は,Bifzdobacterium に よ く資 化 さ れ,他 の 腸 内細 菌 に よっ て は ほ とん ど資 化 され ず,ビ フ ィ ズ ス菌 の 選 択 的 糖 源 で あ る こ とが 示 唆 さ れ た. 本 実 験 を 行 うに あ た り,B.stearothermophilusの 生 産 す るCGTaseを 御 恵 与 くだ さ い ま した(株)林原 生 物 化 学 研 究 所 に 厚 く御 礼 申 し上 げ ます. 文 献 1) 光 岡 知 足:「 腸 内 菌 の 世 界 」,叢 文 社,東 京(1980). 2) 日 高 秀 昌,栄 田 利 章,足 立 堯,斎 藤 安 弘:農 化, 61,915-923(19$7). 3) 松 本 圭 介,小 林 洋 一,田 村 な つ 子,渡 辺 常 一,菅 辰 彦:澱 粉 科 学,36,123-130(1989). 4) 菅 野 智 栄:澱 粉 科 学,37,87-97(1990). 5) 藤 田 孝 輝,大 沢 武 司,三 国 克 彦,原 耕 三,橋 本 仁,北 畑 寿 美 雄:澱 粉 科 学,38,1-7(1991).
6) S.KITAHATA, K.HARA, K.FUJITA, H.NAKANO, N.KUWAHARA and K.KOIZUMI: Biosci. Biotech. Biochem., 56,1386-1391(1992).
7) M.DUBOIS, K.A. GILLES, J.K.HAMILTON, P.A REBERS, and F. SMITH: Anal. Chem., 28,350-356(1956).
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(1987).
11) 岡 田 勝 秀,米 山 勝,万 代 雅 彦,阿 賀 創,堺 修 造,市 川 富 夫:栄 食 誌,43,23-29(1990).
12) L.V.HOLDEMAN, E.P. CATO and W.E.C. MOORS: Anaerobe Laboratory Manual 4th ed.,
Anaerobe Laboratory Virginia Polytechic Insti tute and State University, Blacksburg(1977).
