食品中のセレン定量法
河 上略 子
セレン（Se）は土壌，植物，及び海水など地球上に広く分布している。これまで食品中の
Seが問題視されたのは，他の多くの超微量元素（Ultra micro elements）と同じく，その
1） 毒性についてであった。ところが近年，Seの食品・栄養学的な意義が認められ，それに関す る文献がみられるようにな。た．例え1武S，hwar・、＆F。1・、81並び1．Bier’1ま，含硫 アミノ酸あSにSeが置換したSelenomethionineやSeleno−cystiueが，ニワトリの組織内 で抗酸化剤の働きをすると報告している。血清グロブリン中のSeleno−lipoprotein画分 において，α一トコフェロールの運搬体となったり，、α一トコフェロールの破壊を防止したり， 細胞膜透過性に寄与するという”5’6） 以上のことから，食品のSe含量に関心が持たれるのは当然であるが，極めて微量のため 測定方法の選択が重要である。 3，3Lジアミノベンチジン（以下3，3’一DABと略す）は，酸「生溶媒中で選択的にSeと結 7，8）合し，黄色の化合物：ピアセノール（Piaselenol）を生成する。
。爵b《ゴ瓢＋・ q一鷲露マー
3＿3di。mi。。 b。。、idine lpiaselen・1
9） このピアセレノールを中性でトルエンを抽出したものは，420㎜μに最大吸収をもっている。 0一フェニレンジアミンは，上に述べた3，3LDABの半分子であるが，3，3’一DABより 10） 11） 秀れているので，これを利用して食品中のSe定量が行なわれている。この場合，トルエン抽 出液の最大吸収は335刎μ，反応式は次のとおりである。
〔〕〔設＋賜一〔〕〔〉＋・比・
0−phenylendiamine piaseleno1 著者は，この原理を応用して行われた前文に基づき，若干の検討を加えた。 実験の方法 1．分光光度計は日立製123型SpectropLotometer，pH計は日立・堀場製pH meterを 用いた。 2．試薬はすべて特級，それを溶解するために用いた水は，脱イオン水を硝子蒸留器で 再蒸留したものである。 3．分解剤は，モリブデン酸ナトリウム10gを水15伽！に溶解し，濃硫酸15伽！を徐々に加 え，放冷した後70％過塩素酸液200㎡を加えたものを用いた。 4．標準Se溶液を用いた予備実験の結果，（1）最大吸収は，水で抽出する場合もトルi。．、 寄D・且 ① ② ④ ③ 300 350 40D Wave［en呂山〔mμ｝
Fig Absorb盃口ce curves of pia5denol aqueous solution ㊥h巴ny［endiamine i” waヒer a巳 pH 2−3 （cロrve h｝ 2馳区oISe in 50m【ofwa量er at pH 2−3 （cロrve2｝ 師henylenediロ旧ine in waしer at pH 6−7 〔ロorve 3） 25μ臼of Se in 50ml of water飢pH 6−7 〔curvε4）
、V・【Er 3s brank 0．5 0．3 1。・2 量。、1 詫 エンで抽出する場合も335ημである（Fig．1及び2） pH 2∼3で行う方がpH 6∼7のときよりよい（Kg．1，2及び4） ちピアセレノール生成に必要な0一フェニレンジアミンの量は，試料中のSe 25γまでは， 2∼4％の間では影響がない（Fig．3）；（4）温度条件は，20，25及30℃を比較した場 合，30℃にする．のが最もよい（Fig．5）ことがわかった。 0，5 0．4 0．3 1。，2 岩 詫 o．1 ① ② Wave leng【h〔mμ）
Fig 2． Absorbance cur竪es o正pi日seleロ01 邑oluene solu縫on O雫he闘ylened』min巴 in 【oluene at pH 2−3（curve 5｝ 25ug ofSe i“ 10mlof 』o［ue“e at pH 2−3（curve6｝ 0っhεnylenediaminε in じobe陀e at pH 6−7（Curサe 7） 25ロgof Se in正Oml of！01uene at pH 6−7（curve 8） Tolue皿e as br8nk Tobene ｛c山rve9） ；（2）ピアセノールの生成は， ；（3）発色すなわ 0．5 0，4 0，3 1・．・ 鴛。．1 寄 ② ① 300 350 400 300 350 400 Wave length（㎎） Wave length（mμ＞
Fig 3 E正fect amount o正0・phenylenediamine on colour Fig 4． Effect ofpH on colour devebpment o正piaselenol developmeot of piaselenol The pH was adlusted to 2．00（curve 3）
2ml of O．2％0−phenylenediamine （curve l） T卜e pH was adj usted to 3．1獣curve 4）
4ml of O92％0㍗henylenediamine （curve 2） 従って，Seを含む試料に2∼4％の0一フェニレンジアミン0．2％水溶液を加え，2．5M 蟻酸溶液でpHを1．5∼2．5とし，30℃で2時間室温放置して反応を完了する。 これをトル エンと振盟し，トルエン層を遠心分離した後，上澄液について，分光画面計により335況μ で吸光度を測定することにした。 12） 1，鈴木らの方法の検討 （1） 標準曲線の作成 Se標準液（Se30γ以下）を白色磁製皿にとり，硝酸と少量の塩酸を加え，水浴上で蒸 発乾固する。次に稀塩酸を加え，緩かに加温蒸発し，水50㎡を用いて内容物をビーカーに 移し，2．5M蟻酸溶液でpHを1．5∼2．5に調節した後，〇一フェニレンジアミンを加え，生成 したピアセレノールを比色する。
（2）回収実験
脱脂乳25㎡を500㎡キェルダールフラスコにとり，Se25γを含む標準液と硝酸40㎡を加 え室温で一昼夜放置後，弱く加熱して試料を半分解する。放冷後硫酸と過塩素酸をそれぞ それ10・泌加えて加熱灰化する。灰化試料を約20㎡の水で白色磁製皿に移し，7Mアンモニ ア水で硫酸を中和した後，塩酸ヒドロキシルアミンを加え，約50℃の水浴上で1時問加温．する。これを硝子フィルター（3G−4）で吸引濾過し，冷水で白色の硫酸アンモニウムの 沈澱を溶解濾過すると，フィルター上に赤色のSe元素が残る。1硝酸3㎡と塩酸1㎡を加え 5分間放置後，吸引濾：過し，約30㎡になるように水で洗浄する。最：初に使用した白色磁製 皿に溶液を移し，約80℃の水浴上で蒸発乾固後，0．1N塩酸5㎡を加え，約60℃で30分加温 蒸発してビーカーに移し，上述と同様の比色を行う。 ③o，5 o、‘ ロ ヨ 葺。，2 L、 8 o、5 0．4 0．3 量… 寿。．、 O io 20 30 0 10 20 30 Se 〔μ9） S嬉 （μ9〕
Fig 5． Calibratioh⊂urvεs fDr selenium 日t varbus巴emp． Fig 6． C皿1ibr庶iDn cロrve for 3el曾niu附 sDlutlon
C8hbratiQn 仁“rワe aL 20●C〔Curve 1｝ Ca【ibration curve aと 25，C（curve 2） CdibratEoo curva a吐 30，C‘curve 3）
（3） 結果と考察
Se元素の処理条件を第ユ表に示すように変えて標準Seの吸光度を求めた。第2表に示 すとおりである。Seの損失は水浴上での蒸発乾固と加温蒸発でかなり生じている。この結 果に基づき，IIIの処理方法で行った標準曲線をFig．6に示した。また，脱脂乳25㎡にSe25 γを添加しての灰化条件とSeの回収率を第3，および第4表に示した。鈴木ちは，88∼98 第1表 Se元素の処理条件 1 II 皿 硝酸（㎡）一塩酸（㎡） 5 − 2 3 − 1 3 − 1 蒸 発 乾 固 沸 騰 水 浴 上 沸 騰 水 浴上約80℃水浴上
稀 塩 酸 1 N − 3 ㎡ 0ユ N − 10 ㎡ QI N − 5 ㎡ 加 温 蒸 発約100 ℃乾固
約80℃で30分加温 60℃で30分加温発 色 時 PH
2．4 ∼ 2．5 2．0 ∼ 2．1 2．0 ∼ 2．2 第2表 Seの定量に及ぼすSe元素の処理の影響 吸光度（335ημ） 処 理 条 件 Se（γ） 1 IIm
0 0 0 0 5 0，004 0，076 0，065 10 0，018 0，137 0，133 15 0，020 0，053 0，197 20 0，030 0，216 0，248 25 0，316 30 0，361％（平均93．4％）の回収率を示しているが，著者の成績は30∼36％で悪かった。このよう なSeの損失がどこで起こるかに問題があるが，灰化，還元，分離溶解，乾固等でかなり 起こっているものと思われる。還元操作では塩酸ヒドロキシルアミン量と還元促進条件を 変えて行ってみたが，あまり改善は認められなかった。Seの濾別に使用する硝子フィルタ ーの目の大きさにも注意しないとSe元素の損失が起こるものと思う。 第3表 試料の灰化条件及びSe回収率
試料
半分解の時間 灰化の時間 吸光度（3翫μ） 回 収 Se 回 収 率 1 45（分） 10（分） 0，072 5．6（γ） 22（％） II 45 54 0，078 6．2 26m
45 50 0，081 6．4 26 脱脂乳 25㎡ 添加Se25γ 硝酸 40㎡ 硫酸，過塩素酸各10㎡ 第4表 塩酸ヒドロキシルアミン添加量の差異による灰化条件とSeの回収率謂
半分解の時問 灰化時間 塩酸ヒドロキ ルアミン量 吸光度（335蹴μ） 回 収Se 回 収 率 1 45（分 50（分） 0．5 9 0，114 9．0（γ） 36（％） II 45 60 1．0 0．103 7．4 29．6 II． （1） 13） Cumminsらの方法の検討 標準曲線の作成 脱脂乳 25㎡添加Se 25γ 硝 酸 40㎡硫酸，過塩素酸各・10㎡Se30γまでを含む標準液を水で約25㎡とし， Hydrobromic acid−Bromine溶液3∼4滴
を加える。2．5M蟻酸溶液5㎡でpHを1．5∼2，5に調節後，0一フェニレンジアミンを加え， 発色後比色する。得られた標準曲線は，Fig．7に示す。 0、6 0，5 0．4 o．3 豊… 1… 0 ．“， 11I 聯 ビく ひ （2）回収実験F‘g7層αIib「a巳i㎝…悟「sden山…b…
脱脂乳1∼2㎡にSe標準液を添加し， Digestion Mixture 10㎡を加えて加熱灰化する。 灰化が終了すると無色透明になる。灰化終了後，放冷し，少量の水で管壁を洗い，塩酸5 飛！とアスコルビン酸2gを加える。 （溶液は緑色になる）放置後，硝子フィルター（3G −4）で吸引濾過し，水で余分なアスコルビン酸を洗い流す。フィルター上に残ったSe元 素を，Hydrobromic acid−Bromine溶液1泌を加え，5分放置してSeを完全に溶解する。吸
準曲線同様に比色する。
（3）結果と考察
脱脂乳1㎡にSeを10∼25γ添加し，回収率を求めた。その結果を第5表に示したが，60 ∼80％の回収率であった。この場合も，1と同じく，Seの損失は灰化，還元，分離，溶解 等で起こっているものと考えられる。脱脂乳2肌／に灰化前と灰化後にSeを添加した場合の 回収率から，灰化時の損失を検討した結果が第6表である。Cumminsらは灰化温度170℃ 位，灰化時間が20分以内ではSeの損失はないといっている。 しかし，本実験では3％の 損失が認められた。次にアスコルビン酸2gを加えて30℃で12時間放置後のSeの回収率か ら，還元のときの損失を調べたところ，80％位だった（第7表）。このことから，還元時間 は45∼60分で充分と思う。その他Se元素の分離および溶解においても，．Seの回収が行わ 淑ているかどうか疑問である。 この定量法に従えば，平均80％の回収率があげられる。 しかし，多量の試料を灰化しなければならない場合（多くの食品がそうであるが）まだ検 討の余地が残されている。 第5表 試料の灰化時間及びSeの回収率Se添加量
灰化時間
吸光度（335皿μ） 回 収 Se 回 収 率 。（γ） 10（分） 0 一 （γ） 一（％） 10 15 0，135 8．0 80 20 15 0，197 11．8 59 25 15 0，317 19．0 76 脱脂乳 1㎡，Digestion Mixture 10㎡ 第6表 Seの回収率に及ぼす灰化の影響Se 添加量
灰化時間 吸 光 度 i335呪μ）回収Se
回 収 率 灰 化前 灰 化後 0（γ） 0（γ） 15（分） 0 一（γ） 一（％ 0 9 15 0，125 7．5 83 9 0 15 0ユ23 7．2 80 第7表 Seの回収率に及ぼす還元条件の影響Se添加量
灰化時間
吸光度（33騙μ） 回 収 Se 回 収 率 0（γ） 15 0 一（γ） 一（％） 一 『 15 20 0，200 12 80 20 24 0，220 13 65 25 20 0，340 20 80 脱脂乳 2㎡，Digestion Mixture 10㎡のロ III， Cumminsらの改良法の検討 （1） 標準曲線の作成 Se 30γまで含む標準溶液をDigestion Mixture 5㎡とともに加熱灰化する。放冷後， 内容物を約20㎡の水でビーカーに移し，肝cresol purpleを指示薬として飽和水酸化ナト リウムで硫酸を中和する。次に90％蟻酸溶液2㎡を加えてpH 2∼3に調節後，過剰の酸化 試薬を還元するために40％塩酸ヒドロキシルアミン溶液と妨害イオンを除去するために0．2 MEDTA溶液4㎡を加える。90％蟻酸溶液でpHを1．5∼2．5に調節後0一フェニレンジアミン を加え，発色後比色する。得られた標準曲線はFig 8に示す。 o．6 0．5 o．4 エレロヨ 葺。．2 茎。．、 Se〔昭｝
Fi区 8． Calibr飢ion curve ror selenium solution
（2）回収実験
ねぎ（白色部，緑色部 それぞれ輪切りにし，45℃で通風乾燥し，乳鉢で粉状にしたも の）にSe標準液を加え，これをDigestion Mixture 10㎡と共に加熱灰化する。放冷後， 約20㎡の水でビーカーに移し，上述と同様に比色する。また別に，1本のねぎを上述の様 に粉状とし，4gを100㎡キェルダールフラスコにとり硝酸20㎡を加え，一昼夜放置後，キ ェルダールフラスコの頭部に小さいロートをのせ，弱火で半分解する。半分解後，ロート を除去してDigestion Mixture 10㎡とともに灰化する。以下上述同様に比色する。（3） 結果と考察
乾燥白色部ねぎ2g，緑色部2gを灰化後，比色定量し，又， Se10γを添加したものに ついてもSe含量を求めた。これを第8表および第9表に示した。回収率は86∼90％であっ た。灰化の際にSeの飛散が生じている為であろう。灰化を緩かに行うために試料を硝酸で 第8表 白色部ねぎのSe含量及び回収率 試 料 添 加Se 灰化時間 吸光度（335πμ） Se含 量 回 収率 0（9） 0（γ） 5（分） 0 0 （γ） 一 （％） 2 0 8 0，012 0．8 一 2 0 4 0，010 0．8 一 2 0 5 0，009 0．7 一 2 0 5 0，009 0．7 一 2 10 25 0，132 9．4 86−87 2 10 11 0，135 9．5 87−88第9表．緑色部ねぎのSe含量及び回収率 試 料
添加Se
灰化時間 吸光度（33駒μ Se 含量 回 収率 0（9） o（γ） 5（分） 0 0 （・γ） 一（％） 2 0 10 0，013． 0．9 一 2 0 13 0，013 0．9 一 2 10 15 0，135 9．5 86 2 10 14 0，139 9．9 90 半分解後，D塘estion Mixtureを加えて灰化すると第10表に示すように回収率は99∼103％で あった。これは灰化においてガスの炎を小さくして灰化時間を長くかけたこと，また，硝酸 分解中においてキェルダールフラスコの頭部に小さいロートをつけてSeの飛散と硝酸の減 少を防ぎながら分解が行われ，Digestion Mixtureを加えた後の激しい酸化が緩かになっ たことによるものと考えられる。 灰化の影響をみるため，試料を2，4，6gとして実施し てみたが，6g以上では，いくら弱火でも硝酸分解中に突沸がおき，灰化できなかった。 このことから，一般にSe含量の少ない食品ではこの方法によるSe定量は困難であるか もしれないが，1ppm以上のSeを含む試料においては，この定量法が充分適用できると思 われる。 第10表 ねぎのSe含量及び回収率 試 料添加Se
硝酸分解時空 灰化時間 吸光度（335瑠） Se 含量 回 収率 0 0（γ） 0（分） 10（分） 0 0 （γ） 一（％） 4 0 10 150 0，020 1．5 一 4 0 20 150 0，020 1．5 一 4 10 10 165 0，162 11．4 99 4 10 20 150 0，167 11．8 103 要 約 近年，Seの生化学的意義が注目されるようになったので，食品中のSe定量法について 検討した。その原理は，Seが0一フェニレンジアミンと反応して，黄色のピアセレノール を生成するので，これをトルエンで抽出して吸光度を測定することにある。 比較検討したものは， （1） 鈴木らの方法， （2） Comminsらの方法， （3） Comminsらの改良法であって，次のような結論に達した。 （1） の方法では，灰化，還元，濾過，分離，溶解，蒸発乾固等の処理におけるSeの損 失が多く，このため，回収率（30∼36％）が低いので，Seの定量には不適当であると考え た。 （2）の方法は（1）に比べて灰化時間の短縮と蒸発乾固の省略ができるため，回収率は 平均80％であった。灰化過程におけるSe損失はほとんど認められず， Digestion Mixtureだ検討の余地が残っている。 （3）の方法では， （1）及び（2）における還元，濾過及び分離の3操作がないので 回収率は99∼103％までにすることができた。ただし，灰化の条件と方法を注意深く行う 必要がある。Seが1ppm以上も含まれる食品では，灰化のための試料が少なくてすむので 充分使える。しかし，多くの食品では，そのSe含有量が少ないので，多量の試料を灰化し 1なければならない。この場合，乾燥試料を4g以上必要とするときは，灰化方法そのもの に改良工夫をする必要がある。 終りに，本実験の御指導をいただきました広島大学・今村経明教授に謝意を表します。
文献
1）Robinson， W．0．： J． of A．0． A． C．， 16，423（1933）
2） Schwarz， K，＆Foltz， C M．：J． Am． Chem． Soc．， 79，3292（1957）
3） Bieri， J， G．＝Am． J． C貰in． Nutr．， g，89 （1961）
4） Seward， C凡， Vaughan， G， Hore， E． L：Proc． Soc． Exp． Biol． Med、，121，850（1966）
5）Nesheim， M． C，＆Scott， M． L：J． Nutr．65，601（1958）
6） Desai，1． D．，＆Scott， M。 L．＝Arch， Biochem． Biophys．，110，309（1965）
7） Hoste， J．：Anal． Cbem． Acta．， 2，402（1948）
8） Hoste， J．，＆Gillis． J．： ibid．， 12，158 （1955） 9） Cheng， K． L． ： Ana豆． Chem．， 28，1738 （1956）
10） Hinsberg，0。： Ber．，22，2895 （1889）
11） H．Ariyashi：Talanta， 5，112 （1960） 12）鈴木幸夫：四国医誌
13） Cummins， L M．， Martir．」． L，＆Magg， D． D：AnaL Chem．，36，382（1964）
