Bacillus subtilis var nigerの胞子に対する吸・脱湿プロセスの影響
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(2) 512. Bα θ. jJ′. zs sπ. bι. Jjs υ α4″ ″rの 胞子に対する吸・脱湿プロセスの影響 づ. 性 ,耐 紫外線性 な どの水分依存性 の大 明 で あ るが ,微 生物 の耐熱性 ,耐 薬斉」 きさを考えれば興味 ある問題 と言 え よ う。また ,仮 に微生 物 に ヒス テ リシス 現 象 が な い と して も,吸 ・ 脱 湿 プ ロセ ス を経 た 場合 ,生 理的 には何 らか の 4). 影響を うけ るので はな いか と 考 え られ る。 Plitman ら は. S′. θ θπs θ ″り Jθ θ. απ″νSの 増殖可能 な最低 α7が 吸 ・ 脱湿 プ ロセス試料間 で異 な る値 を 示 す 1). と して い るのに対 し,Gilbertら. は エ チ レンオキサ イ ドによ る細菌胞子 の殺. 菌 の場合 , ヒス テ リシス現象 によ る影 響 はほ とん どない と してお り,こ の点 に 関 して も明確 な結 論 は得 られ て いない と考 え られ る。 一 方 ,微 生物 の加熱 ,薬 剤 ,紫 外線処理 に 対す る生残率 と α7の 関係 を み た場合 ,ほ とん どの報告 で は実験 上 の 困難 さと再現性 の点か ら吸湿 プ ロセ ス を経 た試 料 が用 い られ てい るが ,そ れ らの結 果 は必 ず しも一 致 して い るとは 言 えない。種 々の 報告 か ら少 な くと も言 え ることは α70と α71の 間 で. ,. 各処理 に対 して最 も高 い抵抗性 を示 す α7が 存在 す るとい う点 で あろ う。 し か し,脱 湿 プ ロセス試料を用 いた 場合 に も同様 の傾 向 が あるか否 か ,あ るい はまた両 プ ロセス試料間 において生残 率 の差 が見 出 され るのか否 か は検 討 さ れて いない。 したが って ,本 研究 で は. (I)微 生物 の等温吸着 曲線 にお ける ヒス テ リシス現象 の有無 (II)微 生物 の加熱 ,薬 剤 ,紫 外線抵抗性 に及 ぼす 吸 ・ 脱湿 プ ロセス の影響 (III)微 生物 の発芽 ,増 殖 に及 ぼす吸 ・ 脱湿 プ ロセス の影響. ′ グ αγ .″Frの 胞子 を用 いて検討 を加 え ,α 7に 関 s υ の三 点 につ いて B.sabι グ す る基 礎的知見 を得 る ことを 目的 と して行 な った 。.
(3) 513. 浅 田 祥 司. 1章. 第. 細 菌胞 子 の等 温 吸着 曲線. 言. 緒. 1。. 食 品 の等温吸着 曲線 の測定法 と して は重量平衡法 ,マ ノメー タ ー法 な どが あ り,取 り扱 う試料 の量 は方法 に よ つて異 な って い る。微生 物菌体 にお け る αθ 測定例 は少 ないが ,重 量平衡法 が利用 され ,試 料 の量 によ って S.θ θ″υ角グ αγ Jグ s υ の場合 のよ うに i)硫 酸 デ シケ ー タ ー 中で平衡 ,秤 量す る方法,3。 Sab′ グ .. ″多 γ の胞子 や. Sθ. γπ′ αzα κθ sθ θ 4Sの 場合 のよ うに 五)bi― thermal法 で試 グ. 料を平衡 に導 き,石 英 バ ネで重量変化 を追 う方法 が用 い られ てい るQ その結 果 ,i)で は ヒス テ リシス現象 は認 め られず ,ii)で は ヒス テ リシス Jtt υ .″rrの 胞子 ￠γ 現象 を認 めて い る。 そ こで , 本章 で は供試 菌 BO Sab′ グ. の等温吸着 曲線 を求 め ,ヒ ス テ リシス現象 の存在 の有無 を確 かめ るため ,上 記種 々の測定方法 につ いて 検討を加 えた。その結果 ,吸 ・ 脱湿 プ ロセス とも. i)の 方 を採用 す ることに した。. 2.実 験材料及び方法 1)供. 試. 菌. 大阪大学 工 学部 醗酵 工学教室保存 の. グ JJas sab′ Bα θ. Jグ s υ αγ .″ノ γの胞子 を グ. 供試菌 と した。胞子 の調製 には 肉 エ キ ス 1%,ポ リペ プ トン 1%, 食塩 0。. %,. 5. 硫酸 マ ンガ ン0.05%(pH. 7.0)の 培地 を用 い , 30℃ で一 週間振盪培養 した 後 ,遠 心分離 (13,000× 31o分 間 )し た。滅 菌水 で 5回 洗浄後 ,再 び滅 菌水 に懸濁 し,80℃ で10分 間加熱 して栄 養細胞 を死滅 させ た後 ,冷 蔵保存 じ た。実験 には ,固 体 C02と エ タ ノー ル 中で2。 5分 凍結 し,数. mmHgで 約24. 時間真空乾燥 した 胞子 を使用 した。. 2)湿. 度 の調整. 次 に示 す塩類 の過飽和溶液を約 5J容 デ シケ ー タ ー に入 れ ,所 定 の 雰囲気 を調整 した。. RHの.
(4) 5」. 4. Bα θ Jzs sπ j′. b′. α4れ多rの 胞子に対する吸・脱湿プロセスの影響 づ Jお υ. RH 33% CaC12 RH 53% NiC12. RH 75% NaCI RH 85% KCI RH 100% H20 3)等 温吸着曲線の測定 約. 100mgの 凍結 乾燥胞子 を秤量 びん. を均 一 に した後 , 各. (約. 20 ml容 )に 静 かに入 れ ,表 面. RHに 調整 したデ シケ ー タ ー に入 れた。 最初 の減 圧 操. 作 の 際 ,試 料 の飛散を防 ぐために常圧 の まま約 24時 間 ,37℃ の恒温箱内 に放 置 し,あ る程度 水分を吸収 させ た後 に測定 を開始 した。 秤量 びんを入 れたデ シケ ー タ ー は約. 15 mmHgま で減圧 に した後 ,37℃ の. 恒 温 箱 に入 れ ,24時 間 ご とに微量天秤で秤量 し, 2日 後 に恒 量値 を得 た。そ の後 ,す べ ての試 料を. RH 100%に 調整 したデ シケ ー タ ー 内に移 し,恒 量値. を得 た 時を吸温 プ ロセス によ る試験 の終了 と した。 その後 , 再 び試 料 を 各. RHに 調整 したデ シケ ー タ ー に移 し,同 様 に脱湿 プ ロセ スでの測定を行 な っ た。なお ,試 料 の乾燥 重量 は吸 ・ 脱湿 プ ロセ スでの試験 を終了 した後 ,す べ ての試料 を シ リカゲ ル と五酸化 リンで に入 れ ,約. RH O%に. 調整 したデ シ ケ ー タ ー 内. 15mmHgの 減圧下 で24時 間 ご とに秤量 し, 2日 後得 られた恒量. 値 を乾燥 重量 と した。. 3。. 実 験結果及び考察. 本研究 で は等温吸着 曲線 の 測定方法 と して , i)Taメ orの マ ノ メ ー タ ー 法 ,ii)bi― thermal法 ,面 )微 結 晶 セル ロース (商 品名 :ア ビセル SF)を carrierと して各. RHに 調整 したデ シケ ー タ ー 内で平後iさ せ る方法 ,iV)従. 来 のデ シケ ー タ ー法 の計 4通 りにつ いて 検討を加 えたが. ,. i)で は ,真 空保持 の 困難 ii)で. は ,低 温部 と高温部 の各 温度 コ ン トロールの 困難,高 温部 か ら低温部. へ の水 分移動 の不 円滑 (凝 縮 のため).
(5) 田 祥. 浅. 515. 司. ︵ Ｉ ︶〓 Ｅ∽ ち日 Ｅｏｏ３飩. ︵ ヽ ︶留 Ｅ∽ち日 〓ｏｏお鮎. 20. 40. 60. Relative hunlidity Fig。. 1. 80. 0. 10o. Moisture content of Bo sab′ Js Fig。 2 j′. × :adsorption, o:. 40. Relat市 c. υ α4 πZgθ r Spores as a function of relative hurnidity. 20. (%). at 37° C。. 60. 80. 100. humidity(%). Jづ s ゝ4oisture content of」 B. sabι づ α4 ηigθ r spores as a function υ Of relat市 e humidity at 25° C(by. l). desorption. Gilbert θια. J。. ×. ).. :adsorptiOn,o:desorption. 面 )で は ,微 結 晶1セ ル ロースの 減圧操作 中 での飛散 とい った 問題点 があ り,最 終的 に 市)の 方法 で求 めた結果 が また ,Fig。. 2に は参考 までに GHbertら. 1)の. Fig。. 1で あ る。. 25℃ にお ける測定結果 を示 した。. 1%以 内 の水分含有量 の差 は測定誤差 範囲 とす ると,. Fig。. 1で 示 した通. り, 本 実験操作範 囲内 で は ヒス テ リシス 現象 は認 め られなか った。Fige 2 の場合 ,吸 ・脱湿両 プ ロセス間 での水分含有量 の差 は平均 4%で あ つて , ヒ ス テ リシス現象 は存在す ると してい るが,測 定温度 が 25℃ と 10℃ 以上低 い こと,測 定方法 の記載 がない ことか ら今 回得 た結果 と正 確 に比 較す ることは 困難 で あ る。 しか し,一 応 ,両 者 を比 較す ると,Fig。 1で は RH O∼ RH. 75. %の 範 囲内 の各 RHで Fig.2に 比 べ 約 5%前 後水分合有 量 が 低 く,RH 100%で は約20%前 後低 くな って い る。 この相違 は採用 した 測定方 法や それ に伴 う測定誤差 の程度 に大部分依存 してい ると思 われ る。 特 に ,. RH 100%. で 約 20%も 異 な って い る点 は秤量 びん 内 の凝縮 した水分 を如何 に評価す るか 即 ち,RH. 100%で の恒量値 を如何 に決定 したのかの違 いによ るた めで あ ろ. ,.
(6) 51δ. Bα θ Jas sπ jι. bι. jJjs. υ α4 ηな γの胞子に対する吸・脱湿プロセスの影響. う。 さ らには ,菌 株 や胞子調製条件 な どの相違 も考慮 す る必 要 があ ると思 わ れ る。. Fig.1で は , みか けの ヒス テ リシス現象 も認 め られ なか った 。 これ は脱 湿 プ ロセス部分 の測定 の 際 ,凍 結 乾燥胞子 を. RH 100%デ シケ ー タ ー 内 で. 平衡到達後 に脱水 してい く方法 を採用 し,第 2章 の実験 で 用 いた試料 の調製 法 の如 く, 懸濁液 か ら所定. RHに まで脱水 してい く方法を採用 しなか った. ためか も しれな い。 さ らに細菌胞子 の等温吸着 曲線 にお け る ヒス テ リシス現象 を考え る場合. ,. 自由水 が少 な く,変 化 し得 る水分量が非常 に少 ない と考 え られ る。 したが つ て ,誤 差範 囲内 で極 めて小 さい水分合有量 の差 を示す ヒス テ リシス現象 が存 在 す る可能性 は第 2章 の結果 と関連 して否定 す る ことはで きな い。 た とえば ,一 般 の ヒス テ リシス現象 の原 因を説明す るのに用 い られ て い る い Raoら の イ ンクびん説 を胞子 に あて はめ ると次 のよ うに な り,胞 子 に も微 少 で あ って も ヒス テ リシス現象 が存在 し,生 理的 には相 当 の意 味を持 つ 可能 性 は十分 に あると考 え られ る。 Raoら. 5)の. イ ンクびん説 を胞子 にあて はめ る. (A)Ink bOttle theory 5) Th e portiOn related tO. the determination of. RH equilibrium with. envlronment AdsOrption. DesorptiOn. (B)ApplicatiOn of the ink bOttle theOry to bacterial spore. cortex,protoplast. AdsOrption. Desorption 5). Fig. 3 1nk bottle theory and its application to bacterial spore。.
(7) 浅. 田. 祥. 517. 司. と以下 のよ うに考 え られ る。 細菌 胞子 は一 般 にその rigidな 構造 , 自由水 が少 な く, ほ とん ど結合水 と して存在 す るとされ てい るので , 胞子 内部 の COrtexゃ core部 分 はほ と ん ど ヒス テ リシス現象 には関与 しな い と思 われ る。 したが つて ,COrtex層 の 外 の部分 , 主 に Spore coat部 分 のみが ヒス テ リシス現象 に 関与す ると考 え るのが妥 当で あろ う。 そ して ,無 数 の微小 の イ ンクびんが並 んで い ると して. 3. Fig。. ,. のlAlに 示 した イ ンクびん説 を適用すれば説明可能 にな る。 この可能. 性 を裏付 け るもの と して は,Spore coatが 厚 さ約. 30Aの. ラメ ラ構造 が約 15. 層重 な ってお り,化 学的 にはグ リシ ン,グ ル タ ミン酸 ,ア スパ ラギ ン酸 ,シ スチ ンな どを比 較 的多 く含 む蛋 白質 か らな って い る事実. ,X線. 回折 ,電 子. パ 線回折 でケ ラチ ン様 (皮 革 に含 まれ る蛋 白質 の一 種 )の 回折 タ ー ンを示 す 1°. 事実. ,Ross,Billingら. Dが. 屈折率測定 よ り胞子 は極 めて少量 の水 分 しか含. 有 してお らず ,羊 毛や皮革 の脱水蛋 白質 に近 い と してい る報告 , しか も皮革 か ら得 られ る蛋 白質 で あるゼ ラチ ンの等温吸着 曲線 が ヒス テ リシス現象 を示 す とぃ ぅ Rocklandら. の報告 を挙 げ る ことがで きる。. ただ し,以 上 の考 えで は等温吸着 曲線 の す べ ての部分 を説 明 で きず ,. RH. の高 い部分 ,即 ち毛細管凝縮 によ るとされ る領域 のみ しか説明で きな い。い ずれ にせ よ ,細 菌胞子 の等温吸着 曲線 において は極 く少 しで あ って も ヒス テ リシス現象 が存在 し,生 理的 には相 当な意味を もつ 可能性 は第 2章 の結果 と も関連 して否定す る ことはで きな い。 今後 は. ,. i)石 英 バ ネで重量変化 を追跡 し,測 定精度 を上 げ る ii)試. 料 の量を多 く して 行 な う. iii)単 純 な モ デ ル系 と して ,胞 子 の. COat部 分 に含 まれ る一 つ の蛋 白質 (ゼ. ラチ ンな ど)で 測定 す る。 iV)胞 子 の耐熱機構 と関連 して. D20や 3H20で 胞子 内 の水分分 布 を 調 べ. る. v)NMR,ESRで. 胞子 内 のプ ロ トン変化 を直接測定す る.
(8) 518. js υ πs sabι づ ι α4 χjgθ γの胞子に対する吸・脱湿プロセスの影響 ι ι Bα θづ. な どの方法で さ らに検討 しな ければ な らな い と思 われ る。. 4。. 要. 約. ′ ルs sabι グ Bα θ. ′ グ s υ αγ .″多 /の 胞子を供試菌 と し, デ シケ ー ターを用 い る グ. 重量平衡法 で 吸温 および脱湿 プ ロセスか ら等温吸着 曲線 を 求 めたが ,本 実験 の範 囲内 で は ヒス テ リシス現象 を見 出す ことはで きなか った。 同種 の菌 の胞子 を用 いて得 た Gilbertら の結果 と比 較 しなが ら細菌胞子 に お け る ヒス テ リシス現象 につ いて考察 した。. 第. 2章. 細 菌 胞 子 の 加 熱 ,薬 剤 ,紫 外 線 抵 抗 性 に 対 す る 吸. 0脱 湿. プ ロセ ス の 影 響. 1。. 緒. 言. 細菌胞子 に対す る加熱 ,薬 剤 ,紫 外線処理 の影響 に 関 して は非常 に 多 くの 報告 が あ り,特 に α7と 生残率 の 関係 につ いて は. Webb,Scott,Snygg ,. COrry らによ る報告 , 総説 を挙 げ ることがで きる。 しか し,未 だ検討を要 す る点 も多 くあ ると考 え られ る。その一 つ が吸 0脱 湿 プ ロセ ス試料を加熱. ,. 薬剤 ,紫 外線処理 した場合 ,そ の生残率 はどのよ うな変化 で あるか とい う問 題で ある。特 に ,こ れ らの処理 は α7に よ って 大 き く生残率 が異 な る故 ,第. 1章 で考察 した極 くわずか の ヒス テ リシス現象 が も し存在 す るな らば ,相 当 違 って くるので はないか と予想 され る。 これが本 章 の第 一 の 目的 で あ る。 また ,多 数 の報告 があるとは言 え , α7と 生残率 の 関係 が必 ず しも一 致 し てお らず ,こ の原 因 は実験 方法 の相違 ,培 養条件 ,そ の他 の相違 によ ると思 われ る。そ こで ,本 章 の研究 に採用 した ミ リポア フ ィル ター法 での結果 を. ,. 現在 の所最適 とされ るエ ア ロゾ ル法や他 の方法 で得 られた結果 と比 較検討す る ことを 第 二 の 目的 と した。.
(9) 浅 2。. 1)供. 田 祥. 司. 5ゴ. 9. 実験材料及び方法 試. 菌. ′ Jπ s sabノ グ ノ お υα4 4zノ ィ の 胞 子 第 1章 で 用 いた の と 同 じ Bα σグ. 2)加 熱処理方法 予 め 100℃ ,120℃ に お け る各 α7に 相 当す る水 分 量 を計 算 で 求 め ,こ の 水 分 量 に相 当す る胞 子 懸 濁 液 を マ イ ク ロ シ リ ンダ ー で 活栓 付 き試験 管 に 注 入 し た 。 次 いで 液体 窒 素 で 凍 結 した 後 , 数. mmHgま で 減圧 に し,70℃ , 1時 間. 加 熱 して 水 分 を気 化 させ ,こ れ を 脱 湿 プ ロセ ス 試 料 と した 。 胞 子 懸 濁 液 100 μlか ら凍結 乾 燥 した胞 子 の 入 った 小 試験 管 を 活 栓 付 き 試 験 管 内 に 入 れ ,各 α7に 相 当す る水 分 量 を マ イ ク ロ シ リ ンダ ーで それ に 加 え た 。次 に 脱 湿 プ ロセ ス 試 料 と同様 に 液体 察 素 で 凍 結 後 ,減 圧 に し,70℃ で. 1. 時 間 加 熱 して 水 分 を気 化 させ ,こ れ を 吸 湿 プ ロセ ス 試 料 と した 。. 70℃ で 1時 間 加 熱 処 理 を行 な った理 由 は ,試 験 管 内を過 飽 和状 態 に して. ,. 脱 湿 プ ロセ ス試 料 が 懸 濁 液 の ま ま加 熱 され るの を 防 ぐた めで あ る。以 上 の よ うに調 製 した両 プ ロセ ス 試 料 を各 々 分 加 熱 した 。対 照 と して は. 70°. 100°. C,120°. Cで lo分 ,20分 ,30分 ,60. Cで 1時 間 加 熱 処 理 した試 料 の 生 菌 数 を採 用. した 。. 3)薬 剤処理及び紫外線処理のための両プ ロセス試料の調製 Fig.4に 示 した フ ロー シー トに した が って 吸 ・ 脱 湿 プ ロセ ス 試 料 を調 製 し た が ,凍 結 乾燥 は固 体. mmHgで 2∼ 3 使 用 した ミ リポ ア フ ィ ル タ ー は 1-PKG HAWP. C02+エ. 時 間 真 空 乾 燥 した 。 ま た ,. タ ノー ル 中 で 20分 凍 結 ,数. 04700を 用 い ,調 湿 は室 温下 で 行 な った 。. 4)薬 剤処理方法 薬 斉」と して は , 通 常 ガ ス 殺 菌 に 使 用 され るプ ロ ピ レンオ キ サ イ ド (比 重. (20/20)0。 829∼ 0.831, IBP 33。. 0°. C以 上 ,DP 37° C以 下 ,水 分 1%以. 下 )を 用 いた 。 まず , 各 試 料 を デ シケ ー タ ー 内 で 約 数 後 ,lm1/Jの. 0。. mmHgに. まで 減 圧. プ ロ ピ レンオキサ イ ドを 気化 させ ,デ シケ ー タ ー 内 に導入 した 。. そ の後 , 各 所 定 の. RHを. もつ 空 気 を導 入 して 常 圧 に 戻 し, 37℃ で. 2時 間処.
(10) jJお Bα θ づ JJπ s sabι. 52a. υ α4れ″rの 胞子 に対 す る吸・ 脱湿 プ ロセスの影響. Spore suspension ￨. Filtration by millipore filter. PreconditiOning in various RH‐ contrOned desiccatOrs for about 3 days or inOre. Desorption sample Adsorption sample Fig.4 Procedure for sample preparation.. 理後 ,N― N′ ジメチ ル ホ ルム ア ミ ドで フ ィル ター ご と溶解 し,十 分混合 を行 な った。 さ らに希釈 した後 ,生 残率 を測定 した。. 5)紫 外線処理方法 各. RHに 調湿 した試料を小 シ ャー レー. (直 径. 7cm)に 移 し,石 英 ガ ラス. lmm)を のせ ,約 30分 間所定 の RHに 調整 したデ シケ ー ター 内 で 予備調 湿後 , 所定 の α7を 保 った まま紫外線照射 した。 紫外線照射 は 15W. 板 (厚 さ. の紫外線 ラ ンプ (但 し, 電圧安定装 置を接続 し, ラ ンプ は100時 間 以上使用 済 みのを用 いた )で 10 Cmの 照射距離 で 2分 間行 な った。その後 ,4)と 同 様 に N― N′ ジメチ ル ホ ルムア ミ ドで フ ィル ター ご と溶解 し,十 分混合後 ,希 釈 して生残率 を測定 した。. 6)生 残率の測定法 加熱処理後 の生 菌数測定 は ,. 0。. た後 ,Nutrient agar(肉 エ キス0。 チ ロシ ン0。. 01%,寒 天 1.5%,. pH. 05%の TWeen-20水 溶液 に懸濁 ,希 釈 し. 5%,ポ リペ プ トン1.0%,食 塩 5%,L― 7。 0)を 用 いた平板培養法 (37℃ ,48時 0。. 間 )で 行 な った。薬剤処理及 び紫外線処 理後 の生菌数測定 は,N― N′ ジメチ ル ホ ルムア ミ ド懸濁液 を希釈 した後 ,同 様 に Nutrient agarを 用 いて行 な った。.
(11) 浅. 田 祥. 司. 52」. 実験結果及 び 考察. 3。. Fig.5に 吸 ・ 脱湿両 プ ロセス試料を 加熱処理 した場合 の結 果 を示 した。 Fig。 6に は , Fig。 5か ら推定 され る同一 処理条件下 での全 域 の α 7と 生残 率 の 関係 を示 した。 Fig。 0。. 5,Fig。. 6か ら認 め られ るよ うに ,. 吸湿 プ ロセ ス試料 につ いて は α7. 2付 近 で加熱処理 に対す る最 も高 い抵抗性 を示 し,Murrdら. の得 た結 果. とよ く一 致 して い る。両 プ ロセス試料間 での生残率 の差 は ,α 70・ 75を 除 き. ,. ほ とん どの α7で 一 桁 以 内 で あ る。 しか し,各 α7で 加熱処理温度 や時間 が異 な る こと,同 じ α7で も一 定条件 で行 な ってい ることか ら両 プ ロセス試料間 の生残率 の差 を一桁以 内 とは結 論 で きな い と考 え られ る。実際 ,α 70o33で. 0. 0.2. 0.4 0.6 0。 8 Water activity(α ‖ ′). 1.o. 一 一 一 一. ｏ”と の一 ︵ｏＺ ＼Ｚ ¨ｏじ 口ｏ︼ 一 ＞ つ“︼. ヽさヽｋ. 一 一 一. ︵ｏＺ ＼Ｚ ¨ｏじ 口ｏ︼ 一ｏ”と の一 ０“一 ＞. -4. 0. 0.2. 0.4 0.6 0.8 Water activity(α ) "′. Fig. 5. Relationship between. α″ and. Fig. 6. Relationship between. α″. and. loss of viability by heat treat_. loss of viability by heat treat―. ment. ―一一―:adSOrption sample ・… ・: deSOrption sample …. ment. ―一 : adsorption, ・… ・: deSOrption …. ×一 × :120° C for lhr, △ 一 △ :100° C for 20min O一 〇 :100° C for lhr, □ 一 □ :100° C for 10min.
(12) 522 120°. ι Jπ s sγ Bα σ′. bι. jJJs. υ α4れrrの 胞子に対する吸 0脱 湿プロセスの影響. C, 1時 間加熱 か ら 120° C, 2時 間加熱 にす ると,両 プ ロセ ス試料間 の. 生残率 の差 は 0。 5桁 か ら 1桁 にまで大 き くな ってお り,同 じ傾 向 は紫外線処 理 の場合 で も認 め られ た。 さ らに吸温 プ ロセス試料 は凍結乾燥 を行 な って い るので ,こ の 際 の何 らかの影響 も考慮すれば ,生 残率 の差 は もう少 し大 き く な るか も しれない と思 われ る。 いずれ にせ よ ,ほ とん どの α7域 で吸温 プ ロセス試料 の方 が脱湿 プ ロセ ス 試料 よ りも生残率 が高 い事実 が認 め られ る。最終的に どの α7で 最 も生残率 の差 が大 き くな るのか ,そ して処 理条件 を変 えた場合 ,ど の程度 まで生 残率 の差 が大 き くな るのか は今後 さ らに検討す べ き問題 で あろ う。 次 に ,吸 湿 プ ロセス試料 の方 がほ とん どの α7域 で 加熱処理 に対 しよ り高 い抵抗性 を示 す理 由 につ いて は以下 のよ うに考 察 で きる。 凍結 乾燥 の影響 は ,吸 湿 プ ロセス試料 の方 が高 い生残率 を示 す故 ,こ の場 合 除外 で きる。 したが って ,第 1章 で述 べ たよ うな非常 に極 く僅 かの水分含 有量 の差 を示 す ヒス テ リシス現象 によるため と推定 され る。 Fig。. 5か. ら予. 想 で きるよ うに ,こ の可能性 は加熱処理 に対す る抵抗性 が水分含有量 に大 き く依存 してい る事実か ら十分考 え られ て よい と思 われ る。. Fig.7に はプ ロ ピレンオキサ イ ド処理 に対す る α7と 生残率 の 関係 を示 した。α70。 1か ら α70o5付 近 まで は吸湿 プ ロセ ス試料 の方 が 脱 湿 プ ロ セ ス試料 よ りも少 し生 残率 が高 くな ってお り,α 70o53を 越 え ると逆 の傾 向 に な って い る。但 し,両 プ ロセス試料 は共 に非 常 によ く似 た α7と 生残率 の 関 係 を示 して い る。 したが って ,α 70。. 53を 越 え ると傾 向 が逆 にな るのは ,第. 1章 で述 べ た よ うに ,高 い α7で 起 こ りやす い脱湿 プ ロセス試料 の平衡 の遅 れに よ るみか け の結果 で あ り,実 際 には. Fig。. 7の 脱湿 プ ロセス試料 の各 生. 残率 の値 は もう少 し α7の 高 い側 にずれて い るとみな した 方 がよい と思 われ る。そ のよ うにみなす と,ほ とん どの αv域 で 吸湿 プ ロセ ス試料 は脱湿 プ ロ セ ス試料 よ りも高 い生残率を示 す ことにな る。 この場合 ,ほ とん どの α7域 で平衡 の遅 れが生 じ,み か けの水分合有 量 の 差 を もた ら したためか ,あ るいは第 1章 で考 えた極 く僅 かの水分含有量 の差.
(13) 浅. 田 祥. 523. 司. 一 一. ︵ｏＺ ＼Ｚ ¨理 ︶ 口ｏ︻ 一ｏ” の ０“︼ ＞ 。 と ︻. 0. 0。 25. 0.50. 0.75. 1.0. Water activity(α ″ ). Fig. 7. Relationship between α″ and loss of viability by propylene. oxide(PO)eXposure(37° C for 2hr). ● : desorption, c): adsorption. を示 す ヒス テ リシス現象 の存在 が原 因 と して考 え られ る。 この点 に 関 して は 今後 ,脱 湿 プ ロセス試料 と して ,フ ィル タ ー炉過後 ,凍 結 乾燥 し,α 71。 0に 平衡到達後 ,脱 水 して得 られた ものを用 いて検討すれば よい と思 われ る。 次に. Fig。. 7を み ると,α 70o. l∼ α70。. 53付 近 まで はプ ロ ピレンオキサ イ. ド処理 で 報告 されて い る水分依存性 に ほぼ従 い ,α 7が 高 くな るに つ れ 生 残 率 が落 ち, 中間 α7か らさ らに高 い α7で は再 び生残 率 が高 くな って い るの が認 め られ る。 これ は一 つ に水分量増加 に伴 い ,プ ロピ レンオキサ イ ドの希 釈効果 が出たた めか ,あ るいはプ ロピ レンオキサ イ ド自身 の Carrierで ぁ る 水 と,標 的 で あ る胞 子 内 の核 へ の arinityが α7増 加に よ り変化 したためで はな いか と考 え られ る。 Fig。. 8に は紫外線処理 した場合 の α7と 生残率 を示 し,Table lに は照射. 条件 を変 えた 時 の生残率 の変化 を示 してい る。得 られた結果 よ りみて ,プ ロ ピレンオキサ イ ド処理 での結果 とほぼ 同様 に考 えてよい と思 われ る。両 プ ロ セス試料共 に,α 70。 6∼ α70o7付 近 か ら急激 に生 残率 が高 くな ってい るが. ,. グ α παπωσ θ ηSに つ いての Rileyら これ は Sθ γπ′. の報告 と一 致 してい る。.
(14) 524. JJzs s%bι Bα εづ. jι. js. υ α4″″γの胞子に対する吸・脱湿 プ ロセスの影響. 一 一 一 一. 一ｏ“と の︻ ＞ つ“︻ ︵ｏＺ ＼Ｚ ¨ｏじ 口ｏ︼ 。. O.25 0.50 0。 75 Water activity(α ). o. 1.0. l・. Fig。. 8. Relationship between. α″ and loss of viability. by UV irradiation(10cm fOr 2min). ● : desorption, o: adsorption. Table l Relationship between UV irradiation distance and loss of viability(α. UV irradiationa) desorption. distance(cm). Sample. ″0.75)。. adsOrption. sample. 30. -1。 03b). -0。 959b). 20. -2.40. -1。 18. 10. -2。 97. -1.51. a)irradiation tirne:2rnin. ら )10g N/N0 NO: initial viable spore number. N: viable spore number after UV irradiation. た だ し,α 70。. 85で 脱 湿 プ ロセ ス試 料 の 方 が少. し高 い生 残 率 を示 す の は ,プ. ロ ピ レンオ キサ イ ド処 理 で の 場合 と同様 ,高 い α7で 起 こ りや す い 平 衡 の遅 れ と思 わ れ る。 そ して α7に よ つて 程度 の 差 は あ るが ,ほ とん どの α7で 吸 湿 プ ロセ ス試 料 の 方 が生 残 率 は高 い傾 向 を示 して い る。 この 場合 もプ ロ ピ レンオ キサ イ ド処 理 の 結 果 の と こ ろ で 述 べ た と同様 に. ,.
(15) 浅. 田 祥. 司. ほ とん どの α″ で脱 湿 プ ロセス試料 に平衡 の遅 れが あ ったため , 所定 の α7 に到達 していない可能性 ,さ らには第 1章 で考 えた極 く小 さな ヒス テ リシス 現象 が存在 す る可能性 を原 因 と して挙 げ る こ とがで きる。 これ らの点 を明確 に す るためには ,脱 湿 プ ロセス試料 の調製法を変 えて検 討 しな ければ な らな い。. Table lで は ,照 射距 離 を 30cmか ら 10 Cmに して 処 理 条件 を 厳 し くす る と両 プ ロセ ス 試 料 間 で の生 残 率 の 差 が大 き くな る傾 向 を示 して お り,他 の 加 熱 や プ ロ ピ レンオ キサ イ ド処 理 の 場合 で も処 理 条件 を 厳 し くす る こ とに よ り,さ らに両 プ ロセ ス 試 料 間 で の 生 残率 の 差 が大 き くな る可能性 を示 唆 して い る。. 4.要. 約. 従 来 ,こ の 分 野 の 研 究 で全 く注 目され て いな か った 細 菌 胞 子 の 加熱 ,薬 剤. ,. 紫 外 線 処 理 に 対 す る吸 0脱 湿 プ ロセ ス の 影 響 を検 討 した 。 そ の 結 果 ,高 い α7 に お け る脱 湿 プ ロセ ス 試 料 の 平 衡 の遅 れ を考 慮 す れ ば ,加 熱 ,プ ロ ピ レンオ キサ イ ド,紫 外 線 処 理 の い ず れ の 場 合 で も吸 湿 プ ロセ ス 試 料 の 方 が 脱 湿 プ ロ セ ス 試 料 よ り も生 残 率 が 高 くな る傾 向 が認 め られ た 。. 第. 3章. 1.緒. 細 菌 胞 子 の 発 芽 ,増 殖 に 対 す る 吸 ・ 脱 湿 プ ロ セ ス の 影 響. 言. 細菌胞子 の 発芽 ,増 殖 に及 ぼす吸 ・ 脱湿 プ ロセス の 影響 は , 対象 とす る α7の 範 囲が0。 90∼ 1.0と 狭 い こ とや ,細 菌胞子 は凍結乾燥 して も生残率 に ほ とん ど変化 がな い こ とな どか ら吸 ・ 脱湿 プ ロセス の影響 は少 な い もの と予想 され る。 4). この点 に 関 して細菌胞子 での報告 は見 当た らないが,Plitmanら は S′ ″ ‐.
(16) 526. Bα σ jι. Jπ s. sπ. bι. j`'s. υ α4れ rrの 胞子に対する吸 0脱 湿プロセスの影響. θ θπS απ″aSの 場合 , 増殖可能 な最低 α7が 吸 0脱 湿 プ ロセス試料間 θ り Jθ θ で異 な る ことを認 めてい るので検討す る ことに した。 さ らに ,中 間水分食 品 は α70086∼ α70。 98の 範 囲 に属 してお り,そ の加 エ プ ロセ ス時 は無 論 ,流 通時 において も吸 ・ 脱 湿 プ ロセス の 占め る役割 は重 要 で あ って 検討を要す る 問題 と考 え られ る。. 実験材料及 び方法. 2。. 1)供. 試. 菌. Jル S づ 第 1章 ,第 2章 で用 いたの と同 じ Bα θ. 2)発. Sπ bι jJJs. α4″″ γの胞子 υ. 芽実験法. (i)脱 湿 プ ロセス試料 の発芽経 過 の測定 0.lMリ ン酸緩衝液 (pH 7。 0)に 食塩 ,ま た はグ リセ リンを加え , 各所 定 α7に 調節 した 5 mlを BiOSCanner(自 動増殖記録装 置 ,大 竹製作所製. OD660)の セル に入 れた後 ,37° Cで イ ンキ ュベ ー トした。別 に胞子懸濁液. lMリ. ,. 1. 0)を 加 え , 次 いで 食塩 また はグ リセ リ ンで各所定 α7に 調節 し,計 5mlに な るよ うに した。 これを 一 定時間 ,37 ℃で イ ンキ ュベ ー トした後 ,BiOScannerの セル に加え ,計 10 mlと し, さ. mlに. 0。. ン酸緩衝液 (pH 7。. らに イ ンキ ュベ ー トを続 けた。 数 時間後 ,各 所定 α7に 食塩 また はグ リセ リ ンで 調節済 みの O。 lMリ ン酸緩衝液 (pH 7。 0,12.6%L― ア ラニ ンを含 む) を 0。 l ml加 え,最 終的 に L一 ア ラニ ン濃度 を0.125%に して発芽 を開始 させ た。 発芽率 は ,得 られ た BiOSCannerの チ ャー ト紙 か ら次 に示 す蜂須賀 ら の 式 を用 いて求 めた。 G′. G′. =. ×100. :あ る培地で の ι時間培養後 にお け る発芽率. α:あ る培地 自身 の光学密度 ∠。:胞 子 を接種 した時 の培地 の光学密度 五′:′ 時間培養後 の胞子合有培 地 の光学密度.
(17) 浅. 田 祥. 司. (ii)吸 湿 プ ロセ ス試料 の発芽経過 の測定. (i)と 同様 に. 0。. lMリ. ン酸緩衝液. (pH 7。. 0)に 食塩 また はグ リセ リ ン を. 加 え ,各 所定 α7に 調節 した 5 mlを BiOscannerの セル に入 れた後 ,37℃ で イ ンキ ュベ ー トした。 別 に ,胞 子懸濁液 l mlか ら凍結乾燥 した胞子 に食 塩 また はグ リセ リンを加 え , さ らに. 0。. lMリ. ン酸緩衝 液 (pH 7。. 0)を 入 れ. て計 5mlと し,最 終 的に各所定 α7に な るよ うに した。 これを 37℃ で イ ン キ ュベ ー トし,一 定 時間後 ,BiOScannerの セ ル に 入 れ 計 10 mlと した。 数時間後 ,(i)と 同様 に 12.6%L一 ア ラ ニ ンー リ ン酸緩衝液. Bioscannerの セル に加 え , 最終 的に L― ア ラニ ン濃度 を. 0。. 0。. l mlを. 125%に して発. 芽 を開始 させ た。発芽率 は ,得 られた BiOSCannerの チ ャー ト紙 か ら(i)と 同様 の方法 で求 めた。. 3)増. 殖実験法. (i)脱 湿 プ ロセス試料 の増殖経過 の測定. 25%,ポ リペ プ ト 005%,pH 7.0)に 食塩 , また はグ. まず ,α 7100と 見 な しうる Nutrient broth(肉 エ キ ス0。 ン0.5%,食 塩 0。. 25%,L一. チ ロシ ン 0。. リセ リンを加 えて各所定 α7に 調節 した。 これか ら 5mlを と り,BiOScanner のセルに入 れ ,37℃ で ィ ンキ ュベ ー トした。別 に ,胞 子懸濁液 lmlを. 0。. lM. リン酸緩衝液 (pH 7。 0)に 加 え ,さ らに食塩 また はグ リセ リンで各 所定 α7 に調節 し,計 5 mlに な るよ うに した。 これを 一 定 時間 ,37℃ で イ ンキ ュベ ー トした後 ,BiOScannerの セル に加 え ,計 10 mlに して増 殖 を開始 させ た。 (ii)吸 湿 プ ロセ ス試料 の増殖経過 の測定. (i)と 同様 ,Nutrient brothに 食塩 またはグ リセ リンを加 えて各所定 α7 に調節 した。 これか ら 5 mlを と り,BiOScannerの セル に入 れ ,37℃ で イ ン キ ュベ ー トした。 別 に ,胞 子懸濁液 l mlか ら凍結 乾燥 した胞子 に食塩 ,ま た はグ リセ リンを加 え , さ らに. O.lMリ. ン酸緩衝液 (pH 7。. 0)を 入 れて計. 5mlと し,最 終 的 に各所定 α7に な るよ うに した。 これを 37℃ で ィ ンキ ュベ ー トし,一 定 時間後 ,BiOScannerの セ ル に加 え ,計 10mlに して増殖 を 開 始 させ た。.
(18) 528. sabι jJjs. βαθ Jzs jι. 90. υα4 πι gθ γ の 胞子 に対 す る吸. 30. 50. 70. lo. 10. 30. α‖. desorption. 0脱 湿 プ ロセスの影響 50. 70. 90. adsorption. 0.90. 0。. 92. 0。. 94. 0。. 96. 0。. 98. 1.00. loo. 80. 60. 40. 20. o. 0. 100. 20. Germination ratio(%) Fig 9. Relationship between α″and germination ratio(Glycerin method).. adsorption. desorption 0。. 90. 0。. 92 (min). 0.94. 0.96. 0。. 98. 1.00. 20. 0. Germination ratio(%). Fig 10 Relationship between. α″ and germination ratio(NaCl method)..
(19) 田 祥. 浅 3。. Fig。. 529. 司. 実験結果及び考察. 9に はグ リセ リンを各所定. みた結果 を示 し,Fig。. α7の 調節 に用 いて発芽率 の 時間経過 を. 10に はグ リセ リンの代 りに食塩 を用 いた 時 の結果 を. 示 した。 グ リセ リンを用 いて も,あ るいは食塩を用 いた 場合 で も発芽 しうる最低 の α7は ,吸 ・脱湿 プ ロセス試料共 に0。 92で あ った 。但 し,Fig。. 9及 び Fig。. 10. で発芽率 が10%以 内 の場合 , BiOScannerの ベ ース ライ ンの光学密度 に見 ら れ るバ ラツキか ら発芽 しなか った と見 な した。 L一 ア ラニ ン添加後 , 30分 , 60分 , 90分 , 120分 後 の発芽率 の経過 をみ る と,グ リセ リンで も食塩 で も α70.92,α 70。. 94で は吸 ・脱湿 プ ロセス試料. 間 での差 は認 め られなか った。一 方 ,0.96以 上 の α7に おいて はいずれ の場 合 も脱湿 プ ロセス試料 の方 が最 大20%程 度 高 い発芽率 を示 した。 しか し,吸 湿 プ ロセス試料 の場合 に凍結 乾燥 の影響 は α71。. 0で 見 出せ ると考 えれば. α70。 96以 上で は両 プ ロセス試料間 の発芽率 の差 はない もの とみ られ る。 Table 2 Relationship between α″ and growth(Glycerin). αw. treatment germination grOwth lag time(hr) Ａ Ｄ Ａ Ｄ. ＋. 92. 0.94. Ａ Ｄ. 十 ＋. 0。. ＋. 0.90. ＋ 十. 12.5 9。. 十 ＋. 十 ＋. 96. Ａ Ｄ. 0。. 3.5 3。. Ａ Ｄ. ＋ ＋. 十 十. Ａ Ｄ. ＋ ＋. 十 十. 0.98. 1。 1。. Ａ Ｄ. Adsorption Desorption. 5. 5. 5 5. ,.
(20) 53a. βaσ jJJπ s sπ b′ ″s υ α4れ 多rの 胞子に対する吸・脱湿プロセスの影響 Jづ. 以上 のよ うに , α7の 調節 に グ リセ リンまた は食塩を用 いて もほ とん ど同 じ傾 向を示 して い る。 しか し,同 じ α7で もグ リセ リンを用 いた方 が ,最 大. 10%の 範囲内 で高 い発芽率 が認 め られた。 この事実 は α7の 調節 に用 い る溶 質 の影響が あ る ことを示 して い ると考 え られ る。. Table 2に は α7調 節 に グ リセ リンを使用 して増殖経過 をみた時 の結果 を 示 し,. Table 3 に はグ リセ リンの代 りに食塩 を使用 した 時 の結果 を示 して. い る。 グ リセ リンを使用 した 場合 は両 プ ロセス試料共 に発芽可能 な最低 α7 が0。 92,増 殖 可能 な最低 α7が Oo 94で あ って変 わ らなか った 。増 殖 開始 まで の所要 時間 は α70。 94を 除 き, 両 プ ロセ ス試料共 にほぼ 同 じで あ った 。 α7. 0.94で は吸湿 プ ロセス試料 の方 が 3時 間程長 くかか って い るが , 理 由 は不 明 で あ り,さ らに検討 を要す ると思 われ る。 食塩を使用 した 場合 も同様 の結果 ,即 ち両 プ ロセ ス試料共 に発芽可能 な最 低 α7が 0.92,増 殖可能 な最低 α7が 0。 96で 変 わ らなか った 。増 殖 開始 に要 す る時間 も同 じで ,両 プ ロセス試料間に差 は認 め られず ,結 局 ,α 7調 節 に Table 3 Relationship between α″ and growth (NaCl) αly. treatment germination grOwth lag time(hr) Ａ Ｄ Ａ Ｄ. ＋. 0.92. Ａ Ｄ. 十. 94. 0.96. Ａ Ｄ. ＋ ＋. 十 ＋. Ａ Ｄ. ＋ ＋. ＋. 98. Ａ Ｄ. 十 ＋. ＋ 十. A:Adsorption D:Desorption. 7.5 7.5. 十. 0。. 十. 0。. 十. 0.90. 1.5 1.5.
(21) 浅. 田 祥. 司. 531. 用 いた 溶質 の影響 のみ認 め られただ けで あ った。 したが って ,緒 言 で述 べ た通 り,細 菌胞子 の場合 ,吸 ・ 脱湿 プ ロセス の影 響 は高 い α7で 起 こる発芽や増殖 には影響 しな い もの と考 え られ る。. 4。. 要. 約. 各 α7調 節 に用 いた 溶質 の効果 ,あ るいは試料調製 に用 いた凍結乾燥 の影 響 を考慮 すれば ,細 菌胞子 の 吸 ・ 脱 湿 プ ロセス が発芽 や増 殖 に及 ぼす影響 は 認 め られ なか った。 これ は,発 芽 や増 殖 には高 い α7が 要求 され るために. ,. 吸 ・ 脱湿 プ ロセス の影響 を うけなか った もの と考 え られ る。. 総. 括. 食品や微生物 にお け る水分 の状 態 を表わす のに等温吸着 曲線 が用 い られ て お り,多 くの場合 ,そ れ は ヒス テ リシス現象 を示 す とされて い る。 したが つ て ,微 生物 の生理 的挙動 と α7の 関係 を考 え る場合 ,吸 ・ 脱湿両 プ ロセ スの 存在 とその影響を考慮 に入 れてお く必要 が あると思 われ る。 しか し,従 来 の 研究 で は吸湿 プ ロセスを経 た試 料 のみが用 い られ てお り,吸 ・ 脱湿両 プ ロセ ス が微生 物 に及 ぼす影響 を検討 した例 は非常 に少 な い。そ こで ,本 研究 で は 供試菌 と して. JJ2s sπ b′ グ Bα θ グ Jな. υ .が 多 rの 胞子 を用 い , 次 の三点 につ い αγ. て 検討 を行 な った。. (I)細 菌胞子 の等温吸着 曲線 にお け る ヒス テ リシス現象 の有無 (II)細 菌胞子 の加熱,薬 斉J,紫 外線抵抗性 に及 ぼす吸 ・ 脱 湿 プ ロセス の影響 (III)細 菌胞子 の発芽 ,増 殖 に及 ぼす吸・ 脱湿 プ ロセス の影響. その結果 ,本 実験 の範 囲内 で は等温吸着 曲線 にお け る ヒス テ リシス現象 は 認 め られ なか った 。 しか し,加 熱 ,薬 剤 ,紫 外線処 理後 の吸 ・ 脱湿両 プ ロセ ス試料間 の生残率 には ,若 干 なが ら常 に差 が認 め られた。 したが って ,極 く.
(22) 532. Bα ε. jJJzι. s sγ. b′. jJjs. υ α4れ rrの 胞子 に対す る吸 。脱湿 プ ロセ スの影響. 小 さ な ヒス テ リ シス 現 象 が 存 在 す る可 能 性 が あ り ,さ らに 検 討 を 要 す る と思 わ れ る 。 一 方 ,細 菌 胞 子 の 発 芽 や 増 殖 に 対 して は ,吸 ・ 脱 湿 プ ロセ ス の み か け の 影 響 は認 め られ た が ,こ れ は凍 結 乾 燥 と α7調 節 に 用 い た 溶 質 の 影 響 に よ る も の と結 論 さ れ た 。 得 られ た 結 果 の よ り詳 細 な 解 析 の た め に は ,微 生 物 に お け る極 く小 さ な ヒス テ リ シス 現 象 の 存 在 の 有 無 と ,そ の 影 響 の 検 討 が 今 後 さ らに 必 要 と思 わ れ る。 謝. 辞. 本研究を終 え るに際 し,終 始御親切 な御指導を賜 わ りま した大阪大学 工 学部. 芝崎. 勲名誉教授 ,高 野光 男助教授 に深 く感謝 します。 引. 用. 文. 献. 1)Gilbert,G.L。 ,Gambill, Vo M., Spiner, Do R。 ,Hoffman, Ro K。 , Philips,C.R。. ,:. Applo Microbiol.,12,496(1964)。 2)Baternan,J.B。 ,Stevens,C.L。 ,Mercer,W.B。 ,Carstensen,E.L。 ,:J.Gen。. Microbid.,29,207(1962)。. 3)Koga,S,,Echigo,A.,Nunomura,K。 ,:Biophysical Journal,6,665(1966). 4)Plitman,M。 ,Park,Y。 ,Gomez,R。 ,Sinskey,A.J.,:J.Food Sci。 ,38,1004(1973) 5)Rao,Ko S。 ,:J.PhySo Chem。 ,459522(1941). 6)Ross,K.Fo A.,Billing,E。 ,:J.Geno Microbiol。 ,16,418(1957).. 7)Rockland,L.B。 ,:Food Technol.,23,11(1969)。. 8)Webb,S.J。 ,:BOund Water in Biological lntegrity,lst. Ed。 ,Charles C Thomas。 Publisher,Illinois(1965)。. 9)SCOtt,W.J。 ,:Advances in Food Research(Ed.by Mrak,E.M。 Academic Press,N.Y。 (1957)。. )V01.VII,83,. lo)Harnulv,B.G。 ,Snygg,B.G。 ,:」 .Appl.Bact。 ,35,615(1972)。 11)COrry,」 。E.L。 ,:The water relations and heat resistance of microorganisms., Prog.Indo Microbiol.,12(Ed.Do J.D.Hockenhull)(1973)。. 12)Murrdl,W.G。 ,Scott,W.J":J.Geno Microbid。 ,43,411(1966)。. 13)俵 谷 ,芝 崎. :醗 工 ,50,349(1972).. 14)Riley,Ro L。 ,Kaufman,J.E.,:Appl.Microbiol。 ,23,1113(1972)。. 15)蜂 須賀 :芽 胞 p89,岩 波書店 (1962)。 16)内 田 :蛋 白,核 酸 ,酵 素 。 ,20,162(1975)..
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