タイ産発酵食品由来乳酸菌および Staphylococcus 属分離株の糖発酵性と機能性物質生産能について

(1)

序　文 発酵食品を始めとした微生物の利用において，製造工程における温度管理や対象とする発酵原料など，利用に応じて想定される条件に適した菌株の選択が必要であり，菌株の生育条件や環境ストレス耐性，糖発酵性は基礎的な情報として重要である．加えて近年，特色ある製品開発のために，旨味や香気成分，機能性物質の生産能といった付加的な価値を生み出す微生物が求められており，それら微生物を利用した製品開発に関する研究報告がされている（寺島ら，2012a，b）．スターター菌種の違いが最終製品の品質に影響するとの報告もあり（舩津ら，2013），多様な菌株の収集・保存とその性質に関する情報は，新たな菌株利用への一助となると考えられるが，これまでに網羅的に調査された報告はない．著者らはこれまでに，タイ国各地で収集した発酵食品から分離・収集した乳酸菌および Staphylococcus 属細菌について，その分類学的な多様性の評価と，菌株利用の基礎的な情報となる生育環境におけるストレス耐性に着目した分離株の特徴を調査し，本学会誌に報告した（Miyashita et al., 2012；宮下ら，2016）．本報告では，発酵に利用する際の基礎的な情報として糖の発酵性と，付加的な価値を付与する情報として旨味や香気成分の生成に関与するプロテアーゼ活性とアミラーゼ活性，および機能性物質として注目されている GABA の生産能を調査し，応用利用性を検討するとともに，基準株や日本産発酵食品に由来する分離株との比較から，タイ産発酵食品に由来する分離株の特徴を明らかにすることを目的とした． 材料と方法 1）供試菌株タイ産発酵食品に由来する分離株（以後，タイ分離株と略す）で，これまでに種の多様性を報告した乳酸菌（Miyashita et al., 2012）および Staphylococcus 属細菌の中から，分離源情報を基に選抜し，9 つの発酵食品から分離した 63 株について，生育環境における

タイ産発酵食品由来乳酸菌および Staphylococcus 属分離株の

糖発酵性と機能性物質生産能について

宮下美香

1）＊

_{，鎌倉由貴}

1）

_{，杉本昌子}

1）

_{，柴田千代}

1）

_{，Pattaraporn Yukphan}

2）

_，

Wanchern Potacharoen

2）

_{，中川恭好}

1）

_{，鈴木健一朗}

1）

_{，田中尚人}

3） 1）_{独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE）バイオテクノロジーセンター（NBRC）} 〒292-0818　千葉県木更津市かずさ鎌足 2-5-8

2）_{BIOTEC Culture Collection (BCC), National Center for Genetic Engineering and Biotechnology (BIOTEC)} 113 Thailand Science Park, Phahonyothin Rd., Klong 1, Klong Luang, Pathumthani 12120, Thailand

3）_{東京農業大学菌株保存室（NRIC）　〒156-8502　東京都世田谷区桜丘 1-1-1} タイ産発酵食品に由来する乳酸菌と Staphylococcus 属分離株について，その微生物資源としての応用利用性と特徴を明らかにするために，糖の発酵性および酵素活性と GABA 生産能を調べた．分離株の糖発酵性は，乳酸菌と Staphylococcus 属株で顕著な違いが見られ，Staphylococcus 属株に比べて乳酸菌は多様な糖が発酵可能だった．糖発酵性試験結果に基づくクラスター解析の結果，分離株はそれぞれ基本的に種の特徴を反映していたが，乳酸菌には同種内で多様性がある種も見られた．日本国内の発酵食品に由来する分離株も含めて解析したところ，同種内で幾つかのクラスターに分かれた種は分離地域も複数に渡っており，糖発酵性における多様化のしやすさと環境への適応力の高さが推測された．糖発酵性に多様性が見られた種は，日本産分離株では全て複数の地域で共通して分離された種だったが，タイ分離株には他の地域では分離されなかった種が含まれていた．一方で，基準株と同じクラスターにまとまった乳酸菌種は，タイ・富山・沖縄のそれぞれの地域でのみ分離された種が多数を占め，その種数はタイ分離株で最も多かった．以上から，タイ産分離株には日本産の株とは異なる発酵性を示す株が多く含まれていることが示された．またタイ分離株の乳酸菌には GABA 生産能を示す株が， Staphylococcus 属株にはプロテアーゼ活性を示す株が見つかっており，特徴ある微生物資源であることが明らかとなった．キーワード：糖類発酵性，乳酸菌，タイ産発酵食品＊_{Corresponding author} E-mail: [email protected] Accepted: September 14, 2016

(2)

ストレス耐性について報告した（宮下ら，2016）．これら 63 株のうち，好塩好アルカリ性乳酸菌の Tetragenococcus 属分離株を除く 62 株を供試菌株とした．タイ分離株 62 株は Enterococcus 属（3 種 4 株）， Lactobacillus 属（11 種 2 亜種 38 株），Pediococcus 属（2 種 6 株），Weissella 属（2 種 2 株）の合計 4 属 18 種の乳酸菌と，Staphylococcus 属 7 種 12 株を含む．分離株の種名は 16S rRNA 遺伝子解析の結果に基づいて決定し（Miyashita et al., 2012），16S rRNA 遺伝子配列では識別できない Lactobacillus plantarum group に含まれる分離株については pheS 遺伝子解析の結果に基づいて近縁種を再同定した（宮下ら，2016）．比較対照として，日本産発酵食品に由来する微生物を供試菌株として用いた．富山県の発酵食品 15 サンプルと，沖縄県の発酵食品 9 サンプルから，それぞれ分離した株（以降，富山産発酵食品に由来する分離株を富山分離株，沖縄産発酵食品に由来する分離株を沖縄分離株と略す）のうち，好塩好アルカリ性乳酸菌を除いた富山分離株 75 株と沖縄分離株 29 株を供試菌株とした．加えてタイ産発酵食品に由来する分離株に近縁な基準株 20 株を試験した．富山分離株 75 株は， Carnobacterium 属（1 種 1 株），Enterococcus 属（3 種 8 株），Lactobacillus 属（9 種 42 株），Leuconostoc 属（3 種 12 株），Pediococcus 属（2 種 3 株），Weissella 属（2 種 3 株）の 6 属 20 種の乳酸菌と，Staphylococcus 属 3 種 6 株を含む．沖縄分離株 29 株は，Enterococcus 属（3 種 3 株），Lactobacillus 属（4 種 7 株），Leuconostoc 属（3 種 3 株），Pediococcus 属（1 種 1 株），Weissella 属（4 種 8 株）の 5 属 15 種の乳酸菌と，Staphylococcus 属 4 種 7 株を含む．分離株の種名は 16S rRNA 遺伝子配列解析，加えて L. plantarum group に含まれた分離株は pheS 遺伝子解析の結果に基づいて決定した（宮下ら，2016）． 2）糖発酵性試験分離株の糖の発酵性を API 50 CH（シスメックス・ビオメリュー社製）を用いて調べた．方法は製品添付の説明書に従った．乳酸菌分離株は MRS 培地（メルクミリポア社製），Staphylococcus 属株は 802 培地［1％ Polypepton（和光純薬工業社製），0.2％ Yeast extract （BD 社製），0.1％ MgSO4・7H2O，pH 7.0］を用いて前培養した．それぞれ液体培地で前培養した菌体を集菌し，滅菌生理食塩水で 2 回洗浄した後，API 50 CHL 培地に懸濁した．菌懸濁液を API 50 CH プレートに接種後 30℃で培養し，24 時間，48 時間，72 時間後に色調の変化を目視により観察・記録した．48 時間後と 72 時間後ではどの株においても結果に差が見られなかったため，製品添付の説明書で推奨されている 48 時間後の結果を解析に用いた．糖発酵性試験の結果を色調変化によって判定した陰性（−），弱陽性（w），陽性（＋）を，箱ひげ図には 0，1，2 に，クラスター解析には 0，0.5，1.0 にそれぞれ置き換えた数値を用いた．クラスター解析はユークリッドの距離を算出し，アルゴリズムは UPGMA 法を用いた（BioNumerics Ver. 4.61，Applied Maths 社製）．

3）カゼイン分解能試験

乳酸菌分離株は MRS 培地，Staphylococcus 属株は 802 培地で前培養した菌液をスキムミルク培地［2％ Skim milk powder（和光純薬工業社製），0.5％ Yeast extract，1.5％ Agar，pH 7.0］に画線塗抹した後 30℃ で培養した．乳酸菌は嫌気条件下で，Staphylococcus 属は嫌気および好気条件下で培養した．嫌気培養にはアネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いた．培養 4 週間後までにコロニー周辺に透明帯が形成された株を陽性とした． 4）スターチ分解能試験乳酸菌分離株は MRS 培地，Staphylococcus 属株は 802 培地で前培養した菌液をスターチ培地［1％ Starch from corn（SIGMA 社製），1％ Polypepton，0.2％ Yeast extract，0.2％ K2HPO4，1.5％ Agar，pH 7.0］に画線塗抹した後 30℃で培養した．乳酸菌は嫌気条件下で， Staphylococcus 属は嫌気および好気条件下で培養した．嫌気培養にはアネロパック・ケンキを用いた．培養 4 週間後までにコロニー周辺に透明帯が形成された株，および培養 4 週間後にヨウ素溶液を滴下し，ヨウ素デンプン反応によりコロニー周辺の培地が青紫色に染まらなかった株を陽性とした． 5）GABA 生産能試験乳酸菌分離株は MRS 培地，Staphylococcus 属株は 802 培地にそれぞれ 5％グルタミン酸ナトリウム一水和物を加えた試験培地で 5 日間培養後，遠心分離により菌体を除いて 1000 倍希釈した培養上清を，イソチオシアン酸フェニル（PITC）で誘導体化した後に HPLC（model LC-20AB apparatus，島津製作所製）で測定した．カラムは Wakosil-PTC （4.0×200 mm），移動相は Amino Acids Mobile Phase A と PTC-Amino Acids Mobile Phase B （和光純薬工業社製）

(3)

を用いた．分析条件はカラム温度 40℃，流速 1.0 ml/ min，検出波長 254 nm，リニアグラジエント法（B 液 0-100％，20 min）で行った． 結果と考察 1）タイ産発酵食品由来分離株の糖発酵性（1）分離源の原材料による違いタイ分離株の糖発酵性を，分離源である発酵食品の素材別に比較すると，野菜，大豆，魚の発酵食品に由来するそれぞれの分離株において 50％以上の株が発酵可能だった糖の数は 49 種類中それぞれ 20，22，13 種類だった．グルコースなどの六炭糖やトレハロースなどのオリゴ糖を発酵可能な分離株は，どの発酵食品に由来する分離株にも共通して高い割合で含まれていた．糖発酵性に陽性を示す分離株の割合に差が見られた糖を見ると，野菜や大豆の発酵食品由来株では魚の発酵食品由来株に比べて amygdalin，L-arabinose， arbutin，gluconate，D-melibiose，D-ribose といった主に五炭糖やグリコシドの発酵性に陽性を示す株の割合が高かった．野菜の発酵食品由来株では前述の糖に加えて五炭糖であるD-xylose の発酵性に陽性を示す株が多く，大豆の発酵食品由来株ではD-mannitol， D-raffinose，D-sorbitol といった糖アルコールの発酵性に陽性を示す株が多く含まれた．野菜の発酵食品から分離した株は 10 種（20 株），大豆の発酵食品からは 7 種（15 株），魚の発酵食品からは 14 種（24 株）で構成され，魚の発酵食品から分離した種は Staphylococcus 属種が多数を占めていた（6 種 9 株）．タイ分離株の乳酸菌と Staphylococcus 属株についてそれぞれ作成した箱ひげ図を比較すると，発酵可能な糖の種類はタイ分離株の乳酸菌で顕著に多様だった（Fig. 1）．生育に糖が必須ではない Staphylococcus 属株は，糖が少なくタンパク質が豊富な魚の発酵食品に適応していると考えられ，魚の発酵食品由来株全体の発酵可能な糖の種類が少ないのは，構成種にこの属の割合が高いことが要因だと考えられる．一方で野菜や大豆の発酵食品から分離した株で発酵可能な糖の種類が多いのは，植物基質が含む多様で量的に少ない糖源を資化して発酵を進めるのに適応しているためと推測できる．（2）タイ産発酵食品由来乳酸菌の糖発酵性 ①基準株との比較から見たタイ分離株乳酸菌の種内多様性糖の発酵性試験結果を基に，タイ分離株の乳酸菌について，近縁種基準株の結果を加えてクラスター解析を行った結果，分離株は概ね種ごとに近縁種基準株を含むまとまったクラスターを形成し，分離株の糖の発酵パターンは種の特徴を反映していた．しかし分離株の中には同種でありながら複数のクラスターに分かれた種も見られた（Fig. 2）．タイ分離株の乳酸菌で，同種内の株が複数のクラスターに分かれたのは E. durans or E. faecium，L. acidipiscis，L. farciminis，L. futsaii，L. pentosus， L. plantarum subsp. plantarum，P. pentosaceus で，それぞれ 7 ～ 16 種類の糖において発酵性に多様性が見られた（Table 1）．これら種内でクラスターが分かれた種の分離株で，基準株から離れた 8 株の分離源は魚（3 株），大豆（4 株），野菜（1 株）の発酵食品だった．大豆の発酵食品由来の 2 株（NB833, NB858）ではD-raffinose やD-melibiose といった大豆に含まれる糖の発酵性を獲得し，基準株と比べて発酵可能な糖の種類が増えていたが，その他の株では糖源の少ない魚の発酵食品に由来する分離株を中心に基準株よりも発酵可能な糖の種類が少なかった．まとまったクラスターを形成した E. avium，E. gilvus or E. raffinosus， L. brevis，L. fermentum，L. modestisalitolerans，L. plantarum subsp. argentratensis，L. saerimneri，P. acidilactici，W. paramesenteroides，W. thailandensis においても，基準株と分離株の糖発酵性が完全に一致した L. saerimneri 以外の種では，それぞれ 1 ～ 11 種類の糖発酵性に違いが見られ，同種内の株で複数に分かれたクラスターを形成した種よりも少ないながら，種内で糖発酵性に多様性があることが分かった．糖の発酵パターンと分離源の素材には基本的に相関性が見られなかったが，L. fermentum においては大きく 1 つにまとまるものを詳細に比較すると野菜由来株と魚由来株でグループが別れ，発酵可能な糖の種類が野菜の発酵食品に由来する株で多い傾向が見られたことや，基準株からクラスターが離れた分離株における基準株との糖発酵性の違いとそれぞれの分離源の関係から，一部に確認された基準株とは異なる糖の発酵性を示した分離株には，それぞれの分離源である発酵食品環境の影響が現れていると推測される． ②日本産乳酸菌分離株との比較富山と沖縄の分離株を加えてクラスター解析を行った結果（Fig. 3），タイ分離株の解析において同種内で複数に分かれたクラスターを形成した種のうち，E. durans or E. faecium では，タイ分離株 1 株（NB858）は基準株や他の分離株のクラスターどちらからも独立し，富山分離株は 1 つにまとまった．L. acidipiscis と L. pentosus のタイと富山の分離株はそれぞれ同種

(4)

内でグループが分かれることが分かった．L. plantarum subsp. plantarum はタイと富山の分離株は種内でグループが分かれたが，沖縄分離株のみを見ると基準株とともにまとまったクラスターを形成した．P. pentosaceus はタイと沖縄の分離株 1 株ずつ（NB878， J45M06-1）が基準株から独立した 1 つのクラスターを形成した．タイ分離株の解析において同種でまとまったクラスターを形成した 8 種の中で，富山と沖縄の両分離株にも含まれる種は L. brevis のみで，タイ分離株も含めて 1 つにまとまった．それ以外の 7 種はタイ分離株のみに含まれた種だった．タイ分離株の解析では基準株とまとまった L. fermentum および W. paramesenteroides は，富山と沖縄の分離株が加わったことにより基準株と分離株の距離が大きくなり，両種に含まれるタイ分離株の全てはそれぞれ基準株から独立した．同種内でクラスターが複数に分かれる種とまとまる種は，タイ，富山，沖縄のどの分離株にも見られ，それぞれに該当する種の構成は異なった．クラスターが分かれた種で基準株から離れた株は，それぞれの発酵食品環境の影響を反映している可能性が考えられる．同種で 1 つのクラスターにまとまった種で，タイ分離株のみに含まれる種は 7 種と多く，同じように同種で 1 つのクラスターにまとまった種で富山や沖縄の分離株のみに含まれた種も存在しており，これらの種はそれぞれの発酵食品環境に適応した種である可能性が考えられる． ③分離種による糖発酵性の種内多様性の違い分離地が同じにもかかわらず同種内でグループが

Fig. 1 Comparison of fermentation abilities of lactic acid bacteria and strains isolated from Thai

fermented foods. ×, outlier. Box plots show carbohydrate fermentation ability, as detected by using the API 50

CH system. Observations were made after 48 h of incubation. Results that were negative, weakly positive, and positive were converted to values ranging from 0 to 2 and used for the box plot analysis.

GLY, glycerol; ERY, erythritol; D-ARA, D-arabinose; L-ARA, L-arabinose; RIB, D-ribose; D-XYL, D-xylose; L-XYL, L-xylose; ADO, D-adonitol; MDX, methyl-b-D-xylopyranoside; GAL, D-galactose; GLU, D-glucose; FRU, D-fructose; MNE, D-mannose; SBE, L-sorbose; RHA, L-rhamnose; DUL, dulcitol; INO, inositol; MAN, D-mannitol; SOR, D-sorbitol; MDM, methyl-a-D-mannopyranoside; MDG, methyl-a-D-glucopyranoside; NAG, N-acetyl glucosamine; AMY, amyg-dalin; ARB, arbutin; ESC, esculin ferric citrate; SAL, salicin; CEL, D-cellobiose; MAL, D-maltose; LAC, D-lactose; MEL, D-melibiose; SAC, D-sucrose; TRE, D-trehalose; INU, inulin; MLZ, D-melezitose; RAF, D-raffinose; AMD, starch; GLYG, glycogen; XLT, xylitol; GEN, gentiobiose; TUR, D-turanose; LYX, D-lyxose; TAG, D-tagatose; D-FUC, D-fucose; L-FUC, L-fucose; D-ARL, D-arabitol; L-ARL, L-arabitol; GNT, gluconate; 2KG, 2-ketogluconate; 5KG, 5-keto-gluconate

b) Genus strains

a) Lactic acid bacteria

0 1 2 GLY ERY D-AR A L-AR A RI B D-XYL L-XYL ADO MDX GA L GLU FRU _MNE SBE RHA DUL INO _MAN SOR M DM MDG NAG AM Y AR B

ESC SAL CEL _MAL LAC _MEL SAC TRE UIN MLZ RAF _AMD _GLYG _{XLT GE}N TUR LYX TAG

D-F U C L-F U C D-AR L L-AR L GN T 2K G 5K G Co nv er te d va lu es fr om c ol or c ha ng e 0 1 2 GLY ERY D-AR A L-AR A RI B D-XYL L-XYL ADO MDX GA L GLU FRU _MNE SBE RHA DUL INO _MAN SOR M DM MDG NAG AM Y AR B

ESC SAL CEL _MAL LAC _MEL SAC TRE UIN MLZ RAF _AMD _GLYG XLT GEN TUR LYX TAG

D-F U C L-F U C D-AR L L-AR L GN T 2K G 5K G Co nv er te d va lu es fr om c ol or c ha ng e

(5)

0 10 20 30 40 50 NB729 NB732 NB791 NB1012 NB756 NBRC 15885T NB799 NBRC 107147T NB887 NBRC 109621T NBRC 109620T NB872 NB1023 NBRC 107826T NB844 NB787 NB1052 NB895 NB1006 NB1041 NB1050 NB752 NB877 NB896 NBRC 108947T NB730 NBRC 107150T NB878 NB833 NBRC 107768T NB53 NB834 NBRC 100485T NB446 NB702 NB858 NB876 NB836 NBRC 106468T NB755 NBRC 102163T NB779 NB776 NB802 NB851 NBRC 109619T NB758 NB839 NB801 NB842 NB837 NB846 NB814 NB753 NBRC 15891T NB790 NB880 NB789 NB873 NB1007 NB879 NBRC 106467T NB1011 NBRC 100492T NB860 NBRC 100696T NBRC 100477T Lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum Lactobacillus brevis Lactobacillus brevis Weissella thailandensis Weissella thailandensis Weissella paramesenteroides Weissella paramesenteroides Lactobacillus saerimneri Lactobacillus saerimneri Lactobacillus futsaii Lactobacillus acidipiscis Lactobacillus farciminis Lactobacillus farciminis Lactobacillus farciminis Lactobacillus farciminis Lactobacillus futsaii Lactobacillus futsaii Lactobacillus futsaii Lactobacillus futsaii Lactobacillus futsaii Lactobacillus farciminis Lactobacillus farciminis Pediococcus pentosaceus Enterococcus durans or E. faecium Pediococcus pentosaceus Lactobacillus plajomi Lactobacillus sp. Enterococcus faecium Lactobacillus modestisalitolerans Lactobacillus modestisalitolerans Enterococcus durans or E. faecium Lactobacillus pentosus

Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis Lactobacillus farciminis Lactobacillus acidipiscis Lactobacillus acidipiscis Pediococcus acidilactici Pediococcus acidilactici Pediococcus acidilactici Pediococcus acidilactici Pediococcus acidilactici Pediococcus acidilactici

Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus pentosus Lactobacillus pentosus Lactobacillus pentosus Lactobacillus pentosus Lactobacillus pentosus Lactobacillus pentosus Enterococcus avium Enterococcus raffinosus

Enterococcus gilvus or E. raffinosus Enterococcus gilvus Enterococcus avium Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented fish Fermented beets Fermented vegetable Human feces Fermented fish Fermented fish No data Fermented soybean Fermented vegetable Pig feces Fermented soybean Fermented fish Fermented vegetable Fermented fish Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented fish Fermented fish Fermented fish Fermented mustard Fermented vegetable Sausage Fermented fish Fermented soybean Dried beer yeast Fermented fish Fermented soybean No data Fermented fish Fermented meat Fermented soybean Fermented soybean Fermented soybean Fermented cassava roots Fermented fish Fermented fish Fermented fish Fermented fish Fermented vegetable Fermented soybean Barley Fermented fish Fermented soybean Fermented vegetable Fermented soybean Fermented soybean Fermented soybean Fermented vegetable Fermented fish Pickled cabbage Fermented vegetable Fermented fish Fermented vegetable Fermented soybean Fermented vegetable Fermented fish Corn silage Fermented vegetable Blood culture Fermented soybean Human bile Human feces

Strain No. Scientific name Isolation source

Fig. 2 Cluster analysis of lactic acid bacteria isolated from Thai fermented foods and related type strains, based on the results of carbohydrate fermentation testing. Scale bar indicates distance percentages. Carbohydrate

fermentation tests were performed by using the API 50 CH system. Observations were performed after 48 h of incubation. Results that were negative, weakly positive, and positive were converted to values of 0, 0.5, and 1.0, respectively, and used for the cluster analysis.

(6)

Table 1 Carbohydrate fermentation of strains isolated from Tha

i fermented foods and related type strains

Species Strain No. Clus te r at de nd ro gr am of T ha i iso la te s Clus te r at de nd ro gr am of a ll iso la te s Isolation source Y L G Y R E A A R R A - DA - L B I R L L Y Y X - DX - L O D A X D M L U A L G G U R F E E N B S M A H R L O U N ID N R A O S M M D M G G D A N M Y B R M A A C S E L A S L E C L C A A L M L EC A SM E U R N IT Z L M F A R D M A G T Y L L GX N E G R X U Y T L G A T C U F - D C U F - L L RL R A - DA - L T G N K 2 G G K 5 Enterococcus avium NBRC 100477 T I I Human feces − − − + + − − + − + + + + + − − − + + + + + + + + + + + + − w + − + − − − w + − + + − − + + − − − NB1011 I I Fermented vegetable + − − + + − − + − + + + + + w − − + + + + + + + + + + + w + w + − + − − − − + − − + − − + + + − − Enterococcus faecium NBRC 100485 T I I n.d. − − − + + − − − − + + + + − − − − + − − − + − + + + + + + − + + − − − − − − + − − − − − − − w − − Enterococcus durans or E. faecium NB833 II II Fermented soybean − − − + + w − − − + + + + − − − − + − − − + + + + + + + + + + + − − − − − − − − − + − − − − − − − NB858 III III Fermented soybean − − − + + − − − − + + + + − − − − + + − − + w + + + + + + + + + − − + − − − + − − − − − − − w − − Enterococcus gilvus NBRC 100696 T I I Human bile + − − − + − − w − + + + + + + − − + + + − w + + + + + + + − w + − + − − − − + − − + − − + + + − − Enterococcus raffinosus NBRC 100492 T I I Blood culture + − − + + − − + − + + + + + + − w + + + + + + + + + + + + + + + − w − − − − + − − + − − + + + − − E nt er oc oc cu s gi lvu s or E. raffinosus NB860 I I Fermented soybean + − − + + − − + − + + + + + + − − + + − + + + + + + + + + + + + − + + − − − + − − + − − + + w − − L ac to ba ci ll us a ci di pi s cis NBRC 102163 T I I Fermented fish − − − − w − − − − w w w w − − − − − − − + − − − + − − + − − − + − − − − − − + − − − − − − − − − − NB779 I I Fermented fish − − − − + − − − − w + + + − − − − − − w w + − − + w + + w − − + − − − − − − + − − − − − − − − − − NB787 II II Fermented fish − − − − w − − − − − w w w − − − − + − w − w − + + + − − − − − + − − − − − − − − − − − − − − − − − Lactobacillus brevis NBRC 107147 T I I Human feces − − − + w + − − − w + w − − − − − − − − − w − − + − − + − − − − − − − − − − − − − − − − − − w − − NB799 I I Fermented vegetable − − − w + + − − + + − + − − − − − − − − − w − − − − − + − w − − − − − − − − − − − − − − − − w − w Lactobacillus farcimi nis NBRC 107150 T I I Sausage − − − − − − − − − + + + + − − − − − − − + + − w + − + w + − + + − − − − − − + − − + − − − − − − − NB1041 I I Fermented vegetable − − − − − − − − − + + + + − − − − − − − − + + + + + + + + − + + − − − − − − w − − + − − − − − − − NB1052 I I Fermented vegetable − − − − − − − − − + + + + − − − − − − − − + + + + + w − + − + + − − − − − − + + − + − − − − − − − NB1006 I I Fermented vegetable − − − − − − − − − + + + + − − − − − − − − + + + + + + + + − + + − − − − − − w − − + − − − − − − − NB730 I I Fermented vegetable − − − − − − − − − + + + + − − − − − − − − + + + + + + + + − + − − − − − − − w − − − − − − − − − − NB755 II II Fermented fish − − − − − − − − − + + + + − − − − − − − − + − − + − − + + − − + − − − − − − + − − + − − − − − − − NB895 I I Fermented fish − − − − − − − − − + + + + − − − − − − − + + + + + + + + + − + + − − − − − − w + − + − − − − − − − L ac to ba ci ll us f er m en tum NBRC 15885 T I I Fermented beets − − − − − − − − − + + + − − − − − − − − − − − − − − − + + − + − − − − − − − − − − − − − − − + − − NB791 I II Fermented vegetable − − − + + + − − − + + + − − − − − − − − − − − − − − − + + + + + − − + − − − − − − − − − − − w − − NB1012 I II Fermented vegetable − − − + + + − − − + + + + − − − − − − − − − − − − − − + + + + − − − + − − − − − − − − − − − w − − NB729 I II Fermented vegetable − − − + + + − − − + + + − − − − − − − − − − − − − − − + + + + + − − + − − − − − − − − − − − w − − NB732 I II Fermented vegetable − − − + + + − − − + + + − − − − − − − − − − − − − − − + + + + + − − + − − − − − − − − − − − w − − NB756 I III Fermented fish − − − + + + − − − − − + − − − − − − − − − − − − − − − + − − + − − − + − − − − − − − − − − − w − −

(7)

Table 1 Continued Species Strain No. Clus te r at de nd ro gr am of T ha i iso la te s Clus te r at de nd ro gr am of a ll iso la te s Isolation source Y L G Y R E A A R R A - DA - L B I R L L Y Y X - DX - L O D A X D M L U A L G G U R F E E N B S M A H R L O U N ID N R A O S M M D M G D M G A N Y B R M A A C S E L A S L E C L C A A L M L EC A SM E U R N IT Z LF A M R D M A G T Y L L GX N E G R U T X Y L G A T C C U U F - DF - L L RL R A - DA - L T G N K 2 G G K 5 Lactobacillus futsaii NBRC 108947 T I I Fermented mustard − − − − − − − − − + + + + − − − − − − − − + + + + + + w + − + − − − − − − − + − − + − − − − − − − NB1050 I I Fermented vegetable − − − − − − − − − + + + + − − − − − − − − + + + + + + + + − + + − − − − − − w − − + − − − − − − − NB752 I I Fermented fish − − − − − − − − − + + + + − − − − − − − − + + + + + + + + − + + − − − − − − + − − + − − − − − − − NB877 I I Fermented fish − − − − − − − − − + + + + − − − − − − − − + + + + + + + + − + + − − − − − − + − − + − − − − − − − NB896 I I Fermented fish − − − − − − − − − + + + w − − − − − − − − + + + + + + w + − + + − − − − − − + − − + − − − − − − − NB844 II II Fermented soybean − − − − − − − − − − + + + − − − − − − − − + − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − − Lactobacillus modesti salitolerans NB446 T I I Fermented fish − − − − − − − − − + + + + − − − − + + − − + − w + + + + + + + + − − + − − − + − − − − − − − + − − NB702 I I Fermented meat − − − − − − − − − + + + + − − − − + − − − + − w + + + + + + + + − − + − − − + − − − − − − − + − − Lactobacillus pentosus NBRC 106467 T I I Corn silage + − − + + + − − − + + + + − w − − + + − − + + + + + + + + + + + − − − − − − + w − − − − − − + − − NB789 I I Fermented vegetable + − − + + + − − − + + + + w + + − + + − + + + + + + + + + + + + − + + − − − + − − − − − − − + − − NB1007 I I Fermented vegetable + − − + + + − − − + + + + − + − − + + − + + + + + + + + + + + + − − + − − − + − − − − − − − + − − NB879 I I Fermented fish + − − + + + − − − + + + + − + − − + + − + + w + + + + + + + + + − + + − − − + − − − − − + − + − − NB880 I I Fermented fish + − w + w + − − − + + + + − + + − + − w + + + + + + + + + + + + − − + − − − + − − − − − − − w − − NB873 I I Fermented soybean + − − + + + − − − + + + + + + + − + + − w + w + + + + + + + + + + + + − − − + − − − − − + − + − − NB876 II II Fermented soybean + − − + + − − − − + + + + − − − − + + − − + + + + + + + + + + + − − + − − − + − − − − − − − + − − Lactobacillus plajomi NB53 T I I Fermented fish − − − − w − − − − + + + + − − − − + + − − + − − + + + + − − + + − − − − − − + − − − − − + − w − − Lactobacillus planta rum subsp. argentora tensis NBRC 106468 T I I

Fermented cassava roots

− − − − + − − − − + + + + − − − − + + − − + + + + + + + + + + + − − + − − − + − − − − − w − w − − NB836 I I Fermented soybean − − − − + − − − − + + + + − − − − + + − − + w + + + + + + + + + − − + − − − + − − − − − + − + − − Lactobacillus planta rum subsp. plantarum NBRC 15891 T I I Pickled cab -bage w w − + + − − − − + + + + − − − − + + + − + + + + + + + + + + + − + + − − − + + − − − − − − w − − NB790 II III Fermented vegetable w − w + + w − − − + + + + − w − − + + + w + + + + + + + + + + + w + + − − − + − − − − − − − + − − NB801 I II Fermented vegetable − − − + w − − − − + + + + − w − − + − + + + + + + + + + + + + + w + + − − − + + − − − − + − + − − NB814 I II Fermented vegetable − − w + + w − − − + + + + − − − − + + + w + + + + + + + + + + + w + + − − − + + − − − − w − + − − NB753 I II Fermented fish − − − − − − − − − + + + + − + − − + − + w + + + + + + + + + + + − + + − − − + + − − − − + − + − − NB837 I II Fermented soybean − − − + + − − − − + + + + − − − − + + + w + + + + + + + + + + + w + + − − − + + − − − − w − + − − NB842 I II Fermented soybean − − − + + − − − − + + + + − − − − + − w w + + + + + + + + + + + + + + − − − + − − − − − + − + − − NB846 I II Fermented soybean − − − + + − − − − + + + + − − − − + + + + + + + + + + + + + + + w + + w − − + + − − − − w − + − −

(8)

Table 1 Continued Species Strain No. Clus te r at de nd ro gr am of T ha i iso la te s Clus te r at de nd ro gr am of a ll iso la te s Isolation source Y L G Y R E A R A - D A B I RR A - L L Y X - D L O Y D X - LA X L D A G M U L G U R F E E N B S M A H R L O U N ID N R A O S M M D M G G D A M N Y B R M A A C S E L L E A SC L C A A L M L EC A SM E U R N IT Z L M F A R D M A G T Y L L GX N E G R X U Y L T G A T C U F - D C U F - L L RL R A - DA - L T N G G K 2 G K 5 Lactobacillus saerimne ri NBRC 107826 T I I Pig feces − − − − − − − − − − + + + − − − − − − − − − − − − − − − − − + + − − − − − − − + − − − − − − − − − NB1023 I I Fermented vegetable − − − − − − − − − − + + + − − − − − − − − − − − − − − − − − + + − − − − − − − + − − − − − − − − − Lactobacillus sp. NB834 I I Fermented soybean − − − − + − − − − + + + + − − − − + + − − + − + + + + + − − + + − − − − − − − − − − − − − − w − − Pediococcus acidilactici NBRC 109619 T I I Barley − − − + + + − − − + + + + − − − − − − − − + − − + w + − − − − + − − − − − − + − − + − − − − − − − NB802 I I Fermented vegetable − − − + + + − − − + + + + − − − − − − − − + − − + − + − − − − + − − − − − − + − − w − − − − − − − NB758 I I Fermented fish − − − + + − − − − + + + + − − − − − − − − + − − + + + − − − − − − − − − − − + − − − − − − − − − − NB776 I I Fermented fish − − − + + + − − − + + + + − − − − − − − − + − − + − + − − − − + − − − − − − + − − − − − − − − − − NB839 I I Fermented soybean − − − + + − − − − + + + + − − − − − − − − + w − + + + − − − − − − − − − − − + − − − − − − − − − − NB851 I I Fermented soybean − − − + + + − − − + + + + − w − − − − − − + − − + − + − − − − + − − − − − − + − − + − − − − − − − Pediococcus pentosa ceus NBRC 107768 T I I Dried beer yeast − − − + + w − − − + + + + − − − − − − − − + + + + + + + − + + + − − + − − − + − − + − − − − − − − NB878 II II Fermented fish − − − − + + − − − + + + + − − − − − − − − + + + + + + w − − − + − − − − − − + − − + − − − − − − − Weissella paramesen teroides NBRC 109620 T I I n.d. − − − + w − − − − w + + + − − − − − − − + + − − − − − + − w + + − − − − − − − w − − − − − − w − − NB872 I II Fermented soybean − − − + w + − − − + + + + − − − − − − − + + − − + w w + − + + + − − w − − − w + − − − − − − w − w Weissella thailandensis NBRC 109621 T I I Fermented fish − − − + + − − − − − + + + − − − − − − − + w − − − − − + − + + + − − + − − − − + − − − − − − w − − NB887 I I Fermented fish − − − + − + − − − − + + + − − − − − − − + + − − − − − + − + + + − − w − − − − + − − − − − − + − − Staphylococcus epider midis NBRC 100911 T I I Nose − − − − − − − − − + + + w − − − − − − − − − − − − − − + + − + − − − − − − − − w − − − − − − − − − NB902 I I Fermented fish − − − − − − − − − + + + w − − − − − − − − − − − − − − + + − + − − − − − − − − − − − − − − − − − − Staphylococcus piscifer mentans NBRC 109625 T I I Fermented shrimp − − − − − − − − − + + + − − − − − − − − − w − − + − − − + − + + − + − − − − − − − − − − − − − − − NB749 II II Fermented fish − − − − − − − − − − + + − − − − − − − − − − − − + w − − − − − + − − − − − − − − − + − − − − − − − NB767 I I Fermented fish − − − − − − − − − + + + − − − − − − − − − w − − + − − − + − + + − − − − − − − − − − − − − − − − − NB890 I I Fermented fish − − − − − − − − − − + + − − − − − − − − − + − − + − − − w − + + − − − − − − − − − − − − − − − − − St ap hy lo co cc us c on di menti o r piscifermen tans NB850 I I Fermented soybean − − − − − − − − − − + + − − − − − − − − − − − − + − − − − − − + − − − − − − − − − − − − − − − − − St ap hy lo co cc us c on di menti NB751 I I Fermented fish − − − − − − − − − − + + + − − − − − − − − w − − + − − − w − − + − − − − − − − − − − − − − − − − − NB772 II I Fermented fish − − − − − − − − − − + + − − − − − − − − − w − − + w − − − − − + − − − − − − − − − + − − − − − − −

(9)

分かれたり基準株から独立した株が見られたのはタイ分離株で 9 種，富山分離株で 6 種，沖縄分離株では 2 種だった．これらのうち他の地域でも分離された種はそれぞれ 6 種，6 種，2 種で，タイ分離株の 3 種（L. farciminis と L. fermentum，L. futsaii）以外の種はいずれかの地域で共通して分離された種であり，種内の糖発酵性に多様性がある種は分離地が複数に渡っていることから，これらの種は糖発酵性の多様化がしやすく，そのため適応できる生息環境が広くなったと推測できる．タイ分離株で種内での糖発酵性に多様性が認められた 9 種のうち富山と沖縄の分離株には含まれなかった 3 種は，L. fermentum は分離源の原材料と糖発酵パターンに相関性がある傾向が見られ，L. farciminis と L. futsaii は系統的にも近縁で分離株数も多かった．一方，分離地が同じで同種内でまとまったクラスターを形成した種はタイ分離株で 8 種，富山分離株で 7 種，沖縄分離株では 8 種で，これらのうち他の地域でも分離された種はそれぞれ 1 種，4 種，6 種と，種内で糖発酵性に多様性があった種に比べて複数の地域から分離された種は少なく，それぞれの地域でのみ分離された種が多数を占め，その種数はタイ分離株で最も多かった（Table 2）．同種内でまとまったクラスターを形成した種の，それぞれの地域でのみ分離された種の糖発酵性を，分離地別に比較すると，タイ分離株ではD-xylose や D-raffinose，糖アルコールの発酵能が高い点で富山と沖縄の分離株との違いが見られた．また糖の発酵性は種によって違いがあることから，タイ分離株には日本産分離株とは異なる発酵性を示す分離株が多数含まれることが示された．（3）タイ産発酵食品由来 Staphylococcus 属分離株の糖発酵性 ①基準株との比較から見たタイ分離株 Staphylo coccus 属株の同種内の多様性タイ分離株の Staphylococcus 属株について，近縁種基準株の結果を加えてクラスター解析を行った結果，分離株は基本的に種ごとに近縁種基準株を含むまとまったクラスターを形成したことから，Staphylococcus 属分離株の糖の発酵パターンも種の特徴を反映していると考えられる（Fig. 4）．タイ分離株の Staphylococcus 属株では系統的に近い S. condimenti と S. piscifer mentans の株が同一クラスター内に混在したが，これら2種に含まれる株で発酵性の異なった糖は8種類で，まとまったクラスターを形成した S. epidermidis と Table 1 Continued Species Strain No. Clus te r at de nd ro gr am of T ha i iso la te s Clus te r at de nd ro gr am of a ll iso la te s Isolation source Y L G Y R E A R A - D A B I RR A - L L Y X - D L O Y D X - LA X L D A G M U L G U R F E E N B S M A H R L O U N ID N R A O S M M D M G G D A M N Y B R M A A C S E L L E A SC L C A A L M L EC A SM E U R N IT Z L M F A R D M A G T Y L L GX N E G R X U Y L T G A T C U F - D C U F - L L RL R A - DA - L T N G G K 2 G K 5 St ap hy lo co cc us s apr o phyticus NBRC 102446 T I I Urine − − − − − − − − − w + + − − − − − − − − − − − − − − − + w − + w − − − − − − − − − − − − − − − − − NB731 I I Fermented vegetable − − − − − − − − − − + + − − − − − − − − − − − − − − − + w − + + − − − − − − − − − − − − − − − − − NB774 I I Fermented fish − − − − − − − − − w + + − − − − − w − − − − − − − − − w − − w w − − − − − − − − − − − − − − − − − NB784 I I Fermented fish − − − − − − − − − − + + − − − − − w − − − w − − − − − + w − + w − − − − − − − − − − − − − − − − − Staphylococcus simu lans NB891 I I Fermented fish − − − − w − − − − − + + + − − − − − − − − w − − − − − − + − + + − − − − − − − − − − − − − − − − − Staphylococycus xylosus NB734 I I Fermented vegetable − − − + − w − − − − + + w − w − − w − − − w − − − − − w − − + + − − − − − − − − − − − − − − − − − n.d., no data; +, positive; −, negative; w, weakly positive. Carbohydrate tests were performed by API 50 CH. GLY, glycerol; ERY, erythritol; D-ARA, D -arabinose; L-ARA, L -arabinose; RIB, D -ribose; D-XYL, D -xylose; L-XYL, L -xylose; ADO, D -adonitol; MDX, methyl- b-D -xylopyranoside; GAL, D -galactose; GLU, D -glucose; FRU, D -fructose; MNE, D -mannose; SBE, L -sorbose; RHA, L -rhamnose; DUL, dulcitol; INO, inositol; MAN, D -mannitol; SOR, D -sorbitol; MDM, methyl- a-D -mannopyranoside; MDG, methyl- a-D -glucopyranoside; NAG, N -acetyl glucosamine; AMY, amygdalin; ARB, arbutin; ESC, esculin ferric citrate; SAL, salicin; CEL, D -cellobiose; MAL, D -maltose; LAC, D -lactose; MEL, D -melibiose; SAC, D -sucrose; TRE, D -trehalose; INU, inulin; MLZ, D -melezitose; RAF, D -raffinose; AMD, starch; GLYG, glycogen; XLT, xylitol; GEN, gentiobiose; TUR, D -turanose; LYX, D -lyxose; TAG, D -tagatose; D-FUC, D -fucose; L-FUC, L -fucose; D-ARL, D -arabitol; L-ARL, L

-arabitol; GNT, gluconate; 2KG, 2-ketoglyconate; 5KG, 5-ketogly

(10)

0 10 20 30 40 50 J11Y5E-2 J12N5D-4 J13Y0E-1 J16Y0E-1 J19Y0E-1 J9N0E-1 J40EM06-2 NB833 J33M06-2 NBRC 101867T J24N5B-1 J26Y5C-1 J25N5B-2 J25N5C-1 NBRC 100485T J3N5B-2 J5N0D-3 J13Y10B-1B NB446 NB702 J45M06-1 NB878 NBRC 106469T NBRC 107159T NBRC 3181T NB730 NBRC 108947T NB1006 NB1041 NB1050 NB752 NB877 NB896 NBRC 107153T NB1052 NB895 NBRC 107150T J11N5C-4 J9N0D-1 J17N0D-3 J5N5B-3 J15N5B-2 J35M06-2 J36M06-3 J45M56-2 J36M06-1 J36M56-2 NBRC 107152T J13Y10B-1 J3N10B-3 J4N5A-1 J5N5B-1 J15N0B-3 J8N0C-2 J17Y5E-1 J33M56-1 NBRC 100480T NBRC 15889T J11N5B-1 J15N5C-1 J9N5B-1 J37M56-2 J12N5B-1 J13N0C-2 J3N0B-3 J8N5B-4 J45M06-3 NB53 NB834 J3N10C-2 J8N5C-2 J17N5B-3 J3N0C-3 J15N5C-3 J16Y0D-2 J13N0D-1 J9N5B-2 J5N0C-6 NBRC 102163T NB779 J37M06-1 J38M06-1 J4N5C-1 NB1023 NBRC 107826T NB844 J4N0B-1 NBRC 107158T NBRC 15885T J33M06-3 NB776 NB802 NB851 NBRC 109619T NBRC 103219T NB758 NB839 J16Y0B-1 J19N0C-1 J19N5B-1 NBRC 106106T NB755 J24N10B-2 NB787 NB729 NB732 NB791 NB1012 J8N0B-1 NB756 NBRC 109618T J8N0C-1 J3N5C-4 J5N0B-1 NBRC 107765T NBRC 107147T J37M06-4 NB799 J11N5C-2 J13N5C-1 J12N0D-3 J15N5B-1 J37M06-5 J37M56-4 NB887 NBRC 109621T J35M56-2 J45M56-1 NBRC 109620T J8N5B-3 J8N5C-3 J15N0B-2 J9N0D-3 NB872 NBRC 107768T NB801 NB842 NB837 NB846 NB814 NB753 J11Y5D-1 J16Y0C-1 J16Y5C-1 J45M06-2 NBRC 15891T J35M06-1 J37M06-2 J8N5B-1 NB836 NBRC 106468T J3N5B-1 J5N0D-1 J16Y5D-1 NB858 NB876 J17Y10B-1 J3N5A-2 J8N5B-2 NB790 NB880 NB789 NB873 NB1007 NB879 NBRC 106467T NB1011 NBRC 100492T NB860 NBRC 100696T NBRC 100477T

Enterococcus durans or E. faecium Enterococcus durans or E. faecium Enterococcus durans or E. faecium Enterococcus durans or E. faecium Enterococcus durans or E. faecium Enterococcus durans or E. faecium Enterococcus durans or E. faecium Enterococcus durans or E. faecium Enterococcus thailandicus Enterococcus thailandicus Lactobacillus acidipiscis Lactobacillus acidipiscis Lactobacillus acidipiscis Lactobacillus acidipiscis Enterococcus faecium Lactobacillus pentosus Lactobacillus pentosus Lactobacillus pentosus Lactobacillus modestisalitolerans Lactobacillus modestisalitolerans Pediococcus pentosaceus Pediococcus pentosaceus Weissella confusa Lactobacillus crustorum Enterococcus hirae Lactobacillus farciminis Lactobacillus futsaii Lactobacillus farciminis Lactobacillus farciminis Lactobacillus futsaii Lactobacillus futsaii Lactobacillus futsaii Lactobacillus futsaii Lactobacillus nantensis Lactobacillus farciminis Lactobacillus farciminis Lactobacillus farciminis Leuconostoc cirteum Leuconostoc cirteum Leuconostoc cirteum Lactobacillus alimentarius Weissella cibaria Weissella cibaria Weissella cibaria Weissella cibaria Leuconostoc citreum Lactobacillus alimentarius Lactobacillus paralimentarius Lactobacillus alimentarius Lactobacillus alimentarius Lactobacillus alimentarius Lactobacillus alimentarius Leuconostoc kimchii Carnobacterium divergens Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Lactobacillus paracasei Lactobacillus sakei Lactobacillus sakei Lactobacillus sakei Weissella hellenica Lactobacillus sakei Lactobacillus sakei Lactobacillus sakei Lactobacillus sakei Lactobacillus sakei Lactobacillus plajomi Lactobacillus sp. Lactobacillus acidipiscis Enterococcus pseudoavium Lactobacillus curvatus Lactobacillus curvatus Lactobacillus curvatus Lactobacillus curvatus Lactobacillus curvatus Lactobacillus curvatus Lactobacillus curvatus Lactobacillus acidipiscis Lactobacillus acidipiscis Weissella viridescens Weissella viridescens Lactobacillus sp. Lactobacillus saerimneri Lactobacillus saerimneri Lactobacillus futsaii Lactobacillus versmoldensis Lactobacillus namurensis Lactobacillus fermentum Lactobacillus animalis Pediococcus acidilactici Pediococcus acidilactici Pediococcus acidilactici Pediococcus acidilactici Lactobacillus pobzihii Pediococcus acidilactici Pediococcus acidilactici Pediococcus parvulus Pediococcus parvulus Pediococcus inopinatus Lactobacillus pantheris Lactobacillus farciminis Lactobacillus acidipiscis Lactobacillus acidipiscis Lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum Weissella soli Lactobacillus fermentum Lactobacillus rapi Weissella soli Lactobacillus brevis Lactobacillus brevis Lactobacillus collinoides Lactobacillus brevis Lactobacillus brevis Lactobacillus brevis Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc lactis Leuconostoc mesenteroides Weissella thailandensis Weissella thailandensis Weissella paramesenteroides Weissella paramesenteroides Weissella paramesenteroides Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc cirteum Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides Weissella paramesenteroides Pediococcus pentosaceus Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Enterococcus durans or E. faecium Lactobacillus pentosus Lactobacillus pentosus Lactobacillus pentosus Lactobacillus pentosus

Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus pentosus Lactobacillus pentosus Lactobacillus pentosus Lactobacillus pentosus Lactobacillus pentosus Lactobacillus pentosus Enterococcus avium Enterococcus raffinosus Enterococcus gilvus or E. raffinosus Enterococcus gilvus Enterococcus avium Toyama Toyama Toyama Toyama Toyama Toyama Okinawa Thai Okinawa Type Toyama Toyama Toyama Toyama Type Toyama Toyama Toyama Thai Thai Okinawa Thai Type Type Type Thai Type Thai Thai Thai Thai Thai Thai Type Thai Thai Type Toyama Toyama Toyama Toyama Toyama Okinawa Okinawa Okinawa Okinawa Okinawa Type Toyama Toyama Toyama Toyama Toyama Toyama Toyama Okinawa Type Type Toyama Toyama Toyama Okinawa Toyama Toyama Toyama Toyama Okinawa Thai Thai Toyama Toyama Toyama Toyama Toyama Toyama Toyama Toyama Toyama Type Thai Okinawa Okinawa Toyama Thai Type Thai Toyama Type Type Okinawa Thai Thai Thai Type Type Thai Thai Toyama Toyama Toyama Type Thai Toyama Thai Thai Thai Thai Thai Toyama Thai Type Toyama Toyama Toyama Type Type Okinawa Thai Toyama Toyama Toyama Toyama Okinawa Okinawa Thai Type Okinawa Okinawa Type Toyama Toyama Toyama Toyama Thai Type Thai Thai Thai Thai Thai Thai Toyama Toyama Toyama Okinawa Type Okinawa Okinawa Toyama Thai Type Toyama Toyama Toyama Thai Thai Toyama Toyama Toyama Thai Thai Thai Thai Thai Thai Type Thai Type Thai Type Type Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented soybean Fermented soybean Fermented fish Fermented sausage Fermented fish Fermented soybean Fermented fish Fermented fish No data Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented fish Fermented meat Fermented vegetable Fermented fish Sugar cane Wheat sourdough No data Fermented vegetable Fermented mustard Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented fish Fermented fish Fermented fish Wheat sourdough Fermented vegetable Fermented fish Sausage Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Sourdough Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented fish No data Milk products Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented fish Fermented soybean Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented fish Fermented fish Fermented vegetable Fermented meat Fermented vegetable Fermented vegetable Pig feces Fermented soybean Fermented vegetable Sourdough Fermented beets Fermented fish Fermented fish Fermented vegetable Fermented soybean Barley Fermented cummingcordia Fermented fish Fermented soybean Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Feces of jaguar Fermented fish Fermented fish Fermented fish Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented fish Pickles Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermenting apple juice Human feces Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented fish Fermented fish Fermented vegetable Fermented vegetable No data Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented soybean Dried beer yeast Fermented vegetable Fermented soybean Fermented soybean Fermented soybean Fermented vegetable Fermented fish Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Pickled cabbage Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented soybean Fermented cassava roots Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented soybean Fermented soybean Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented vegetable Fermented fish Fermented vegetable Fermented soybean Fermented vegetable Fermented fish Corn silage Fermented vegetable Blood culture Fermented soybean Human bile Human feces Strain No. Scientific name Isolation source

Locality of source or taxonomic

states

Fig. 3 Cluster analysis of lactic acid bacteria iso-lated from Thai and Japanese fermented foods and related type strains, based on the results of carbohydrate fermentation test-ing. Scale bar indicates distance percentages.

Carbohydrate fermentation tests were per-formed by using the API 50 CH system. Observations were performed after 48 h of incubation. Results that were negative, weak-ly positive, and positive were converted to values of 0, 0.5, and 1.0, respectively, and used for the cluster analysis.

(11)

0 10 20 30 40 NB767 NB890 NBRC 109625T NB751 NB891 NB749 NB772 NB850 NB731 NBRC 102446T NB774 NB784 NB902 NBRC 100911T NB734 Staphylococcus piscifermentans Staphylococcus piscifermentans Staphylococcus piscifermentans Staphylococcus condimenti Staphylococcus simulans Staphylococcus piscifermentans Staphylococcus condimenti

Staphylococcus condimenti or S. piscifermentans Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus epidermidis Staphylococcus xylosus Fermented fish Fermented fish Fermented shrimp Fermented fish Fermented fish Fermented fish Fermented fish Fermented soybean Fermented vegetable Urine Fermented fish Fermented fish Fermented fish Nose Fermented vegetable

Strain No.

Scientific name

Isolation source

Fig. 4 Cluster analysis of genus strains isolated from Thai fermented foods

and related type strains, based on the results of carbohydrate fermentation testing.

Scale bar indicates distance percentages. Carbohydrate fermentation tests were performed by using the API 50 CH system. Observations were performed after 48 h of incubation. Results that were negative, weakly positive, and positive were converted to values of 0, 0.5, and 1.0, respectively, and used for the cluster analysis.

Table 2 List of species of lactic acid bacteria which were divided or bundled at the cluster analysis

At the dendrogram of

Thai isolates (Figure 2) At the dendrogram of all isolates (Figure 3)

Locality of source Thai Thai Toyama Okinawa

Divided

E. durans or E. faecium E. durans or E. faecium E. durans or E. faecium E. durans or E. faecium L. acidipiscis L. acidipiscis L. acidipiscis P. pentosaceus

L. farciminis L. farciminis L. pentosus

L. futsaii L. fermentum L. plantarum subsp. 　

　plantarum

L. pentosus L. futsaii Leu. citreum

L. plantarum subsp. 　

　plantarum L. pentosus Leu. mesenteroides

P. pentosaceus L. plantarum subsp. 　　plantarum

　 P. pentosaceus

　 W. paramesenteroides

Bundled

E. avium E. avium E. faecalis E. faecalis

E. gilvus or raffinosus E. gilvus or raffinosus L. alimentarius E. thailandicus

L. brevis L. brevis L. brevis L. alimentarius

L. fermentum L. modestisalitolerans L. curvatus L. brevis L. modestisalitolerans L. plantarum subsp. 　

　argentratensis L. sakei L. plantarum subsp. 　　plantarum L. plantarum subsp. 　

　argentratensis L. saerimneri P. parvulus W. cibaria

L. saerimneri P. acidilactici W. cibaria W. paramesenteroides

P. acidilactici W. thailandensis W. virescens

W. paramesenteroides

(12)

S. saprophyticus はそれぞれ 1 または 7 種類であり，乳酸菌と比べて種内の発酵性の違いが小さかった． Staphylococcus 属は生育に糖が必須ではなく，乳酸菌に比べて発酵可能な糖の種類自体が少ないことや，大多数の分離株（12 株中 9 株）が魚の発酵食品に由来することが，糖発酵性の種内多様性が少ない要因として考えられる． ②日本産 Staphylococcus 属分離株との比較富山と沖縄の分離株を加えたクラスター解析では，一部に種内でクラスターが分かれた種もあり，S. xylosus ではタイ分離株 1 株（NB734）と沖縄分離株 1 株（J37EM109-1）がそれぞれ独立し，S. nepalensis で富山分離株 4 株が 3 グループに分かれた．またタイ分離株のみの解析結果と同様に，系統的に近い S. condimenti と S. piscifermentans の株が，富山分離株の S. nepalensis の 1 グループを含む形で同一クラスター内に混在した．しかしタイ分離株は基本的に，種ごとに近縁種基準株を含むまとまったクラスターを形成し，分離源の素材に加えて原産地との相関性も見られなかった（Fig. 5）． 2）タイ産発酵食品由来分離株の酵素活性および GABA 生産能タイ分離株の乳酸菌 50 株および Staphylococcus 属 12 株について，カゼイン分解能試験によるプロテアーゼ活性，スターチ分解能試験によるアミラーゼ活性，および GABA 生産能を調べた結果，アミラーゼ活性を示す株は見つからなかったが，プロテアーゼ活性はタイ分離株の Staphylococcus 属株が好気条件下で 7 株（58％）が示し，このうち 2 株は嫌気条件下でも分解能を示した．GABA 生産能はタイ分離株の乳酸菌 3 株（6％）が示した（Table 3）．GABA を生産する乳 0 10 20 30 40 NBRC 109622T NBRC 109624T J32EM56-1 J3N5D-3 J33M56-2 NBRC 100911T NB902 J38M06-2 J24N0D-5 J33M06-1 J38M56-1 NB731 NBRC 102446T J33M56-4 NB774 NB784 J37EM109-1 NB767 NB890 NBRC 109625T NB891 J24N0E-2 J25N5E-1 NB850 NB751 NBRC 109623T NB749 NB772 J24N0E-1 NB734 J26Y5D-2 Staphylococcus carnosus Staphylococcus kloosii Staphylococcus epidermidis Staphylococcus equorum Staphylococcus epidermidis Staphylococcus epidermidis Staphylococcus epidermidis Staphylococcus epidermidis Staphylococcus epidermidis Staphylococcus pasteuri Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus xylosus Staphylococcus piscifermentans Staphylococcus piscifermentans Staphylococcus piscifermentans Staphylococcus simulans Staphylococcus nepalensis Staphylococcus nepalensis

Staphylococcus condimenti or S. piscifermentans Staphylococcus condimenti

Staphylococcus carnosus subsp. utilis Staphylococcus piscifermentans Staphylococcus condimenti Staphylococcus nepalensis Staphylococcus xylosus Staphylococcus nepalensis Type Type Okinawa Toyama Okinawa Type Thai Okinawa Toyama Okinawa Okinawa Thai Type Okinawa Thai Thai Okinawa Thai Thai Type Thai Toyama Toyama Thai Thai Type Thai Thai Toyama Thai Toyama Dry sausage Squirrel skin Fermented fish Fermented vegetable Fermented fish Nose Fermented fish Fermented meat Fermented fish Fermented fish Fermented meat Fermented vegetable Urine Fermented fish Fermented fish Fermented fish Fermented vegetable Fermented fish Fermented fish Fermented shrimp Fermented fish Fermented fish Fermented fish Fermented soybean Fermented fish Fermented fish Fermented fish Fermented fish Fermented fish Fermented vegetable Fermented soybean

Strain No.

Scientific name

Isolation source

Locality of

source

or taxonomic

states

Fig. 5 Cluster analysis of genus strains isolated from Thai and Japanese fermented foods

with related type strains based on the results of carbohydrate fermentation test. Scale bar indicates

distance percentage. Carbohydrate fermentation tests were performed by using the API 50 CH system. Observations were performed after 48 h of incubation. Results that were negative, weakly positive, and positive were converted to values of 0, 0.5, and 1.0, respectively, and used for the cluster analysis.

(13)

酸菌は多くの報告があり分離頻度も高い（Dhakal et al., 2012, Franciosi et al., 2015, Siragusa et al., 2007, Zareian et al., 2012）．本研究で得られた 6％という割合は非常に少ないが，主要な GABA 生産菌種として挙げられる L. brevis の他， Lactobacillus 属や Lactococcus 属に比べて報告の少ない Enterococcus 属種の株が得られており，新たな選択肢の 1 つとして活用が期待できる．以上から，タイ分離株には特色ある製品開発に活用可能な，旨味や香気成分，機能性物質の生産能といった付加的な価値を生み出す菌株が存在することが明らかとなった． 3）まとめタイ分離株の乳酸菌は，糖の発酵性は基本的には種の特徴を反映しているものの，同種であっても株ごとに数種類の糖において違いが見られた．同種内で糖の発酵性に多様性がある種は，複数の地域から分離された種が多数を占めたことから，広範な環境への適応力の高さが推測される一方で，タイ分離株の乳酸菌には種内に多様性がありながら富山や沖縄の分離株には含まれなかった種があった．また同種内で類似した発酵性を示した種はそれぞれの地域でのみ分離された種が多数を占め，その種数はタイ分離株で最も多かった．同種内の株で発酵性に違いが見られた糖の多くは，種内で株によって多様性があるとの報告がされている糖で（Bringel et al., 2005, Tanasupawat et al., 1993, 2000, Zanoni et al., 1987），供試菌株数が多いほど糖発酵性におけるばらつきが大きくなる傾向があるが，一方で種の識別において指標とされる糖では，例えば糖発酵性が類似している P. acidilactici と P. pentosaceus の識別において指標の 1 つとされる maltose の発酵性は，本研究でも分離株はそれぞれ種の基準株に一致していた．また糖発酵パターンが種内で 2 グループに分かれた L. plantarum subsp. plantarum を同種別亜種と識別する melizitose の発酵性は，本研究の分離株でも両亜種ともに基準株と一致していた．L. plantarum group は解像度の高い pheS 遺伝子解析結果から同定していることもあり，他の糖発酵性の違いは同種内の多様性と考えられるが，種によっては限られた株数の報告が存在するに留まり，多様性の有無が明らかではない場合もあるため，本研究で定義する種は 16S rRNA 遺伝子配列と L. plantarum group は加えて pheS 遺伝子配列の解析に基づくものであることを考慮する必要がある．しかし分離種の構成がタイと日本の分離株で異なっており，種間の糖発酵性の違いは種内のそれよりも基本的に大きかったことから，タイ分離株の乳酸菌には日本産の株とは異なる発酵性を示す株が多数存在することが明らかとなり，菌株利用における選択の幅や応用の可能性が広がると考えられる．またタイ分離株の乳酸菌には GABA 生産能を示す株も見つかっており，発酵食品製造における機能性の付与が期待できる．タイ分離株の Staphylococcus 属株は乳酸菌に比べて嫌気条件下で発酵可能な糖の種類が顕著に少ない一方で，好気条件下でプロテアーゼ活性を示す株が多数含まれた．これらタイ分離株の Staphylococcus 属株は，糖が少なくタンパク質が豊富な環境に適応しており，魚や肉の発酵食品製造に適していると考えられる．応用利用に向けて菌株を選抜する際に，菌株の種名は大きな指標となるが，種名からの選択に加えて，糖

Table 3 List of strains isolated from Thai fermented foods that showed ability of Casein degradation or of GABA production

Strain

No. Species Isolation source

Casein degradation

GABA production anaerobic

condition conditionaerobic

NB731 Staphylococcus saprophyticus Fermented vegetable − ＋ −

NB734 Staphylococcus xylosus Fermented vegetable − ＋ −

NB751 Staphylococcus condimenti Fermented fish − ＋ −

NB784 Staphylococcus saprophyticus Fermented fish − ＋ −

NB890 Staphylococcus piscifermentans Fermented fish − ＋ −

NB891 Staphylococcus simulans Fermented fish ＋＋ −

NB902 Staphylococcus epidermidis Fermented fish ＋＋ −

NB799 Lactobacillus brevis Fermented vegetable − n.d. ＋

NB860 Enterococcus gilvus or E. raffinosus Fermented soybean − n.d. ＋

NB1011 Enterococcus avium Fermented vegetable − n.d. ＋

(14)

発酵性の違いや酵素活性の有無，機能性物質生産能に関する情報は，菌株利用に大いに活かされる情報だと考えられる．既報のタイ分離株における環境ストレス耐性の特徴（宮下ら，2016）に加えて，本研究で示した，タイ分離株における糖発酵性の特徴から，タイ分離株は日本産の株とは異なる特徴を有していることが明らかとなった．またプロテアーゼ活性や GABA 生産能を示す付加的な価値を生み出す菌株も見つかっており，これらの機能性とタイ分離株に特徴的な発酵性や生育特性を組み合わせることにより，微生物資源として様々な応用利用が期待される． 文　献

Bringel, F., Castioni, A., Olukoya, D.K., Felis, G.E., Torriani, S. & Dellaglio, F. 2005. Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis subsp. nov., isolated from vegetable matrices. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 1629-1634.

Dhakal, R., Bajpai, V.K. & Baek, K.-H. 2012. Production of GABA (g -aminobutyric acid) by microorganisms: a review. Braz. J. Microbiol. 43: 1230-1241.

Franciosi, E., Carafa, I., Nardin, T., Schiavon, S., Poznanski, E., Cavazza, A., Larcher, R. & Tuohy, K.M. 2015. Biodiversity and g-aminobutyric acid production by lactic acid bacteria isolated from traditional alpine raw cow’s milk cheeses. Biomed. Res. Int. 2015: Article ID 625740, 11 pages.

舩津保浩，川上　誠，徳山武宏，酒井　彩，谷口亮輔，岩崎智仁，石下真人，山本克博 2013．組成や形状の異なる塩を用いて製造した発酵ソーセージの品質特性，特にスターター菌の違いについて．New Food Industry　55：34-42．

Miyashita, M., Yukphan, P., Chaipitakchonlatarn, W., M a l i m a s , T . , S u g i m o t o , M . , Y o s h i n o , M . , Potacharoen, W., Tanasupawat, S., Nakagawa, Y., Kirtikara, K., Tanticharoen, M. & Suzuki, K. 2012. 16S rRNA gene sequence analysis of lactic acid bacteria isolated from fermented foods in Thailand. Microbiol. Cult. Coll. 28: 1-9.

宮下美香，杉本昌子，鎌倉由貴，Pattaraporn Yukphan，Wanchern Potacharoen，中川恭好，鈴木健一朗，田中尚人 2016．タイ産発酵食品由来乳酸菌および Staphylococcus 属分離株の環境ストレ ス耐性の特性．日本微生物資源学会誌　32：13-24， 2016．

Siragusa, S., De Angelis, M., Di Cagno, R., Rizzello, C.G., Coda, R. & Gobbetti, M. 2007. Synthesis of g-aminobutyric acid by lactic acid bacteria isolated from a variety of Italian cheeses. Appl. Environ. Microbiol. 73: 7283-7290.

Tanasupawat, S., Okada, S., Kozaki, M. & Komagata, K. 1993. Characterization of Pediococcus pentosaceus and Pediococcus acidilactici strains and replacement of the type strain of P. acidilactici with the proposed neotype DSM 20284. Request for an opinion. Int. J. Syst. Bacteriol. 43: 860-863.

Tanasupawat, S., Shida, O., Okada, S. & Komagata, K. 2000. Lactobacillus acidipiscis sp. nov. and Weissella thailandensis sp. nov., isolated from fermented fish in Thailand. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 1479-1485. 寺島晃也，多田耕太郎，加藤一郎，中川義久，平野　寛，鈴木敏郎 2012a．GABA 生産乳酸菌の非加熱発酵 ソーセージへの応用．日本微生物資源学会誌　28： 19-27．寺島晃也，多田耕太郎，加藤一郎，中川義久，平野　寛，鈴木敏郎 2012b．g -アミノ酪酸（GABA）生産乳酸菌 Pediococcus acidilactici TOYAMA の「かぶらずし」 への応用．日本微生物資源学会誌　28：29-33． Zanoni, P., Farrow, J.A.E., Phillips, B.A. & Collons,

M.D. 1987. Lactobacillus pentosus (Fred, Peterson, and Anderson) sp. nov., nom. rev. Int. J. Syst. Bacteriol. 37: 339-341.

Zareian, M., Ebrahimpour, A., Bakar, F.A., Mohamed, A.K.S., Forghani, B., Ab-Kadir, M.S.B. & Saari, N. 2012. A glutamic acid-producing lactic acid bacteria isolated from Malaysian fermented foods. Int. J. Mol. Sci. 13: 5482-5497.