【学位論文審査の要旨】
１ 研究の目的
細胞内で機能する蛋白質について，その立体構造と機能発現のメカニズムを詳細に理解 するためには，当該蛋白質の立体構造やコンフォメーション変化，フォールディング安定 性，ダイナミクス，他の因子との相互作用の「その場」観察が極めて有用である．In-cell NMR は生きた細胞中の蛋白質について，その立体構造情報を原子分解能で得ることができる現 存する唯一の手法である．In-cell NMRは最初大腸菌を用いて手法の開発が行われたが，現 在はヒト培養細胞を用いた解析が可能になっており，疾病メカニズムの解明や創薬科学へ の波及的効果も期待されている．
ヒト培養細胞を用いたin-cell NMR実験においては，ほとんどの場合において，NMR観 測可能な安定同位体標識を行った標的蛋白質を，外から細胞内に導入する．蛋白質の導入 方法としては，膜貫通ペプチドを用いる方法，膜破壊毒素を用いる方法，電気穿孔法を用 いる方法などが提案されている．しかし，これらの方法で導入できる蛋白質の濃度はせい ぜい数十µM 程度であり，通常の希薄溶液中の NMR 解析で用いるような３次元（3D）三 重共鳴NMR測定や3D NOESY測定などは不可能であった．したがって，in-cell NMR解 析が可能な蛋白質試料は，希薄溶液中の帰属データを容易に参照できるような，言い換え れば細胞内環境の影響が比較的少ない蛋白質に限られるということになり，手法の汎用性 を議論するうえで，極めて逆説的な状況が生まれていた．
鴨志田氏による本研究の目的は，in-cell NMRの様々な要素技術の検証・最適化，新規技 術開発を行うことで，生きたヒト培養細胞中の蛋白質について，三重共鳴NMRのような異
種核3D NMRスペクトルの高感度かつ迅速な測定を可能にし，それによって信頼性の高い
in-cell NMR解析を行う手法を確立することである．鴨志田氏は，安定同位体標識試料調製 法，ヒト培養細胞への蛋白質導入法，NMR測定法などについて，広く最適化を行い，複数 種類の蛋白質モデル試料について，あいまいさのない蛋白質主鎖NMRシグナルの帰属が可 能であることを示した．また，NMR試料管内の細胞寿命を延ばすための新しい装置の開発 を行い，in-cell NMR解析の対象となりうる蛋白質試料の範疇を大きく広げたことも注目に 値する．
２ 研究の方法と結果
鴨志田氏は，本研究のためのモデル蛋白質として，ヒト calbindin D9k P47M 変異体
（80a.a.，以下CbD9kと略），ヒトubiquitin L8A/I44A/V70A変異体（77a.a.，以下Ub3A と略），高度好熱菌T. thermophiles HB8由来のTTHA1718遺伝子産物（66a.a），連鎖球 菌protein G B1 domain（57a.a.，以下GB1と略）の４種を用いた．ヒト子宮頸がん由来 の培養細胞であり，浮遊培養に適応して，in-cell NMR測定後の生存率も比較的高いと報告 がある HeLa.S3 細胞をホスト細胞として用いた．安定同位体標識蛋白質のHeLa.S3 細胞 への導入方法としては電気穿孔法を選択している．
まず，電気穿孔法のパラメータ（出力とパルス幅）を最適化することによって，４種の モデル蛋白質すべてについて，HeLa.S3細胞中で良好なin-cell NMRスペクトルを観測す
ることに成功した．電気穿孔法においては，蛋白質の大きさ・形や電荷によって導入効率 が異なると考えられ，実際に得られた最適なパラメータは蛋白質ごとに異なっていたこと から，蛋白質ごとのパラメータ最適化の必要性が示された．
次に，４種の中で最も良好なスペクトルを与えたGB1について，HeLa.S3細胞中での三 重共鳴3D NMR測定を行った（実際には三重共鳴NMR 実験の中で最も一般的なHNCA 実験を行った）．細胞内環境においては，細胞質内の粘性のために，希薄溶液中に比して分 子の回転相関時間（τc）が増大すると推察される．τcの増大は1Hα核と直接結合している13Cα 核の横緩和時間（T2）を著しく短縮させ，結果的に三重共鳴 NMR スペクトルの感度が大 きく低下すると考えられた．この問題に対し，鴨志田氏は２つのアプローチで測定感度（S/N 比）の向上を試みた．まず，選択的1H励起パルスを用いることで，各スキャン間の待ち時 間を短縮させ，単位時間当たりの積算回数を増やすアプローチ（band-selective excitation short-transient，略して BEST と呼ばれる手法）を検討した．この手法を用いることで，
最大30%程度の感度向上が期待できる．２つ目は，蛋白質を均一に重水素化し，transverse relaxation optimized spectroscopy（TROSYと略）というNMR測定手法を用いるアプロー チを検討した．2H 核は 1H 核に比べて磁気回転比が著しく小さいため，13Cα核に対する双 極子緩和の効果が大きく軽減できる．以上の２つのアプローチを基に，HeLa.S3 細胞に導 入したGB1について，従来型のHNCA，BEST-HNCA，BEST-TROSY-HNCA（以上３種 の測定には13C/15N標識GB1を使用），TROSY-HNCA測定（2H/13C/15N標識GB1を使用）
の４種の3D HNCA測定を行った．NMR試料管内の細胞試料の寿命を考慮して，nonlinear samplingを用いた迅速な3D NMR測定を行い，個々の実験は７時間以内に終了するよう にした．結果として，４種の中ではTROSY-HNCA（2H/13C/15N標識GB1を使用）が最も 高感度であることが判明した．
さらに，HeLa.S3 細胞中の 2H/13C/15N 標識 GB1 について，TROSY-HN(CO)CA， TROSY-HNCO，TROSY-HN(CA)COの三種の3D NMRスペクトルを測定し，解析するこ とによって，蛋白質主鎖1HN，13Cα，13C’，15Nシグナルの完全な帰属に成功した．これは ヒト培養細胞を用いたin-cell NMR実験としては世界初である．
鴨志田氏はさらに，bioreactorシステムの改良も行った．このシステムは，測定中にNMR 試料管内に新鮮な培地を送り続けることで，細胞寿命を延長するものである．これまでに 報告されていた方法は，（細胞が流出しないように）熱可塑性のゲルを用いて細胞を固定す るものであったが，試料調製法が煩雑で感度が低いという問題点があった．鴨志田氏は，
細胞試料を（ゲルを用いずに）閉じ込めるためのセルを持つ新しいNMR試料管をデザイン し，実験を行った結果，高感度かつ長時間（24時間以上）のNMR測定が可能であること を実証した．この新bioreactorシステムを用いることで，HeLa.S3細胞中のGB1について，
良好な3D 15N-separated NOESY測定を行うことにも成功した．このことは，ヒト培養細 胞中の蛋白質についてのNOE情報をもとにした立体構造解析の可能性を示唆しており，非 常に興味深い．また，新 bioreactor システムを用いた結果，TTHA1718，Ub3A，CbD9k
の3種の試料についても，多数の主鎖NMRシグナルの帰属を行うことができた．
３ 審査の結果
これまでに，ヒト培養細胞を用いた in-cell NMR研究は様々な系に適用されてきたが，
球状蛋白質の主鎖NMRシグナルの帰属やNOE情報を用いた立体構造解析を志向した研究 例は本研究が初めてであり，非常に興味深いと考えられる．ヒト培養細胞を用いた in-cell NMR解析では，疾病に関与する蛋白質について薬剤添加による立体構造の変化を解析する など，高分解能であいまいさのない解析が，将来は要求されていくものと考えられる．そ の際に，本研究で確立したような，重水素化と TROSY 測定による蛋白質主鎖帰属のアプ ローチや，bioreactorシステムを用いた3D NOESYスペクトルの取得は，非常に重要な解 析手法になる可能性がある．その意味で本研究がin-cell NMR研究領域全体に与えるイン パクトは大きい．
また，審査委員からは，「bioreactorシステムを用いて細胞環境をコントロールし，重要 な生命現象をin-cell NMRを用いてリアルタイムで追いかける」というアプローチに対し て高い評価が与えられていた．本研究で開発された「簡便な」bioreactorシステムが普及す れば，多くの興味深い生命現象がin-cell NMRによってモニター可能になると考えられる ため，これからの研究の発展が大いに期待される．
なお，本研究の成果の主要な部分は，既に英国化学会Chemical Communications誌に採 択されている．
以上の理由により，本研究は博士（理学）の学位に十分値するものと判定した．
４ 最終試験の結果
本学の学位規則に従って最終試験を行った．公開の席上で論文内容の発表を行い，分子 物質化学専攻教員による質疑応答をもって論文および関連分野についての試験とし，合格 と判定した．
