Fukushima Medical University
福島県立医科大学 学術機関リポジトリ
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Title 遺伝子発現スコアリングシステムを用いた食道類基底細
胞癌の鑑別診断法の構築( 本文 )
Author(s) 多田, 武志
Citation
Issue Date 2016-03-24
URL http://ir.fmu.ac.jp/dspace/handle/123456789/545
Rights Published version is "Int J Oncol. 2017 Sep;51(3):877-886. doi:
10.3892/ijo.2017.4075. © Spandidos Publications".
DOI
Text Version ETD
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遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム を 用 い た 食 道 類 基 底 細 胞 癌 の 鑑 別 診 断 法 の 構 築
多 田 武 志
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福 島 県 立 医 科 大 学 大 学 院 医 学 研 究 科 医 学 専 攻 病 態 制 御 外 科 学
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概 要
【 目 的 】食 道 類 基 底 細 胞 癌（Basaloid squamous cell carcinoma of the esophagus、以 下「BSCE」と 呼 ぶ ）は 特 殊 型 食 道 癌 に 分 類 さ れ る 比 較 的 稀 な 疾 患 で あ る 。 そ の 組 織 型 の 多 様 性 の た め 、 鑑 別 診 断 に 難 渋 す る こ と が 多 く 、 特 に 術 前 内 視 鏡 的 生 検 で の 鑑 別 診 断 は 困 難 と い わ れ て い
30
る 。 本 研 究 で は 、 検 討 １ と し て 、 手 術 検 体 で の 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 に よ り 得 ら れ た 遺 伝 子 発 現 情 報 か ら 、BSCE に 特 徴 的 な 遺 伝 子 群 を 抽 出 し 、鑑 別 診 断 精 度 の 高 い BSCE 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム の 構 築 を 試 み た 。 さ ら に 検 討 2 と し て 、 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム を 用 い た 、 生 検 検 体 に お け る BSCE 診 断 精 度 の 検 証 を 行 っ た 。
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【 方 法 】 検 討 1：2008 年 1 月 か ら 2015 年 7 月 の 間 に 福 島 県 立 医 科 大 学 臓 器 再 生 外 科 学 講 座 で 手 術 を 施 行 し た 食 道 癌 患 者 30 名 か ら 得 ら れ た 、 57 検 体 （BSCE 7 検 体 を 含 む ）、 を 用 い て 詳 細 な 病 理 診 断 を 行 う と と も に 、DNAマ イ ク ロ ア レ イ を 用 い て 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル を 取 得 し た 。BSCE に 特 徴 的 な 遺 伝 子 群 の 抽 出 は 以 下 の と お り に 行 っ た 。
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各 遺 伝 子 の 発 現 デ ー タ は 、解 析 対 象 の 検 体 と 、22 種 類 の ヒ ト が ん 細 胞 株 か ら 得 ら れ た 共 通 リ フ ァ ラ ン ス RNA と の 発 現 比 か ら 算 出 し 、 そ の 遺 伝 子 発 現 比 の 値 を log2 に 変 換 し た（ 以 下「 変 換 値 」と 呼 ぶ ）。手 術 57 検 体 の 変 換 値 を 、 数 学 的 解 析 手 法 を 用 い て 、BSCE に 特 徴 的 な 発 現 を 示 す 遺 伝 子 群 を 抽 出 し 、BSCE の 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム を
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構 築 し た 。 検 討 2： 検 討 1 と 同 様 の 条 件 下 で 、 内 視 鏡 的 生 検 で 検 体 が 採 取 可 能 で あ っ た 患 者 80名 か ら 、312検 体 （BSCE 8検 体 を 含 む ）を 用 い て 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル を 取 得 し た 。検 討 1 で 抽 出 し た 75 遺 伝 子 の 発 現 ス コ ア を 算 出 し 、 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム を 用 い た BSCE の 診 断 を 行 っ た 。 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム の 診 断 精 度
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を 検 証 す る た め に 、ROC（Receiver Operating Characteristic curve） 曲 線 を 用 い て 、ROC曲 線 下 面 積 （AUC: area under the curve） と 至 適 カ ッ ト オ フ 値 を 求 め た 。
【 結 果 】検 討 1：手 術 57 検 体 の 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 か ら 、7,379 遺 伝 子 を 抽 出 し た 。 そ の 7,379 遺 伝 子 の 遺 伝 子 発 現 デ ー タ を 用 い て ク ラ
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ス タ 分 析 を す る こ と に よ り 、BSCE検 体 と 非 BSCE検 体 を 区 別 可 能 で あ っ た 。BSCE 検 体 と 非 BSCE 検 体 を よ り 精 度 良 く 区 別 す る た め に 、 75 遺 伝 子 へ 絞 り 込 ん だ 。 各 検 体 に お け る 75 遺 伝 子 の 変 換 値 を 合 計 し た 値 （ 以 下 「75 遺 伝 子 発 現 ス コ ア 」 と 呼 ぶ ） を 算 出 す る と 、75 遺 伝 子 発 現 ス コ ア ＝56.5以 上 で 、BSCE 7 検 体 全 て が 非 BSCE検 体 と 区 別
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可 能 で あ っ た 。こ れ を BSCE遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム と し た 。 検 討 2： 構 築 し た 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム に お い て 、75 遺 伝 子 発 現 ス コ ア ＝40.5 を 至 適 カ ッ ト オ フ 値 と す る と 、AUC＝0.981、 生 検 検 体 に お け る BSCEを 感 度 87.5％ 、特 異 度 99.0％ で 鑑 別 が 可 能 で あ っ た 。
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【 結 論 】 手 術 検 体 を 用 い て 当 施 設 独 自 の 手 法 を 用 い た 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 を 行 い 、75 個 の 遺 伝 子 群 を 抽 出 し 、遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム を 構 築 し た 。 本 法 を 用 い る こ と で 、 生 検 検 体 に お い て 高 い 鑑 別 診 断 能 が 得 ら れ る こ と が 確 認 さ れ た 。 今 後 、 確 定 診 断 の 得 ら れ た 症 例 が 集 積 さ れ る こ と に よ り 、BSCE の 病 態 の 解 明 が 進 む こ と が 期 待 で き
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る 。
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序 論
類 基 底 細 胞 癌 （Basaloid squamous cell carcinoma、 以 下 「BSC」
と 呼 ぶ ）は 咽 頭 喉 頭 領 域 の 腫 瘍 と し て Wain ら 1に よ っ て 最 初 に 報 告 さ れ た 。頭 頸 部 領 域 以 外 に も 、食 道 2、肺 3、肛 門 4、子 宮 頸 部 5、陰 茎 6、
80
膀 胱 7 な ど で の 発 生 が 報 告 さ れ て い る 。 食 道 類 基 底 細 胞 癌 （Basaloid squamous cell carcinoma of the esophagus、 以 下 「BSCE」 と 呼 ぶ ） は 、 扁 平 上 皮 癌 と 腺 癌 以 外 の 特 殊 型 食 道 癌 に 分 類 さ れ る 、 比 較 的 稀 な 疾 患 で あ る 。 食 道 癌 全 体 に 占 め る 割 合 は 、 日 本 食 道 学 会 報 告 の 2008 年 食 道 切 除 術 施 行 2,657 例 中 、33例（1.2%）を 含 め て 、本 邦 で は 、1.0％
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～8.7％8 - 1 7、 海 外 で は 0.4％ ～11.3％2 , 18- 25と 言 わ れ て い る 。
組 織 学 的 特 徴 は 、 中 心 壊 死 を 伴 う 充 実 性 胞 巣 、 篩 状 偽 房 状 、 導 管 様 配 列 、 腺 様 小 嚢 胞 様 胞 巣 、 硝 子 様 物 質 の 沈 着 、 扁 平 上 皮 癌 部 分 の 併 存 な ど 16が 指 摘 さ れ て い る が 、 そ の 組 織 型 の 多 様 性 の た め 、 鑑 別 診 断 に 難 渋 す る こ と が 多 い 。 特 に 、 腺 様 嚢 胞 癌 、 小 細 胞 癌 、 低 分 化 型 扁 平 上
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皮 癌 、腺 扁 平 上 皮 癌 と の 鑑 別 を 要 す る 2 ,24 ,2 6,2 7。ま た 、術 前 内 視 鏡 的 生 検 で の 確 定 診 断 は 困 難 と い わ れ て お り 、正 診 率 は 0～10％24 ,25 ,28と 診 断 率 が 非 常 に 低 い の が 現 状 で あ る 。 こ れ ま で に も 、 免 疫 染 色 2, 9,1 2, 16, 19 ,20
や Polymerase Chain Reaction(以 下 PCR)29, 30に よ る 鑑 別 診 断 の 報 告 が な さ れ て き た が 、 い ず れ も 特 異 性 を 示 せ て い な い 。
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BSCE の 予 後 に 関 し て は 、 ま だ 一 定 の 見 解 が 得 ら れ て い な い が 、 扁 平 上 皮 癌 よ り も 増 殖 能 や 細 胞 学 的 悪 性 度 が 高 い と い わ れ て お り 2 ,1 6 ,2 1、 進 行 癌 で は 予 後 不 良 と い う 報 告 31も な さ れ て い る 。 予 後 改 善 に は 、 手 術 、 化 学 放 射 線 療 法 に 加 え て 、 新 た な 集 学 的 治 療 法 の 確 立 が 必 要 と 考 え ら れ る 2 5。し か し 、そ の 疾 患 の 希 少 性 お よ び 鑑 別 診 断 の 困 難 さ か ら 、
100
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食 道 癌 診 断 ・ 治 療 ガ イ ド ラ イ ン 3 2に お い て も 、BSCE に 対 す る 特 徴 的 な 治 療 法 の 記 載 は な く 、、通 常 の 食 道 扁 平 上 皮 癌 に 準 じ て 行 わ れ て い る の が 現 状 で あ る 15。
以 上 よ り 、BSCE の 診 断 精 度 の 向 上 が 不 可 欠 で あ る が 、 既 存 の 方 法 で は こ の 問 題 を 解 決 で き ず 、精 度 の 高 い BSCE 鑑 別 診 断 法 の 確 立 が 望
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ま れ て い る 。
こ れ ま で に 、 当 施 設 独 自 の 手 法 を 用 い た 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 に よ っ て 、疾 患 特 異 的 な 遺 伝 子 発 現 が 存 在 す る こ と が 報 告 さ れ て き た 3 3 ,3 4。 今 回 、 食 道 癌 手 術 検 体 を 用 い た 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 を 行 い 、BSCE を 鑑 別 診 断 可 能 な 遺 伝 子 群 の 抽 出 を 行 っ た 。 そ し て 、 抽 出 し た 遺 伝 子
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の 各 検 体 に お 遺 伝 子 発 現 値 を 合 計 し 、 そ の 合 計 値 （ ス コ ア ） を 小 さ い 順 に 並 べ 替 え て 、 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム の 構 築 を 行 っ た 。 次 に 、 食 道 癌 生 検 検 体 に お い て 、 構 築 さ れ た 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム を 用 い て 、BSCE が 鑑 別 可 能 で あ る か を 検 証 し た 。
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検 討 1
手 術 検 体 で の 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 、 特 異 的 遺 伝 子 群 の 抽 出 、 お よ び 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム の 構 築
方 法
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患 者 選 択
2008 年 1月 か ら 2015 年 7 月 の 間 に 、福 島 県 立 医 科 大 学 臓 器 再 生 外 科 学 講 座 に お い て 、本 研 究 に 対 す る 同 意 が 得 ら れ た 食 道 癌 患 者 の う ち 、 手 術 検 体 が 採 取 可 能 で あ っ た 患 者 30名 を 対 象 と し た 。
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倫 理 審 査
本 研 究 は 福 島 県 立 医 科 大 学 の 倫 理 審 査 に て 承 認 を 得 て い る 。 受 付 番 号 ：1953『 遺 伝 子 発 現 解 析 技 術 を 活 用 し た 個 別 が ん 医 療 の 実 現 と 抗 が ん 剤 開 発 の 加 速 （ 第 三 期 ）』
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食 道 類 基 底 細 胞 癌 の 病 理 学 的 診 断
手 術 検 体 を 、Hematoxylin and Eosin（H.E）染 色 し 、二 人 の 病 理 医 に よ り 病 理 学 的 診 断 を 行 っ た 。BSCE は 、Wain1 ら の 示 し た 病 理 学 的 基 準 を 用 い て 診 断 し 、か つ 、Imamhasan1 6ら が 示 し た 特 徴 的 な 組 織 学
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的 所 見 の 6 パ タ ー ン 、 中 心 壊 死 を 伴 う 充 実 性 胞 巣 、 篩 状 偽 房 状 、 導 管 様 配 列 、 腺 様 小 嚢 胞 様 胞 巣 、 硝 子 様 物 質 の 沈 着 、 扁 平 上 皮 癌 部 分 の 併 存 、 を 参 照 し た 。 各 症 例 に お い て こ れ ら 6 種 類 の 所 見 の 発 現 割 合 も 検 討 し 、 総 合 的 に 診 断 し た 。
本 研 究 で は 、 腫 瘍 の 大 部 分 が 扁 平 上 皮 癌 成 分 で あ っ て も 、BSCE 成
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分 を 一 部 に で も 混 在 し て い る も の は 、BSCE症 例 と し て 検 討 を 行 っ た 。 病 理 画 像 は 、HS オ ー ル イ ン ワ ン 蛍 光 顕 微 鏡 BZ-9000（KEYENCE, Osaka, Japan） を 用 い て 撮 影 し た 。 画 像 処 理 は Illustrator(Adobe System Inc., CA, USA)を 用 い て 行 っ た 。
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検 体 の 採 取 方 法
手 術 標 本 か ら の 検 体 採 取 は 、 標 本 摘 出 直 後 、 病 変 部 分 お よ び 、 病 変 部 分 か ら 5cm以 上 離 し た 正 常 部 分 か ら 、約 7×7mm大 の 検 体 を 採 取 し 、 凍 結 保 存 用 チ ュ ー ブ に 入 れ 、 液 体 窒 素 で 凍 結 さ せ た 。 残 り の 標 本 は ホ ル マ リ ン 固 定 後 、パ ラ フ ィ ン 包 埋 切 片 を 作 成 し 病 理 学 的 診 断 を 行 っ た 。
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1 対 1 対 応 す る 凍 結 検 体 と 病 理 学 的 診 断 用 の 検 体 は 、 同 一 の も の と み な し 解 析 を 行 っ た 。
R N A 抽 出 お よ び 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル の 取 得
凍 結 検 体 は 、ISOGEN（Nippon Gene Co., Ltd., Tokyo, Japan） を
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用 い て total RNAを 抽 出 し た 。125 µg 以 上 の total RNA が 取 得 で き た サ ン プ ル は 、 引 き 続 き 、MicroPoly(A)purist kit(Ambion, Austin, TX, USA)を 用 い て poly(A)+RNA 精 製 を し た 。
ヒ ト 共 通 リ フ ァ ラ ン ス RNA は 、22 種 類 の ヒ ト が ん 細 胞 株 （A431、
A549、AKI、HBL‑100、HeLa、HepG2、HL60、IMR‑32、Jurket、
170
K562、KP4、MKN7、NK‑92、Raji、RD、Saos‑2、SK‑N‑MC、SW‑13、
T24、U251、U937 お よ び Y79）か ら 精 製 し た poly(A)+RNA を 等 量 混 合 し た も の を 使 用 し た 。
poly(A)+RNA を 用 い た 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル 取 得 の た め の DNA マ イ ク ロ ア レ イ は 、ヒ ト 由 来 の 転 写 産 物 に 対 応 す る 31,797 種 類 の 合 成
175
8
DNA（80 mers） を カ ス タ ム ア レ イ ヤ ー で ス ラ イ ド ガ ラ ス 上 に ア レ イ 化 し た 。
手 術 検 体 由 来 の RNA は 、 2 µg の poly(A)＋ RNA か ら 、 SuperScript Ⅱ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) お よ び Cyanine 5-dUTP (Perkin-Elmer Inc., Boston, MA, USA)を 用
180
い て cDNAを 合 成 す る こ と に よ り 標 識 し た 。 同 様 に し て 、 ヒ ト 共 通 リ フ ァ ラ ン ス RNA は 、2 µg の poly(A)＋RNAか ら 、SuperScript Ⅱ お よ び Cyanine 3-dUTP (Perkin-Elmer Inc.)を 用 い て cDNAを 合 成 す る こ と に よ り 標 識 し た 。
ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン は 、 Labeling and Hybridization kit
185
(MicroDiagnostic, Tokyo, Japan)を 用 い て 行 っ た 。
蛍 光 強 度 は 、GenePix 4000B Scanne r (Axon Instruments, Inc., Union City, CA, USA)を 用 い て 測 定 し 、 発 現 比 （Cyanine-5 の 蛍 光 強 度/Cyanine-3 の 蛍 光 強 度 ） を 算 出 し た 。 さ ら に 、GenePix Pro 3.0 software（Axon Instruments, Inc.） を 用 い て 、 当 該 発 現 比 に ノ ー マ
190
ラ イ ゼ ー シ ョ ン フ ァ ク タ ー を 乗 じ て ノ ー マ ラ イ ズ し た 。 次 に 、 発 現 比 の 値 を log2 に 変 換 し た （ 変 換 値 ）。 な お 、 デ ー タ の 変 換 は エ ク セ ル
（ Microsoft, Bellevue, WA, USA） お よ び MDI gene expression analysis software package（MicroDiagnostic） を 用 い て 行 っ た 35。
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手 術 検 体 に お け る 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 、 お よ び ク ラ ス タ 解 析 方 法 Step1（0 削 除 ）:BSCE と 病 理 診 断 さ れ た 全 検 体 中 2 検 体 以 上 で 、 蛍 光 強 度 が 検 出 限 界 以 下 で あ っ た 遺 伝 子 を 除 い た 。Step2｜ 変 換 値 ｜
≧1:全 手 術 検 体 中 1 検 体 以 上 で 、 変 換 値 が 1 以 上 ま た は －1 以 下 の 条 件 を 満 た す 遺 伝 子 群 を 抽 出 し た 。Step3｜ 平 均 値 － 各 変 換 値 ｜ ≧1:各 遺
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9
伝 子 に つ い て 全 検 体 の 変 換 値 の 平 均 値 を 算 出 し 、1 検 体 以 上 で 、 平 均 値 と の 差 が 1 以 上 ま た は －1 以 下 の 値 を 有 す る 遺 伝 子 群 を 抽 出 し た 。 Step4（ ク ラ ス タ 分 析 ）:Step3 で 抽 出 し た 遺 伝 子 の 発 現 デ ー タ を も と に 、 二 次 元 方 向 で ク ラ ス タ 分 析 を 行 っ た 。
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手 術 検 体 に お け る 食 道 類 基 底 細 胞 癌 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム の 構 築
Step5 平 均 値 （BSCE 検 体 ） ≧1:Step4 で の ク ラ ス タ 解 析 の 結 果 、 BSCE ク ラ ス タ に 含 ま れ る 検 体 （ 以 下 「BSCE 検 体 」 と 呼 ぶ ） の 変 換 値 の 平 均 値 を 算 出 し 、 そ の 値 が 1 以 上 に な る 遺 伝 子 群 を 抽 出 し た 。
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Step6（ 非 BSCE 検 体 で の 0削 除 ）:BSCE 以 外 の 検 体（ 以 下「 非 BSCE 検 体 」と 呼 ぶ ）の う ち 、26検 体 以 上 で 蛍 光 強 度 が 検 出 限 界 以 下 の 遺 伝 子 群 を 除 い た 。Step7（ 非 BSCE 検 体 標 準 偏 差 ：SD＜0.5）:非 BSCE 検 体 の 変 換 値 の 標 準 偏 差 を 算 出 し 、 そ の 値 が 0.5 未 満 に な る 遺 伝 子 群 を 抽 出 し た 。Step8 平 均 値 （BSCE 検 体 ） － 平 均 値 （ 非 BSCE 検 体 ）
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≧1:BSCE 検 体 の 変 換 値 の 平 均 値 と 、 非 BSCE 検 体 の 変 換 値 の 平 均 値 の 差 が 1 以 上 に な る 遺 伝 子 群 を 抽 出 し た 。Step9（ t 検 定 に よ る 二 群 比 較 ）:変 換 値 の 平 均 値 を 、BSCE 検 体 と 非 BSCE 検 体 の 間 で t検 定 に よ る 二 群 比 較 で 検 討 を 行 い 、P<0.01 と な る 遺 伝 子 群 を 抽 出 し た 。 Step10 :Step9 ま で で 抽 出 し た 遺 伝 子 の 各 検 体 に お け る 変 換 値 の 合 計
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値 （ 遺 伝 子 発 現 ス コ ア ） を 算 出 し 、 そ の ス コ ア を 小 さ い 順 に 並 べ 替 え て 、 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム を 構 築 し た 。
統 計 解 析
ク ラ ス タ 分 析 は 、Expression View Pro（MicroDiagnostic）を 用 い 、
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10
ユ ー ク リ ッ ド 距 離 に よ る 群 平 均 法 に て 行 っ た 。
結 果
症 例 数 お よ び 検 体 数
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手 術 患 者 30 名 の う ち 、病 理 学 的 検 討 に よ り 、BSCEと 診 断 し た 患 者 は 6 名 で あ っ た 。十 分 な 量 の RNA が 得 ら れ 、網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 が 可 能 で あ っ た 手 術 検 体 は 合 計 で 57 検 体 で あ っ た 。そ の 内 訳 は 正 常 食 道 組 織 26 検 体 、 扁 平 上 皮 癌 23 検 体 、BSCE 7 検 体 、 内 分 泌 細 胞 癌 1検 体 で あ っ た 。網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 を 行 っ た 手 術 検 体 の 内 訳 を Table 1
235
に 示 す 。
食 道 類 基 底 細 胞 癌 手 術 症 例 の 臨 床 病 理 学 的 結 果
当 科 で 手 術 を 行 っ た BSCE症 例 の 臨 床 病 理 学 的 特 徴 を Table 2 に 示 し た 。男 性 が 5例 、女 性 が 1 例 、平 均 年 齢 は 62.6歳（55~68 歳 ）で あ っ た 。術 前 生 検 に お い て BSCEの 診 断 が 得 ら れ て い た も の は 3例（3/6、
240
50%） で あ っ た 。 腫 瘍 径 は 平 均 で 28.6mm（12～45mm）、 腫 瘍 の 存 在 部 位 は 、 全 例 が 胸 部 中 部 食 道 で あ っ た 。UICC 第 7 版 で の TNM 分 類 で は 、 Ⅰ 期 が 4 例 、 Ⅱ 期 が 1 例 、 Ⅲ 期 が 1 例 。 Ⅰ 期 の 1 例 が 術 後 58 カ 月 で 原 病 死 、 Ⅲ 期 の 1 例 が 術 後 19 カ 月 で 原 病 死 、 Ⅱ 期 の 1 例 で 術 後 再 発 を 認 め る も 生 存 中 、 Ⅰ 期 の 3 例 が 無 再 発 生 存 中 （ 観 察 期 間 7～
245
60 ケ 月 ） で あ る 。 症 例 4 の 病 理 写 真 を Fig 1に 示 す 。
BSCE 検 体 の 内 訳 は 、 症 例 1.2.3.5 か ら 各 1 検 体 と 、 症 例 4 か ら は 大 型 の 腫 瘍 を 3分 割 し た 3検 体 の 合 計 7 検 体 で あ っ た 。症 例 6は 摘 出 し た 病 変 部 分 が 微 小 で あ っ た た め 、 遺 伝 子 解 析 用 検 体 は 採 取 不 可 能 で あ っ た 。 症 例 4 に お い て 、3 分 割 し た 検 体 の 各 遺 伝 子 発 現 ス コ ア は ほ
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11
ぼ 同 等 で あ っ た 。（Table 2）
手 術 検 体 に お け る 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 、 お よ び ク ラ ス タ 解 析 結 果 BSCE 7 検 体 を 含 む 手 術 57 検 体 の 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 、お よ び ク ラ ス タ 解 析 を 行 っ た 結 果 を Fig 2 に 示 す 。 以 下 に 、 そ の 解 析 結 果 を 示
255
す 。Step1:0 削 除 に お い て 、10,027 遺 伝 子 へ 絞 り 込 ん だ 。Step2:｜ 変 換 値 ｜ ≧1 の 計 算 に お い て 、9,004 遺 伝 子 へ 絞 り 込 ん だ 。Step3:｜ 平 均 値-各 変 換 値 ｜ ≧1 の 計 算 に お い て 、7,379 遺 伝 子 を 抽 出 し た 。Step4:
抽 出 し た 7,379 遺 伝 子 の 発 現 デ ー タ を も と に 、 二 次 元 方 向 で ク ラ ス タ 分 析 を 行 っ た 。
260
そ の 結 果 、57 検 体 は 、BSCE 7 例 の う ち 6 例 で 構 成 さ れ て い る ク ラ ス タ（ 以 下「BSCEク ラ ス タ 」と 呼 ぶ ）、主 と し て 扁 平 上 皮 癌 で 構 成 さ れ て い る ク ラ ス タ 、 お よ び 、 主 と し て 正 常 食 道 組 織 で 構 成 さ れ て い る ク ラ ス タ に 分 類 さ れ た 。
265
食 道 類 基 底 細 胞 癌 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム の 構 築
BSCE と そ の 他 の 検 体 を 明 確 に 区 別 す る た め の マ ー カ ー 遺 伝 子 を 絞 り 込 み 、 そ れ ら の 遺 伝 子 の 変 換 値 を 合 計 す る ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム の 構 築 を 試 み た 。Step5:平 均 値（BSCE 6 検 体 ）≧1を 満 た す 、986 遺 伝 子 を 抽 出 し た 。Step6:非 BSCE 50 検 体 で の 0削 除 の 計 算 に お い て 、972
270
遺 伝 子 へ 絞 り 込 ん だ 。Step7:非 BSCE 50検 体 標 準 偏 差：SD＜0.5 を 満 た す 、243 遺 伝 子 を 抽 出 し た 。Step8:平 均 値（BSCE 6 検 体 ）－ 平 均 値
（ 非 BSCE 50 検 体 ） ≧1 の 計 算 に よ り 、100 遺 伝 子 へ 絞 り 込 ん だ 。 Step9:二 群 比 較 で P<0.01 の 条 件 を 満 た す 、75 遺 伝 子 を 抽 出 し た 。
（Table 3）Step10 :抽 出 し た 75遺 伝 子 の 各 検 体 に お け る 変 換 値 の 合 計
275
12
値 （ 遺 伝 子 発 現 ス コ ア ） を 算 出 し 、 そ の ス コ ア を 左 か ら 小 さ い 順 に 並 べ 替 え て 、 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム を 構 築 し た 。
BSCE と 非 BSCEを 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム に 当 て は め た と こ ろ 、75 遺 伝 子 発 現 ス コ ア ＝56.5 以 上 で 、BSCE 7 例 全 て を 、 非 BSCE 検 体 と 明 確 に 区 別 で き る こ と が 明 ら か と な っ た （Fig 3）。
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検 討 2
生 検 検 体 で の 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 、 お よ び 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム で の 検 証
方 法
305
患 者 選 択
検 討 1 と 同 様 の 条 件 下 で 、 内 視 鏡 的 生 検 で 検 体 が 採 取 可 能 で あ っ た 患 者 80 名 を 対 象 と し た 。
310
倫 理 審 査
検 討 1 と 同 じ く 、 倫 理 審 査 に て 承 認 を 得 て い る 。
食 道 類 基 底 細 胞 癌 の 病 理 学 的 診 断
検 討 1 と 同 じ 条 件 で 、 生 検 検 体 の 病 理 学 的 診 断 を 行 っ た 。
315
検 体 の 採 取 方 法
生 検 検 体 に 関 し て は 、 上 部 消 化 管 内 視 鏡 検 査 時 に 生 検 鉗 子
（OLYMPUS FB-230K, OLYMPUS Co., Ltd., Tokyo, Japan） を 用 い て 、 病 変 部 分 お よ び 正 常 部 分 か ら 、 約 3×3mm大 の 検 体 を 採 取 し 、 凍
320
結 保 存 用 チ ュ ー ブ に 入 れ 、 液 体 窒 素 で 凍 結 さ せ た 。 ま た 、 凍 結 用 検 体 採 取 部 位 か ら で き る だ け 近 接 し た 部 分 か ら 再 度 検 体 を 採 取 し 、 ホ ル マ リ ン 固 定 後 、 病 理 学 的 診 断 を 行 っ た 。
隣 接 し た 部 位 か ら 採 取 し た 凍 結 検 体 と 病 理 学 的 診 断 用 の 検 体 は 、 同 一 の も の と み な し 解 析 を 行 っ た 。
325
14
R N A 抽 出 お よ び 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル の 取 得
凍 結 検 体 は 、ISOGEN（Nippon Gene Co., Ltd.）を 用 い て total RNA を 抽 出 し た 。 生 検 検 体 か ら の total RNA 取 得 量 は す べ て 125 µg 以 下 で あ っ た 。 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル 取 得 に は 、 抽 出 し た total RNA の
330
う ち 5 µg を 使 用 し た 。ヒ ト 共 通 リ フ ァ ラ ン ス RNA は 、検 討 1と 同 じ く 22 種 類 の ヒ ト が ん 細 胞 株 か ら 精 製 し た total RNA を 等 量 混 合 し た も の を 使 用 し た 。
total RNA を 用 い た 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル 取 得 の た め の DNA マ イ ク ロ ア レ イ は 、 ヒ ト 由 来 の 転 写 産 物 に 対 応 す る 14,400 種 類 の 合 成
335
DNA（80 mers） を カ ス タ ム ア レ イ ヤ ー で ス ラ イ ド ガ ラ ス 上 に ア レ イ 化 し た 。
RNAの 標 識 、ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 、蛍 光 強 度 の 測 定 、お よ び 発 現 比 の 測 定 は 、 検 討 1と 同 じ 手 法 で 行 っ た 。
340
診 断 精 度 の 検 証
生 検 検 体 か ら 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル を 取 得 し 、 検 討 1で 抽 出 し た 75 遺 伝 子 の 発 現 ス コ ア を 算 出 し 、遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム を 用 い た BSCE の 診 断 を 行 っ た 。 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム の 診 断 精 度 を 検 証 す る た め に 、ROC（Receiver Operating Characteristic
345
curve）曲 線 を 用 い て 、ROC曲 線 下 面 積（AUC: area under the curve）
と 至 適 カ ッ ト オ フ 値 を 求 め た 。ROC曲 線 の 作 成 は 、SPSS St atistics 23
（SPSS, Inc., Chicago, IL, USA） を 用 い て 行 い 、至 適 カ ッ ト オ フ 値 の 設 定 は 、 感 度 と 特 異 度 の 和 が 最 大 と な る 値 と し た 。
350
15
結 果
症 例 数 お よ び 検 体 数
80 名 の 患 者 の う ち 、 生 検 検 体 の み 採 取 し た 患 者 が 68 名 、 手 術 お よ び 生 検 検 体 の 両 方 が 採 取 可 能 で あ っ た 患 者 が 12 名 で あ っ た 。80 名 の
355
う ち 、BSCE と 診 断 し た 患 者 は 、 手 術 を 施 行 し た 3 名 と 、 生 検 で の み 診 断 し た 1名 の 合 計 4 名 で あ っ た 。 十 分 な 量 の RNA が 得 ら れ 、 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 が 可 能 で あ っ た 検 体 は 合 計 で 312検 体 で あ っ た 。 そ の 内 訳 は 、 正 常 食 道 組 織 229 検 体 、 扁 平 上 皮 癌 51 検 体 、BSCE 8検 体 、内 分 泌 細 胞 癌 1検 体 、腺 癌 21 検 体 、上 皮 内 腫 瘍 2検 体 で あ っ た 。
360
本 研 究 で 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 を 行 っ た 生 検 検 体 の 内 訳 を Table 4 に 示 す 。
食 道 類 基 底 細 胞 癌 生 検 症 例 の 詳 細
BSCE と の 病 理 診 断 で あ っ た 生 検 8検 体 の 詳 細 を Table 5 に 示 す 。
365
BSCE 生 検 検 体 の 内 訳 は 、 症 例 5.7か ら 各 1 検 体 、 症 例 6 か ら 2 検 体 、 症 例 4 か ら 4 検 体 の 合 計 8 検 体 で あ っ た 。Table 2 で 示 し た 症 例 1.2. 3 に お い て は 、生 検 検 体 を 凍 結 標 本 に は 提 出 し て い な い 。ま た 症 例 7 で は 手 術 未 施 行 で あ る 。
370
遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム を 用 い た 生 検 検 体 の 診 断 精 度 の 検 証 生 検 312検 体 を 、検 証 1で 構 築 し た 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム を 用 い て 解 析 を 行 っ た 。 結 果 を Table 5、Fig 4 に 示 す 。 カ ッ ト オ フ 値 を 56.5 と し た 場 合 は 、 感 度 62.5%、 特 異 度 99.3%で あ っ た 。 生 検 検 体 を よ り よ く 鑑 別 す る た め の 至 適 カ ッ ト オ フ 値 を 求 め る た め に 、
375
16
ROC 曲 線 を 用 い て 検 証 し た （Fig 5）。75 遺 伝 子 発 現 ス コ ア ＝40.5 を カ ッ ト オ フ 値 と す る と 、AUC＝0.981、 感 度 87.5％ 、 特 異 度 99.0％ で あ り 、 精 度 よ く 鑑 別 が 可 能 で あ っ た 。
380
385
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400
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考 察
BSCE の 診 断 精 度 の 向 上 を 目 的 に 、 手 術 検 体 を 用 い て 当 施 設 独 自 の 手 法 を 用 い た 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 を 行 い 、75個 の 遺 伝 子 群 を 抽 出 し た 。 そ し て 、BSCE 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム を 構 築 し た 。 こ
405
の 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム を 用 い て 生 検 検 体 を 解 析 す る と 、 BSCE を 感 度 87.5％ 、 特 異 度 99.0％ で 鑑 別 可 能 で あ っ た 。 抽 出 し た 75 遺 伝 子 を 用 い た 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム は 、BSCEの 新 た な 鑑 別 診 断 法 に 成 り 得 る こ と が 示 さ れ た 。 こ れ ま で 病 理 医 が 診 断 に 迷 う 場 合 が 多 か っ た 、微 小 生 検 検 体 で の BSCE に 対 す る 鑑 別 診 断 の 精 度
410
向 上 に 大 き く 寄 与 で き る と 考 え ら れ る 。
BSCE の 術 前 内 視 鏡 的 生 検 で の 病 理 学 的 診 断 は 特 に 困 難 と い わ れ て い る 。 本 研 究 で は 、 内 視 鏡 的 生 検 で 6 例 中 3 例 （50％ ） の 術 前 診 断 を 得 て い た が 、こ れ ま で の 報 告 で は 正 診 率 は 0～10％24, 25 ,28と 低 い の が 現 状 で あ る 。 実 際 に は 、BSCE が 粘 膜 下 腫 瘍 様 形 態 を 呈 し 、 腫 瘍 表 面 を
415
正 常 の 食 道 粘 膜 や 通 常 扁 平 上 皮 癌 が 覆 っ て い る こ と が 多 い た め 、 扁 平 上 皮 癌 と 診 断 さ れ る 場 合 が 多 い 1 4 ,1 5。 ま た 、BSCE が 多 様 な 組 織 学 的 形 態 を 有 し て お り 、 生 検 で の 微 小 検 体 で は 全 体 像 を と ら え に く く 、 正 確 な 診 断 が 困 難 で あ る と 推 察 さ れ る 。 よ っ て 、BSCE の 生 検 で は 、 厚 い 組 織 を 複 数 個 採 取 す る こ と が 勧 め ら れ て い る 25。
420
手 術 検 体 に お い て も 、BSCE が 持 つ 多 様 な 組 織 学 的 形 態 に よ り 、 病 理 学 的 診 断 は 困 難 で あ る 場 合 が あ る 。 こ れ ま で に 、BSCE と 他 の 組 織 型 と の 鑑 別 診 断 の た め 、 免 疫 組 織 学 的 検 討 が 報 告 さ れ て き た 。BSCE と 頭 頸 部 領 域 の BSCを CK sub type 毎 に 検 討 し た 報 告 36で は 、CK8 で 気 管/唾 液 腺 の 粘 表 皮 癌 と 、CK17で 気 管/唾 液 腺 の 腺 様 嚢 胞 癌 と の 鑑
425
18
別 可 能 性 を 示 し て い る が 、 扁 平 上 皮 癌 と の 鑑 別 は で き て い な い 。 そ の 他 に 、CK132 , 1 2、CK142 ,1 2 ,1 4 ,1 6 ,3 7、CK191 2 ,2 0 ,3 7 な ど の 報 告 が あ る が 、 BSCE に 特 異 的 な 染 色 性 は 認 め て い な い 。 癌 抑 制 遺 伝 子 で あ る p53蛋 白 、Rb蛋 白 の 免 疫 組 織 学 的 検 討 で は 、BSCE と 扁 平 上 皮 癌 で は 発 現 に 差 が 認 め ら れ て い な い 12 , 38 , 39。 こ れ ら 多 く の 免 疫 組 織 学 的 検 討 で は 、
430
い ず れ も 特 異 性 を 示 せ て い な い 。そ の 他 、免 疫 染 色 と PCRを 組 み 合 わ せ た 検 討 で は 、Bcl-2 蛋 白 の 発 現 と c-myc 遺 伝 子 の 増 幅 が 同 時 に 認 め て い る 割 合 が 、BSCE が 扁 平 上 皮 癌 よ り も 高 い と い う 報 告 2 9が あ る 。 し か し 、 特 異 度 は 100％ だ が 、 感 度 が 43.5％ と 低 く 、 精 度 が 高 い 鑑 別 診 断 法 と は 成 り に く い と 考 え ら れ る 。 今 回 の 研 究 で は 、 複 数 の 遺 伝 子
435
を 組 み 合 わ せ た 解 析 方 法 で 、 感 度 、 特 異 度 と も に 高 い 鑑 別 診 断 が 可 能 で あ っ た 。
当 施 設 独 自 の 手 法 を 用 い た 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 に よ っ て 、 疾 患 特 異 的 な 遺 伝 子 発 現 が 存 在 す る こ と が 報 告 さ れ て き た 33 , 34。 本 研 究 で 用 い た 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 は 、 ⅰ ） 生 検 材 料 の よ う な 微 量 な 検 体 で
440
も 解 析 が 可 能 な 点 、ⅱ ）RNAを 増 幅 す る こ と な く 、遺 伝 子 発 現 解 析 が で き る 点 、 ⅲ ） 共 通 リ フ ァ ラ ン ス に 対 す る RNA の 存 在 比 と し て 検 出 す る た め 、 す べ て の 検 体 を 横 並 び に 比 較 で き る 点 で 他 の 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 シ ス テ ム と は 異 な る 特 徴 が あ る 。 本 研 究 で は 、 抽 出 し た 75 遺 伝 子 の 発 現 ス コ ア に よ る 検 討 を 行 っ た 。75 遺 伝 子 発 現 ス コ ア を 小 さ
445
い 順 に 並 べ て 、一 定 の カ ッ ト オ フ 値 を 設 定 す る こ と に よ り 、高 い 感 度 、 特 異 度 で BSCE の 鑑 別 が 可 能 で あ る こ と が 示 さ れ た 。
本 研 究 の 課 題 は 、1対 1対 応 す る 病 理 学 的 診 断 用 検 体 と 凍 結 検 体 は 、 同 一 組 織 を 2 分 割 し た も の で は な い と い う 点 で あ る 。 つ ま り 、 隣 接 し た 組 織 を 病 理 学 的 診 断 用 と 遺 伝 子 解 析 用 と に 別 々 に 提 出 し て お り 、 真
450
19
に 同 一 の 組 織 を 解 析 し て い る こ と に は な っ て い な い 点 で あ る 。 実 際 、 Fig 4、Fig 5の 結 果 に お い て 、 偽 陰 性 の 1 検 体 は 、 症 例 6か ら の 検 体
（Table 5 の ⑦ ） で あ っ た 。 症 例 6 は 大 部 分 が 扁 平 上 皮 癌 で 覆 わ れ て お り 、 一 部 に BSCEを 含 む 腫 瘍 で あ っ た た め 、 病 理 用 生 検 で は BSCE 部 分 を 採 取 し た が 、 凍 結 検 体 で は 、 純 粋 な 扁 平 上 皮 癌 部 分 を 採 取 し て
455
い た 可 能 性 が 考 え ら れ る 。ま た 、偽 陽 性 の 3検 体 中 2検 体 は 、症 例 5.6 か ら 検 体 （Table 5 の#、##） を 採 取 し た も の で あ っ た 。 病 理 用 生 検 で は 扁 平 上 皮 癌 部 分 を 採 取 し た が 、凍 結 検 体 で は BSCE部 分 を 確 実 に 採 取 で き て い た 可 能 性 が 考 え ら れ る 。 偽 陽 性 の 残 り 1 検 体 は 、 生 検 の み 施 行 し た 扁 平 上 皮 癌 症 例 で あ っ た 。 病 理 用 生 検 で は 扁 平 上 皮 癌 と の 診
460
断 で あ っ た が 、遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム で の 解 析 結 果 か ら は 、 凍 結 検 体 が BSCE で あ っ た 可 能 性 が 強 く 示 唆 さ れ た 。 し か し 、 再 生 検 お よ び 手 術 は 施 行 し て お ら ず 、病 理 学 的 な BSCE の 診 断 変 更 に は い た っ て い な い 。こ れ ら の 結 果 か ら 、75遺 伝 子 発 現 ス コ ア が カ ッ ト オ フ 値 以 上 で あ る 症 例 は 、 た と え 病 理 診 断 が BSCEで は な く て も 、 再 生 検 を
465
考 慮 す る と と も に 、 注 意 深 い 病 理 学 的 診 断 を 行 う 必 要 が あ る と 考 え ら れ る 。
本 研 究 で は 、検 討 1か ら 導 い た カ ッ ト オ フ 値 は 56.5で あ っ た が 、検 討 2で は 導 い た カ ッ ト オ フ 値 は 40.5で 、検 討 1と は 値 が 異 な っ て い た 。 一 方 、Fig 4の 結 果 か ら は 、カ ッ ト オ フ 値 40.5 で も 手 術 検 体 は 感 度 特
470
異 度 と も に 100％ で 鑑 別 可 能 で あ っ た 。本 報 告 で の カ ッ ト オ フ 値 40.5 が 暫 定 的 な 至 適 カ ッ ト オ フ 値 と い え る が 、 症 例 の 蓄 積 に よ り カ ッ ト オ フ 値 が 変 動 す る 可 能 性 が あ り 、症 例 を 重 ね て 更 な る 検 討 が 必 要 で あ る 。
今 後 の 臨 床 応 用 へ の 課 題 は 、BSCE の 特 異 的 遺 伝 子 の 発 現 系 を 、 Real-Time PCRや 抗 原 抗 体 反 応 で 確 認 で き る か ど う か で あ る 。本 研 究
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で の 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル の 取 得 に は 、 解 析 時 間 に 最 短 で も 4 日 か か り 、1検 体 の 解 析 コ ス ト も 安 価 で は な い 。 今 後 、Real-Time PCRや 抗 原 抗 体 反 応 で の 検 証 を 可 能 に す る た め に も 、75 遺 伝 子 か ら さ ら に 遺 伝 子 数 を 絞 り 込 む 必 要 が あ る 。BSCE を 鑑 別 可 能 な よ り 簡 便 な 検 査 法 が 確 立 さ れ る こ と で 、 扁 平 上 皮 癌 を 含 め た す べ て の 食 道 癌 診 断 の 一 助
480
と な る こ と が 期 待 で き る 。
手 術 検 体 を 用 い て 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 を 行 い 、BSCE を 鑑 別 可 能 な 75遺 伝 子 を 抽 出 し 、 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム を 構 築 し た 。 特 に 診 断 が 困 難 と さ れ て い る 生 検 検 体 を 、 こ の 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム を 用 い る こ と に よ っ て 、 高 い 精 度 で 鑑 別 診 断 が 可 能 で あ っ
485
た 。こ の 遺 伝 子 発 現 ス コ ア リ ン グ シ ス テ ム は 新 た な BSCEの 鑑 別 診 断 法 と な る と 考 え ら れ る 。 今 後 、 確 定 診 断 の 得 ら れ た 症 例 が 集 積 さ れ る こ と に よ り 、BSCE の 病 態 の 解 明 が 進 む こ と が 期 待 で き る 。
謝 辞
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本 研 究 に あ た り 、 ご 指 導 、 ご 協 力 い た だ い た 方 に 深 く 感 謝 申 し 上 げ ま す 。
病 理 学 的 考 察 を 、 福 島 県 立 医 科 大 学 病 理 病 態 診 断 学 講 座 ： 田 崎 和 洋 氏 、 橋 本 優 子 氏 、 わ た り 病 院 病 理 部 ： 海 上 雅 光 氏 。
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網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 を 、 福 島 県 立 医 科 大 学 医 療 産 業 ト ラ ン ス レ ー シ ョ ナ ル リ サ ー チ セ ン タ ー ： 江 崎 淳 二 氏 、 多 村 博 澄 氏 、 今 井 順 一 氏 、 和 栗 聡 氏 、 渡 邉 慎 哉 氏 。 株 式 会 社 ニ ッ ポ ン ジ ー ン ： 本 間 玲 子 氏 、 西 川 暁 氏 。
500
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引 用 文 献
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