ROCK 阻害剤が胚性幹細胞と人工多能性幹細胞の分 化に及ぼす影響
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(2) 2015 年 度. 東洋大学審査学位論文. ROCK 阻 害 剤 が 胚 性 幹 細 胞 と 人 工 多 能 性 幹 細 胞 の 分化に及ぼす影響. 東洋大学大学院. 生命科学研究科生命科学専攻 学籍番号. 4 910 13 0 001. 博士後期課程. 氏名. 上芝原 佑.
(3) ROCK 阻 害 剤 が 胚 性 幹 細 胞 と 人 工 多 能 性 幹 細 胞 の 分化に及ぼす影響. 上芝原 佑.
(4) ROCK 阻害剤が胚性幹細胞と人工多能性幹細胞の 分化に及ぼす影響. 上芝原. 佑.
(5) 目次. 頁 序論. 1. 第 1章. ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 細胞増殖に及ぼす影響. 8. 第 1節. 緒言. 8. 第 2節. 実験方法. 9. 1.2.1. 培地等の調製. 1.2.2. 培養プレートの調製. 11. 1.2.3. フィーダー細胞の培養. 12. 1.2.4. マ ウ ス ES 細 胞 の 増 殖 培 養. 12. 1.2.5. マ ウ ス ES 細 胞 の 継 代 培 養 と 凍 結 保 存. 13. 1.2.6. マ ウ ス iPS 細 胞 の 増 殖 培 養. 14. 1.2.7. マ ウ ス iPS 細 胞 の 継 代 培 養 と 凍 結 保 存. 15. 1.2.8. ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 未 分 化 状 態 の 確 認. 16. 1.2.9. ROCK 阻 害 剤 に よ る ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 細胞増殖への影響. 第 3節. 実験結果. 1.3.1. ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 増 殖. 1.3.2. ROCK 阻 害 剤 添 加 に よ る ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の増殖への影響. 9. 16 17 17. 17. 第 4節. 考察. 18. 第 5節. 結言. 19.
(6) 第 6節. 第 2章. 参考文献. 19. ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 分化に及ぼす影響. 29. 第 1節. 緒言. 29. 第 2節. 実験方法. 30. 2.2.1. 培地等の調製. 30. 2.2.2. 培養プレートの調製. 30. 2.2.3. マ ウ ス ES 細 胞 の 浮 遊 培 養. 30. 2.2.4. マ ウ ス iPS 細 胞 の 浮 遊 培 養. 31. 2.2.5. 浮遊培養で形成された細胞コロニーの 未分化状態の確認. 31. 2.2.6. 細胞コロニーの分化培養. 31. 2.2.7. 免疫蛍光染色. 32. 2.2.8. フローサイトメトリーによる陽性細胞数の計数. 33. 2.2.9. 統計分析. 33. 第 3節 2.3.1. 実験結果 ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 コ ロ ニ ー の 未分化状態の確認. 2.3.2. 34. 34. ROCK 阻 害 剤 添 加 に よ る 神 経 細 胞 へ の 分化に及ぼす影響. 34. 2.3.3. 分化した神経細胞の種類の同定. 36. 2.3.4. ROCK 阻 害 剤 添 加 に よ る 筋 肉 細 胞 へ の. 2.3.5. 分化に及ぼす影響. 37. 分化した筋肉細胞の種類の同定. 38.
(7) 第 4節. 考察. 39. 第 5節. 結言. 40. 第 6節. 参考文献. 40. 第 3章. ROCK 阻 害 剤 に よ る ES 細 胞 の 神 経 細 胞 へ の 分化促進メカニズム. 56. 第 1節. 緒言. 56. 第 2節. 実験方法. 57. 3.2.1. 培地等の調製. 57. 3.2.2. 培養プレートの調製. 57. 3.2.3. マ ウ ス ES 細 胞 の 浮 遊 培 養. 57. 3.2.4. ウエスタンブロッティング法による ERK 及 び Akt の 検 出. 57. （ 1） 細 胞 サ ン プ ル の 調 製. 57. （ 2） SDS-PAGE 電 気 泳 動 に よ る ERK ま た は Akt の 分 離 及 び ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ る 検 出 58 3.2.5. 各シグナル伝達経路の阻害. 60. 3.2.6. 免疫蛍光染色. 61. 3.2.7. 細 胞 内 Ca 2 + レ ベ ル の 測 定. 61. 3.2.8. 統計分析. 62. 第 3節. 実験結果. 3.3.1. ROCK 阻 害 剤 が ERK シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に 及 ぼ す 影 響. 3.3.2. ROCK 阻 害 剤 が PI3K/Akt シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に. 3.3.3. 62 62. 及ぼす影響. 64. ROCK 阻 害 剤 が PLC シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に 及 ぼ す 影 響. 65.
(8) 3.3.4. ROCK 阻 害 剤 が Cdc42/Rac に 及 ぼ す 影 響. 66. 第 4節. 考察. 66. 第 5節. 結言. 68. 第 6節. 参考文献. 69. 総括と今後の課題. 87. 終章. 本研究に関する原著論文と学会発表. 91. その他の関係論文及び学会発表. 94. 謝辞. 95.
(9) 序論. （ 1） 胚 性 幹 細 胞 及 び 人 工 多 能 性 幹 細 胞 に つ い て マ ウ ス 胚 性 幹 細 胞 （ embryonic stem cell： ES 細 胞 ） は 、 1981 年 に マ ウ ス 胚 の 発 生 3.5 日 目 の 胚 盤 胞 の 内 部 細 胞 塊 （ inner cell mass） か ら 樹 立 さ れ [1]、 続 い て ヒ ト ES 細 胞 が 1998 年 に 樹 立 さ れ た [2]。 樹 立 さ れ た ES 細 胞 は 、白 血 病 抑 制 因 子（ leukemia inhibitory factor：LIF） を培地に添加して培養することで、未分化状態を維持したまま半永久 的 に 増 殖 さ せ る こ と が で き る 。さ ら に 、 ES 細 胞 は 外 胚 葉 、 中 胚 葉 、 内 胚葉の 3 胚葉全てに分化する多分化能を有している。これらの特徴か ら、創薬のための細胞源や移植を目的とした再生医療分野への応用が 期 待 さ れ て い る 。し か し 、ES 細 胞 は 作 製 の 際 に 受 精 卵 を 用 い て い る た め 、倫 理 的 な 問 題 や 拒 絶 反 応 と い っ た 課 題 が あ る [3]。一 方 、こ れ ら の 問 題 を ほ ぼ 解 決 し た の が 人 工 多 能 性 幹 細 胞（ induced pluripotent stem cell： iPS 細 胞 ） で あ る 。 マ ウ ス iPS 細 胞 は 、 2006 年 に 4 つ の 遺 伝 子 （ Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc ）を マ ウ ス の 繊 維 芽 細 胞 に ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を 用 い て 組 み 込 む こ と で 作 製 さ れ た [4]。続 い て 2007 年 に ヒ ト iPS 細 胞 が 樹 立 さ れ た [5]。 iPS 細 胞 は ES 細 胞 と 同 様 の 増 殖 能 及 び 多 分 化 能を有しているだけでなく、体細胞から樹立することが可能なため、 患 者 由 来 の iPS 細 胞 を 用 い る こ と に よ り 疾 患 の 発 症 メ カ ニ ズ ム の 解 明 に も 有 効 で あ る [6]。 ES 細 胞 や iPS 細 胞 を 創 薬 や 再 生 医 療 分 野 に 応 用 す る に は 、分 化 を 制 御する基礎研究が重要である。そのため、多くの研究機関で特定の細 胞に効率良く分化させる物質の探索や、遺伝子レベルで分化を制御す る 方 法 な ど が 試 み ら れ て い る 。我 々 は 、ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細. 1.
(10) 胞への効率的な分化方法について検討した。. （ 2） ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 神 経 変 性 疾 患 に は 多 く の 場 合 、効 果 的 な 治 療 薬 が 少 な い こ と が あ り 、 ES 細 胞 や iPS 細 胞 を 用 い た 創 薬 研 究 に 期 待 が 寄 せ ら れ て い る [7]。 ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 誘 導 法 と し て 、 LIF を 除 い た 培 養 に よ り 、 3 胚 葉 に 分 化 す る 能 力 を 有 す る 胚 様 体 （ embryonic body： EB ） を 形 成 さ せ 、 レ チ ノ イ ン 酸 、 繊 維 芽 細 胞 増 殖 因 子 （ fibroblast growth factor-2： FGF） や 上 皮 増 殖 因 子 （ epidermal growth factor： EGF） な ど を 添 加 す る 方 法 が 用 い ら れ て い る [8]。 ま た 、 BMP シ グ ナ ル と Nodal/Activin/TGF-β シ グ ナ ル を 同 時 に 阻 害 剤 で 阻 害 す る こ と で 、 神 経 系 へ の 分 化 効 率 が 上 が る と い う 報 告 が あ る [9]。 こ れ ら の 報 告 は 、 操作が難しく分化までに時間がかかるといった欠点がある。より簡便 な 操 作 で ES 細 胞 や iPS 細 胞 を 神 経 細 胞 に 分 化 さ せ る 方 法 と し て 、我 々 の 研 究 室 で は 、 ニ ワ ト リ 8 日 胚 脊 髄 後 根 神 経 節 の 培 養 上 清 液 （ dorsal root ganglia-conditioned medium： DRG-CM） を ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 分化培養時に添加することで、効率良く神経細胞に分化させることが 可 能 で あ る こ と を 報 告 し た [10]。し か し 、DRG-CM の 添 加 に よ る 神 経 細 胞 へ の 分 化 率 は 50%程 度 で あ り 、 よ り 簡 便 で 効 率 的 な 分 化 促 進 剤 の 探 索を行った。. （ 3） Rho キ ナ ー ゼ （ ROCK） 阻 害 剤 に つ い て Rho キ ナ ー ゼ （ ROCK） は 、 低 分 子 量 G タ ン パ ク 質 Rho の 下 流 に 位 置 す る セ リ ン /ス レ オ ニ ン キ ナ ー ゼ と し て 見 出 さ れ た [11]。 Rho/ROCK シ グナル伝達経路は、アクチン細胞骨格や細胞接着など様々な細胞機能. 2.
(11) に 関 わ っ て い る こ と が 知 ら れ て い る [12、 13]。 ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 研 究 に お い て 、継 代 培 養 な ど の 操 作 で は 細 胞 を 分散させる必要があるが、これらの幹細胞は分散させた状態で培養す るとアポトーシスにより細胞死を起こすことが知られている。 Watanabe ら は 分 散 に よ り 起 こ る ア ポ ト ー シ ス は 、Rho/ROCK シ グ ナ ル 伝 達 経 路 が 関 わ っ て お り 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と に よ り ア ポ ト ー シ ス が 抑 制 さ れ る こ と を 見 出 し た [14]。 さ ら に 、 細 胞 を 凍 結 保 存 す る 際 に ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る と 、解 凍 後 の 細 胞 生 存 率 が 上 が る こ と が 報 告 さ れ た [15]。ROCK 阻 害 剤 は 、蒸 留 水 に 溶 解 で き 、最 低 で も 4 週 間 は 室 温 で 安 定 し て お り 、 時 間 や 濃 度 依 存 的 に 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ る [16]。 こ れ ら の 報 告 よ り 、 ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 増 殖 培 養 時 に ROCK 阻 害 剤 を 添加することが行われるようになった。 Hirose ら 及 び Bito ら は 、 Rho/ROCK シ グ ナ ル 伝 達 経 路 が 神 経 細 胞 の 軸 索 の 退 縮 に 関 わ っ て お り 、 ROCK の 選 択 的 な 阻 害 剤 で あ る ROCK 阻 害 剤 Y-27632 を 添 加 す る こ と に よ り 、 軸 索 の 退 縮 が 抑 制 さ れ る こ と を 報 告 し た [17、18]。 ま た 、 Rho や ROCK は 、 神 経 変 性 疾 患 の ア ル ツ ハ イ マ ー病やパーキンソン病などにも関与しており、創薬のターゲットにな る 可 能 性 が 報 告 さ れ て い る [19-22]。 以 上 の こ と か ら 、 ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 や iPS 細 胞 を 神 経 細 胞 に 分 化させる新規分化促進剤として有効であると推測された。. （ 4） 本 研 究 内 容 Rho/ROCK シ グ ナ ル 伝 達 経 路 が 様 々 な 細 胞 機 能 に 関 わ っ て い る こ と 、 ROCK 阻 害 剤 が ア ポ ト ー シ ス や 神 経 細 胞 の 軸 索 の 退 縮 を 抑 制 す る こ と か ら 、 ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 を 促 進 さ. 3.
(12) せ る 効 果 が あ る の で は な い か と 考 え た 。ROCK 阻 害 剤 は ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 す る こ と か ら 、ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 分 化 培 養 時 の 細 胞 死 を 抑 制 で きる可能性があること、また神経細胞の軸索の退縮を抑制することか ら 、ROCK 阻 害 剤 が 分 化 促 進 剤 と し て 利 用 で き る 可 能 性 が あ る 。そ こ で 、 ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 について研究した。以下に、各章で述べる内容を示す。 第 １ 章 で は 、 ROCK 阻 害 剤 を マ ウ ス ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 培 養 液 に 添 加 す る こ と で 、増 殖 や 未 分 化 状 態 維 持 に 対 す る ROCK 阻 害 剤 の 影 響 に つ い て 述 べ る 。第 2 章 で は 、浮 遊 培 養 に よ り 得 ら れ た 細 胞 コ ロ ニ ー に ROCK 阻害剤を添加することで、神経細胞への分化を促進させる効果がある かどうかについて検討した結果を述べる。第 3 章では、神経細胞の分 化、生存や増殖に関わるシグナル伝達経路について、タンパク質のリ ン酸化量の測定及び各シグナル伝達経路の阻害剤による標的タンパク 質 の 働 き を 阻 害 す る 方 法 を 用 い て 、ES 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 に 対 す る ROCK 阻 害 剤 の 作 用 機 作 に つ い て 検 討 し た 結 果 を 述 べ る 。. 参考文献 [1]. M.J.. Evans,. M.H.. Kaufman,. Establishment. in. culture. of. pluripotential cells from mouse embryos, Nature 292 (1981) 154 – 156. [2] J.A. Thomson, J.I. Eldor, S.S. Shapiro, M.A. Waknitz, J.J. Swiergiel, V.S. Marshall, J.M. Jones, Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts, Science 282 (1998) 1145 -1147. [3] 発 生 ・ 分 化 ・ 再 生 研 究 2005, 朝 島 誠 編 , 羊 土 社 (2005 年 1 月 ). [4] K. Takahashi, S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells. 4.
(13) from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors, Cell 126 (2006) 663–676. [5] K. Takahashi, K. Tanabe, M. Ohnuki, M. Narita, T. Ichisaka, K. Tomoda, S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Cell 131 (2007) 861-872. [6] I.H. Park, N. Arora, H. Huo, N. Maherali, T. Ahfeldt, A. Shimamura, M.W. Lensch, C. Cowan, K. Hochedlinger, G.Q. Daley, Disease-specific induced pluripotent stem cells, Cell 134 (2008) 877-886. [7] 神 経 系 , 岡 野 栄 之 , 出 澤 真 理 編 , 朝 倉 書 店 (2013). [8] K. Guan, H. Chang, A. Rolletschek, A.M. Wobus, Embryonic stem cell-derived neurogenesis. Retinoic acid induction and lineage selection of neuronal cells, Cell Tissue Research 305 (2001) 171-176. [9] S.M. Chambers, C.A. Fasano, E.P. Papapetrou, M. Tomishima, M. Sadelain, L.Studer, Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling, Nature Biotechnology 27 (2009) 275-280. [10] A. Kitazawa, N. Shimizu, Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into neurons using conditioned medium of dorsal root ganglia, New Biotechnology 28 (2011) 326 -333. [11] 阻 害 剤 活 用 ハ ン ド ブ ッ ク. 秋 山 徹 , 河 府 和 義 編 , 羊 土 社 , (2006. 年 9 月）. [12] 石 崎 敏 理 , Rho 情 報 伝 達 と そ の 生 理 的 意 義 , 日 薬 理 誌 , 121 （ 2003）. 5.
(14) 153-162. [13] L. Castellani, E. Salvati, S. Alemá, G. Falcone, Fine regulation of RhoA and Rock is required for skeletal muscle differentiation, Journal of Biological Chemistry 281 (2006) 15249–15257. [14] K. Watanabe, M. Ueno, D. Kamiya, A. Nishiyama, M. Matsumura, T. Wataya, J.B. Takahashi, S. Nishikawa, S. Nishikawa, K. Muguruma, Y. Sasai, A ROCK inhibitor permits survival of dissociated h uman embryonic stem cells, Nature Biotechnology 25 (2007) 681–686. [15] D.A. Claassen, M.M. Desler, A. Rizzino, ROCK inhibition enhances the recovery and growth of cryopreserved human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, Molecular Reproduction ＆ Development 76 (2009) 722-732. [16] H. Kurosawa, Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells, Journal of Bioscience and Bioengineering 114 (2012) 577 -581. [17] M. Hirose, T. Ishizaki, N. Watanabe, M. Uehata, O. Kranenburg, W.H. Moolenaar, F. Matsumura, M. Maekawa, H. Bito, S. Narumiya, Molecular. dissection. of. the. Rho -associated. protein. kinase. (p160ROCK)-regulated neurite remodeling in neuroblastoma N1E-115 cells, Journal of Cell Biology 141 (1998) 1625-1636. [18] H. Bito, T. Furuyashiki, H. Ishihara, Y. Shibasaki, K. Ohashi, K. Mizuno, M. Maekawa, T. Ishizaki, S. Narumiya, A critical role for a Rho-associated kinase, p160ROCK, in determining axon outgrowth in mammalian CNS neurons, Neuron 26 (2000) 431 -441.. 6.
(15) [19] S. Leuchtenberger, M.P. Kummer, T. Kukar, E. Czirr, N. Teusch, S.A. Sagi, R. Berdeaux, C.U. Pietrzik, T.B. Ladd, T.E. Golde, E.H. Koo, S. Weggen, Inhibitors of Rho -kinase modulate amyloid-β （ A β ） secretion but lack selectivity for A β 42, Journal of Neurochemistry 96 (2006) 355-365. [20] Y. Zhou, Y. Su, B. Li, F. Liu, J.W. Ryder, X. Wu, P.A. Gonzalez-Dewhitt, V. Gelfanova, J.E. Hale, P.C. May, S.M. Paul, B.. Ni,. Nonsteroidal. amyloidogenic. A β. 42. by. anti-inflammatory inhibiting. Rho,. drugs. can. lower. Science. 302. (2003). 1215-1217. [21] Z. Zhou, J. Kim, R. Insolera, X. Peng, D.J. Fink, M. Mata, Rho GTPase regulation of α -synuclein and VMAT2: implications for pathogenesis of Parkinson’ s disease, Molecular and Cellular Neuroscience 48 (2011) 29-37. [22] B.K. Mueller, H. Mack, N. Teusch, Rho kinase , a promising drug target for neurological disorders, Nature Reviews Drug D iscovery 4 (2005) 387-398.. 7.
(16) 第１章. ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 細 胞 増 殖 に 及 ぼ す 影 響. 第 1節. 緒言. マ ウ ス 胚 性 幹 （ ES） 細 胞 は 受 精 後 3.5 日 目 の 胚 盤 胞 の 内 部 細 胞 塊 由 来の細胞であり、自己複製能、多分化能、キメラ形成能といった特徴 が あ る [1、2]。さ ら に 、マ ウ ス 人 工 多 能 性 幹（ iPS）細 胞 は マ ウ ス 胚 繊 維 芽 細 胞 に 4 つ の 遺 伝 子 （ Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc ） を 導 入 す る こ と で 樹 立 さ れ 、ES 細 胞 に 類 似 し た 特 徴 を 保 持 し て い る 細 胞 で あ る [3]。 こ れ ら ES 細 胞 と iPS 細 胞 を 用 い て 、創 薬 や 再 生 医 療 分 野 に お い て 広 く 応用研究が行われている。 Watanabe ら は Rho キ ナ ー ゼ (ROCK)阻 害 剤 の １ つ で あ る Y-27632 が 、 ヒ ト ES 細 胞 の 分 散 に よ り 誘 導 さ れ る ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 す る こ と を 報 告 し た [4]。Ohgushi ら は 分 散 に よ り 起 こ る ア ポ ト ー シ ス の 分 子 メ カ ニ ズ ム を 明 ら か に し た [5、6]。こ れ ら の こ と か ら 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 す る こ と に よ っ て 、ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 分 化 を 促 進 で き る の で は な い か と 推 測 し た 。さ ら に ROCK 阻 害 剤 に は 、 リ プ ロ グ ラ ミ ン グ 効 率 の 向 上 [7、 8]、 セ ル ソ ー テ ィ ン グ 後 の 細 胞 生 存 率 の 改 善 [9]や 凍 結 保 存 し た 際 の 細 胞 生 存 率 の 改 善 [10-12]な ど が 報 告 さ れ た 。 こ れ ら の 報 告 よ り ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 培 養 に ROCK 阻 害 剤 の 添 加 が 有 効 で あ る こ と が 示 唆 さ れ る 。ま た ROCK シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に は 、 アクチン細胞骨格の制御や、様々な神経機能に寄与していることが報 告 さ れ て い る [13、 14]。 そ こ で ROCK 活 性 を 抑 制 す る こ と に よ り 、 in. vitro に お い て ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 を 促 進 で き る 可 能 性 が あ り 、新 規 の 分 化 促 進 剤 と し て 役 立 つ の で は な い か と 考 え た 。 本 章 で は 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と に よ り 、ES 細 胞 や iPS 細 胞 を. 8.
(17) 未 分 化 状 態 で 増 殖 で き る か ど う か に つ い て 検 討 し 、ROCK 阻 害 剤 を 一 定 の濃度で添加することで細胞増殖を促進できることを見出した結果に ついて述べる。. 第 2節 1.2.1. 実験方法 培地等の調製. 0.1%ゼ ラ チ ン 溶 液 ゼ ラ チ ン 粉 末（ 214340；和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ）を 0.1 mg を 99.9 mL の 蒸 留 水 に 溶 解 し た 後 、 オ ー ト ク レ ー ブ 滅 菌 （ 121℃ 、5 分 間 ） し た も の を 0.1%ゼ ラ チ ン 溶 液 と し た 。. 10×リ ン 酸 緩 衝 液 （ PBS） 蒸 留 水 に 塩 化 ナ ト リ ウ ム（ NaCl；191-01665；和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） を 80 g 、 リ ン 酸 水 素 二 ナ ト リ ウ ム ・ 12 水 和 物 （ Na 2 HPO 4 ・ 12H 2 O ； 196-02835； 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） を 27.5 g、 塩 化 カ リ ウ ム （ KCl； 163-03545； 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） を 2 g 、 リ ン 酸 二 水 素 カ リ ウ ム （ KH 2 PO 4；32379-00；関 東 化 学 株 式 会 社 ）を 2 g 溶 解 し た 後 、pH を 1N 水 酸 化 ナ ト リ ウ ム （ NaOH ； 197-02125 ； 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） 溶 液 で 7.01 に 合 わ せ 、 蒸 留 水 で 1000 mL に メ ス ア ッ プ し た 。 こ れ を オ ー ト ク レ ー ブ 滅 菌 （ 121℃ 、 15 分 間 ） し た も の を 10×PBS と し た 。 さ ら に 、 10×PBS を 蒸 留 水 で 10 倍 希 釈 し 、オ ー ト ク レ ー ブ 滅 菌（ 121℃ 、5 分 間 ） したものをプレートの洗浄に用いた。. 9.
(18) フィーダー細胞用培地 Dulbecco’ s modified Eagle medium（ DMEM；SLM-220-B；Millipore） に 15% fetal bovine serum（ FBS；16140-063；GIBCO BRL）、1％ nucleosides （ ES-008-D ； Millipore ）、 1 ％ non-essential amino acid （ NEAA ； TMS-001-C ； Millipore ）、 0.1 mM 2-mercaptoethanol （ ES-007-E ； Millipore ）、 1 ％ L-glutamine （ TMS-0020C ； Millipore ）、 1 ％ penicillin-streptomycin（ 15140； GIBCO BRL）を 添 加 し て フ ィ ー ダ ー 細胞用培地とした。. LIF 入 り の ES 細 胞 用 増 殖 培 地 ： 以 下 ES 細 胞 用 増 殖 培 地 と 記 述 Dulbecco’ s. modified. Eagle. medium. に. 15%. knockout. serum. replacement （ KSR ； 10828-028 ； GIBCO BRL ）、 1 ％ L-glutamine 、 1 ％ nucleosides、0.1 mM 2-mercaptoethanol、1％ non-essential amino acid、 1％ penicillin-streptomycin、 1000 U/mL leukemia inhibitory factor （ LIF；125-05603；和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ）を 添 加 し て ES 細 胞 用 増 殖 培 地 と し た 。 KSR に は フ ィ ー ダ ー 細 胞 が 培 養 プ レ ー ト に 接 着 す る の を 阻 害 す る 働 き が あ る た め 、フ ィ ー ダ ー 細 胞 の 培 養 時 に は 用 い な か っ た 。. LIF 入 り の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 ： 以 下 iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 と 記 述 Dulbecco’ s modified Eagle medium に 15% fetal bovine serum、 1％ L-glutamine、0.1 mM 2-mercaptoethanol、1％ non-essential amino acid、 1％ penicillin-streptomycin、 1000 U/mL leukemia inhibitory factor を 添 加 し て iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 と し た 。. 10.
(19) ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ （ AP） 染 色 用 試 薬 Alkaline Phosphatase Detection kit （ SCR0004； Millipore ） に 含 ま れ る Fast Red Violet solution と Naphthol Phosphate solution 及 び 滅 菌 水 を 直 前 に 2:1:1 の 割 合 で 混 合 し て 使 用 し た 。 AP 染 色 の 際 の 洗 浄 に は 1×rinse buffer を 使 用 し た 。 調 製 方 法 を 以 下に示す。 1×rince buffer 蒸 留 水 に 2- ア ミ ノ -2- ヒ ド ロ キ シ メ チ ル -1,3- プ ロ パ ン ジ オ ー ル （ Tris, 013-16385； 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） を 242.28 mg、 塩 化 ナ ト リ ウ ム （ NaCl； 191-01665； 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） を 876.6 mg 溶 解 し た 後 、 塩 酸 （ HCl； 080-01066； 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） で pH を 7.4 に 合 わ せ 、 Tween20（ 103168； 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） を 0.05 mL は か り と り 溶 解 し た 。そ の 後 、蒸 留 水 で 100 mL に メ ス ア ッ プ し 、オ ー ト ク レ ー ブ 滅 菌 （ 121℃ 、 15 分 間 ） し た も の を 1×rinse buffer と し た 。. 1.2.2. 培養プレートの調製. 0.1%ゼ ラ チ ン 溶 液 を 100 mmφ 組 織 培 養 デ ィ ッ シ ュ（ 430167；Corning, NY, USA） に は 5 mL ま た は 60 mmφ 組 織 培 養 デ ィ ッ シ ュ （ 353002； BD Falcon） に は 2 mL、 96 穴 組 織 培 養 プ レ ー ト （ 3860-096； Iwaki） に は 各 ウ ェ ル 50 µL 添 加 し て 、 室 温 で 1 時 間 以 上 静 置 し た 。 0.1%ゼ ラ チ ン 溶 液 を 除 去 し た 後 、 等 量 の PBS で 1 回 洗 浄 し 、 ゼ ラ チ ン コ ー ト デ ィ ッ シュとした。. 11.
(20) 1.2.3. フィーダー細胞の培養. 液 体 窒 素 中 に 保 存 し た フ ィ ー ダ ー 細 胞 （ R-PMEF-H； 初 代 マ ウ ス 胚 繊 維 芽 細 胞 、ハ イ グ ロ マ イ シ ン 耐 性 、マ イ ト マ イ シ ン 処 理 済 み；Millipore） を 取 り 出 し 、 37℃ の ウ ォ ー タ ー バ ス で 急 速 に 融 解 さ せ た 。 融 解 し た フ ィ ー ダ ー 細 胞 を 5×10 6 cells 取 り 、 フ ィ ー ダ ー 細 胞 用 培 地 を 9 mL 入 れ た 15 mL 遠 心 チ ュ ー ブ （ 1332-015S； Watoson） に 入 れ て 、 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ し て 懸 濁 し た 。 1000 rpm で 5 分 間 遠 心 分 離 し 、 上 清 液 を 除 去 し た 後 、フ ィ ー ダ ー 細 胞 用 培 地 を 1 mL 加 え 、軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ し て 分 散 さ せ た 。 9 mL の フ ィ ー ダ ー 細 胞 用 培 地 を 入 れ た ゼ ラ チ ン コ ー ト 100 mmφ デ ィ ッ シ ュ に フ ィ ー ダ ー 細 胞 を 播 種 し 、 37℃ 、 5％ CO ２ 条 件 で 24 時 間 培 養 し た 。培 養 後 、フ ィ ー ダ ー 細 胞 の デ ィ ッ シ ュ 底 へ の 接 着 を 確 認 し 、全 量 培 地 を 交 換 し た 。以 後 、3 日 間 毎 に 培 地 交 換 す る こ と で 1 週間程度フィーダー細胞の活性を維持できた。. 1.2.4. マ ウ ス ES 細 胞 の 増 殖 培 養. フ ィ ー ダ ー 細 胞 を 播 種 し た 100 mmφ デ ィ ッ シ ュ の 培 地 を 、 9 mL の ES 細 胞 用 増 殖 培 地 に 交 換 し た 。 液 体 窒 素 に 保 存 し た 未 分 化 マ ウ ス ES 細 胞（ R-CMTI-1A；129SV；継 代 数 11-12、Millipore）を 取 り 出 し 、37℃ の ウ ォ ー タ ー バ ス 中 で 急 速 に 融 解 さ せ た 。融 解 し た ES 細 胞 を 2.0×10 6 cells 取 り 、 2 mL の ES 細 胞 増 殖 用 培 地 を 入 れ た 15 mL の 遠 心 チ ュ ー ブ に 移 し 、 1 分 間 静 置 し た 。そ の 後 、 2 mL の ES 細 胞 増 殖 用 培 地 を 添 加 し て 1 分 間 静 置 し 、 さ ら に 、 4 mL の ES 細 胞 増 殖 用 培 地 を 添 加 し て 1 分 間 静 置 し た 。 ES 細 胞 懸 濁 液 を 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ 後 、 730 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し た 。 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 1 mL の ES 細 胞 用 増 殖 培 地 を 添加して軽くピペッティング後、フィーダー細胞接着培養プレートに. 12.
(21) 播 種 し 、 37℃ 、 5% CO ２ 条 件 で 培 養 し た 。 毎 日 培 地 を 全 量 交 換 し 、 細 胞 の 継 代 培 養 を 3-4 日 間 毎 に 行 っ た 。. 1.2.5. マ ウ ス ES 細 胞 の 継 代 培 養 と 凍 結 保 存. 培 養 3-4 日 目 の 対 数 増 殖 期 に あ る ES 細 胞 培 養 中 の 培 地 を 除 去 し 、PBS を 5 mL 添 加 し て ES 細 胞 を 洗 浄 し た 。 ト リ プ シ ン /EDTA 溶 液 （ SM-2003-C； Millipore） を 2 mL 添 加 し て 室 温 で 30 秒 間 反 応 さ せ た 後 、 ト リ プ シ ン /EDTA 溶 液 を 除 去 し た 。 2 分 間 静 置 し て ES 細 胞 の 剥 離 を 確 認 し 、ES 細 胞 用 増 殖 培 地 を 5 mL 添 加 し て 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ し 、 ES 細 胞 を 脱 離 さ せ た 。 15 mL 遠 心 チ ュ ー ブ に 細 胞 懸 濁 液 を 回 収 し 、 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ し て 細 胞 を 分 散 さ せ た 。 730 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し て 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 1 mL の ES 細 胞 増 殖 用 培 地 を 添 加 し 、 軽 く ピペッティングして細胞を分散させた。トリパンブルー溶液（使用前 に 0.2%ト リ パ ン ブ ル ー ： 4.25% NaCl＝ 4： 1 と な る よ う に 調 製 し た ）で ES 細 胞 を 染 色 し 、 血 球 計 数 盤 （ B0746; サ ン リ ー ド 硝 子 有 限 会 社 、 埼 玉 ）を 用 い て 1 µL 中 に 含 ま れ る 細 胞 数 に 希 釈 倍 率 を か け 、そ こ に 全 液 量をかけて計数した。そのときの計算式を以下に示す。. 生 細 胞 数 ＝ （ 4 区 画 の 生 細 胞 数 の 合 計 ÷4×10×2） ×全 液 量 （ µL）. 継 代 培 養 を 次 の よ う に 行 っ た 。 730 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し て 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 1 mL の ES 細 胞 用 増 殖 培 地 を 添 加 し て 細 胞 を 分 散 さ せ た 。 細 胞 数 を 計 数 し た 後 、 フ ィ ー ダ ー 細 胞 を 接 着 さ せ た 100 mmφ デ ィ ッ シ ュ に 0.5×10 6 cells/10 mL に な る よ う に 播 種 し 37℃ 、 5％ CO 2 条 件 で 培 養 し た 。毎 日 培 地 を 全 量 交 換 し 、継 代 培 養 を 3－ 4 日 毎 に 行 っ. 13.
(22) た。 凍 結 保 存 を 次 の よ う に 行 っ た 。 730 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し て 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 1 mL の ES 細 胞 用 増 殖 培 地 を 添 加 し て 、 ピ ペ ッ テ ィ ン グ に よ り 細 胞 を 分 散 さ せ た 。 細 胞 数 を 2×10 6 cells に 調 整 し た 細 胞 懸 濁 液 と 凍 結 保 存 培 地（ ES-0002-D；Millipore）を 1：1 と な る よ う に 混 合 し 、セ ラ ム チ ュ ー ブ（ 2732-002；Iwaki）に 加 え た 。4℃ で 5 分 間 、 － 20℃ で 30 分 間 、 － 80℃ で 24 時 間 そ れ ぞ れ 静 置 し た 後 、 液 体 窒 素 容 器内に保存した。. 1.2.6. マ ウ ス iPS 細 胞 の 増 殖 培 養. フ ィ ー ダ ー 細 胞 を 播 種 し た 100 mmφ デ ィ ッ シ ュ の 培 地 を 、 9 mL の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 に 交 換 し た 。液 体 窒 素 に 保 存 し た 未 分 化 マ ウ ス iPS 細 胞 （ iPS-MEF-Ng-20D-17； APS0001； 継 代 数 14、 RIKEN Cell Bank） を 取 り 出 し 、 37℃ の ウ ォ ー タ ー バ ス 中 で 急 速 に 融 解 さ せ た 。 融 解 し た iPS 細 胞 を 1.0×10 6 cells 取 り 、 5 mL の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 を 入 れ た 15 mL の 遠 心 チ ュ ー ブ に 入 れ た 。そ の 後 、iPS 細 胞 懸 濁 液 を 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ 後 、 1000 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し た 。 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 5 mL の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 を 添 加 し て 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ 後 、 再 度 1000 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し た 。 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 1 mL の iPS 細 胞用増殖培地を添加して軽くピペッティングして、フィーダー細胞を 接 着 さ せ た 培 養 プ レ ー ト に 播 種 し 、 37℃ 、 5% CO ２ 条 件 で 培 養 し た 。 毎 日 培 地 を 全 量 交 換 し 、 細 胞 の 継 代 培 養 を 3-4 日 間 毎 に 行 っ た 。. 14.
(23) 1.2.7. マ ウ ス iPS 細 胞 の 継 代 培 養 と 凍 結 保 存. 培 養 3-4 日 目 の 対 数 増 殖 期 に あ る iPS 細 胞 の 培 地 を 除 去 し 、PBS を 5 mL 添 加 し て iPS 細 胞 を 洗 浄 し た 。ト リ プ シ ン /EDTA 溶 液 を 2 mL 添 加 し て 37℃ で 10 分 間 反 応 さ せ た 後 、 iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 を 4 mL 添 加 し て 軽 く ピ ペ ッ テ ィ ン グ し 、15 mL 遠 心 チ ュ ー ブ に 細 胞 懸 濁 液 を 回 収 し た 。 培 養 に 使 用 し た 100 mmφ デ ィ ッ シ ュ に 再 度 4 mL の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 を 添 加 し て 、 15 mL 遠 心 チ ュ ー ブ に 細 胞 懸 濁 液 を 回 収 し た 。 730 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し て 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 2 mL の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地を添加し、軽くピペッティングして細胞を分散させた。トリパンブ ル ー 溶 液 で iPS 細 胞 を 染 色 し 、血 球 計 数 盤 を 用 い て 細 胞 数 を 計 数 し た 。 継 代 培 養 を 次 の よ う に 行 っ た 。 730 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し て 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 2 mL の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 を 添 加 し て 、 ピ ペ ッ テ ィ ングにより細胞を分散させた。細胞数を計数した後、フィーダー細胞 を 接 着 さ せ た 100 mmφ デ ィ ッ シ ュ に 1×10 6 cells/10 mL に な る よ う に 播 種 し 37℃ 、5％ CO 2 条 件 で 培 養 し た 。毎 日 培 地 を 全 量 交 換 し 継 代 培 養 を 3－ 4 日 毎 に 行 っ た 。 凍 結 保 存 を 次 の よ う に 行 っ た 。 730 rpm で 3 分 間 遠 心 分 離 し て 上 清 液 を 除 去 し た 後 、 2 mL の iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 を 添 加 し て 細 胞 を 分 散 さ せ た 。 細 胞 数 を 1×10 6 cells に 調 整 し た 細 胞 懸 濁 液 と 、 凍 結 保 存 培 地 （ DMSO（ 041-29351；和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ） ：iPS 細 胞 用 増 殖 培 地 ＝ 1： 4）を 1：1 と な る よ う に 混 合 し 、セ ラ ム チ ュ ー ブ に 加 え た 。4℃ で 5 分 間 、 － 20℃ で 30 分 間 、 － 80℃ で 24 時 間 そ れ ぞ れ 静 置 し た 後 、 液 体 窒 素容器内に保存した。. 15.
(24) 1.2.8. ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 未 分 化 状 態 の 確 認. ES 細 胞 や iPS 細 胞 は 未 分 化 状 態 で は 細 胞 膜 ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼを高レベルで発現していることが知られている。未分化状態を維持 す る た め に LIF を 含 む 培 地 で 培 養 す る が 、 未 分 化 の 状 態 を 維 持 し て い る か 、ま た ROCK 阻 害 剤 の 添 加 に よ り 未 分 化 状 態 の 維 持 に 影 響 が な い か を 調 べ る た め 、 AP 染 色 を 次 の よ う に 行 っ た 。 3-4 日 間 培 養 し た 各 細 胞 の 培 地 を 全 て 除 去 し 、 PBS で 洗 浄 後 、 4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド ・ リ ン 酸 緩 衝 液（ 163-20145；和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ）を 添 加 し て 1-2 分 間 静 置 す る こ と で 細 胞 を 固 定 し た 。 4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド ・ リ ン 酸 緩 衝 液 を 除 去 し 、 1×rince buffer で 洗 浄 し た 。 遮 光 下 で AP 染 色 用 試 薬 を 細 胞 が 浸 漬 さ れ る ま で 添 加 し 、 室 温 で 15 分 間 静 置 し た 。 AP 染 色 用 試 薬 を 除 去 し 、 乾 燥 を 避 け る た め に PBS に 細 胞 を 浸 漬 し 、 倒 立 顕 微 鏡 下 で AP 染 色 に よ り 赤 く 染 色 さ れ て い る か ど う か を 観 察 し た 。. 1.2.9. ROCK 阻 害 剤 に よ る ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 細 胞 増 殖 へ の 影 響. ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 特 徴 の 1 つ と し て 、半 永 久 的 に 増 殖 す る こ と が 可 能 で あ る こ と が あ る 。ROCK 阻 害 剤 の 添 加 に よ り 細 胞 増 殖 に 影 響 が な い か を 調 べ る た め に 、ト リ パ ン ブ ル ー 染 色 を し て 生 細 胞 数 を 計 数 し た 。 フ ィ ー ダ ー 細 胞 を 播 種 し 96 穴 組 織 培 養 プ レ ー ト に 500 cells/well と な る よ う に ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 を 播 種 し 、 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し て 37℃ 、 5% CO 2 条 件 で 培 養 し た 。 毎 日 培 地 を 全 量 交 換 し 、 培 養 2、 4、 6 日間毎にトリパンブルー染色を行い、生細胞数を計数した。. 16.
(25) 第 3節 1.3.1. 実験結果 ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 増 殖. ES 細 胞 や iPS 細 胞 は 未 分 化 状 態 を 維 持 し な が ら 、半 永 久 的 に 増 殖 す ることが可能である。しかし、継代培養を繰り返すうちに性質が変化 した細胞が現れる可能性があるため、性状が変化していないことが確 認 さ れ て い る 細 胞 を 使 用 す る 必 要 が あ る 。そ こ で ES 細 胞 の 場 合 に は 継 代 数 16-20、iPS 細 胞 の 場 合 に は 継 代 数 15-17 の 細 胞 を 実 験 に 使 用 し た 。 フ ィ ー ダ ー 細 胞 を 接 着 さ せ た 100 mmφ デ ィ ッ シ ュ に 、ES 細 胞 ま た は iPS 細 胞 を 播 種 し て 3 日 間 培 養 し た ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 を 光 学 顕 微 鏡 で 観 察 し た 結 果 を Fig.1-1（ A）（ B）及 び Fig.1-2（ A）（ B）に 示 す 。ES 細 胞 や iPS 細 胞 は 、 フ ィ ー ダ ー 細 胞 上 に コ ロ ニ ー を 形 成 し な が ら 増 殖 していた。また、未分化状態を維持した細胞は写真のように輪郭がは っ き り と し て お り 、コ ロ ニ ー 内 の 細 胞 が 明 確 に 区 別 で き ず 、AP 染 色 で 赤 く 染 ま っ た 。し か し 、Fig.1-1（ C）及 び Fig.1-2（ C）に 示 す よ う に 、 分 化 を 始 め た ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 は 赤 く 染 ま ら ず 、か つ コ ロ ニ ー 内 の 細胞が区別できるようになった。そのため、顕微鏡で観察し、コロニ ー内の細胞が区別できるディッシュは実験に用いなかった。. 1.3.2. ROCK 阻 害 剤 添 加 に よ る ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 増 殖 へ の 影 響. 未 分 化 状 態 を 維 持 し た ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 増 殖 に お け る ROCK 阻 害 剤 の 影 響 に つ い て 検 討 し た 。 ROCK 阻 害 剤 を 0-100 µM の 濃 度 で 培 地 に 添 加 し 、 37℃ 、 5% CO 2 条 件 で 3 日 間 培 養 後 、 AP 染 色 に よ り 未 分 化 状 態 が 維 持 さ れ て い る か ど う か を 検 討 し た 結 果 を Fig.1-3 及 び Fig.1-4 に 示 す 。0-20 µM の ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 、AP 染 色 に よ り 赤 く 染 ま り 、 未 分 化 状 態 を 維 持 し て い た 。 一 方 、 50-100 µM の ROCK 阻 害 剤 を. 17.
(26) 添 加 し た 場 合 、コ ロ ニ ー の 形 状 が 崩 れ 、 AP 染 色 に よ り 赤 く 染 ま ら な か った。 ROCK 阻 害 剤 を 0-40 µM の 濃 度 で 培 地 に 添 加 し 、 2-6 日 間 培 養 し た 。 培養後トリパンブルー染色を行い、血球計算盤を用いて生細胞数を計 数 し た 結 果 を Fig.1-5 及 び Fig.1-6 に 示 す 。 ES 細 胞 、 iPS 細 胞 と も に 培 養 2 日 か ら 6 日 と 培 養 す る と 細 胞 数 が 増 加 し た 。ま た 、ROCK 阻 害 剤 を 10 µM の 濃 度 で 添 加 し た 場 合 に ES 細 胞 と iPS 細 胞 と も に 増 殖 し た 細 胞数が最も多くなった。. 第 4節. 考察. ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 増 殖 に 対 す る ROCK 阻 害 剤 の 影 響 を 検 討 し た 。 5-20 µM の ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 に 、 未 分 化 状 態 を 維 持 し て い た （ Fig.1-3 及 び Fig.1-4 ）。 細 胞 数 を 計 数 し た 結 果 （ Fig.1-5 及 び Fig.1-6）、 10 µM の ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 に お い て 生 細 胞 数 を 大 き く 増 加 さ せ た 。 こ れ ら の こ と か ら 、 ROCK 阻 害 剤 は ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 増 殖 を 促 進 さ せ た 。Watanabe ら は 、ROCK 阻 害 剤 が 接 着 培 養 に お い て 、 分 散 し た ヒ ト ES 細 胞 の 生 存 を 可 能 に す る こ と を 報 告 し た [4] 。 Koyanagi ら は 、 Rho/ROCK 経 路 の 抑 制 が マ ウ ス ES 細 胞 由 来 の 神 経 前 駆 細 胞 の 生 存 を 増 強 す る こ と を 報 告 し た [15]。こ れ ら の 報 告 は ROCK 阻 害 剤が様々な細胞種のアポトーシスを抑制することで生存を可能にする こ と を 示 し て い る 。 ま た 、 Kitajima ら 及 び Pakzad ら は 、 ゼ ラ チ ン コ ートやフィブロネクチンといった細胞外マトリックスにおけるヒト多 能 性 幹 細 胞 の 接 着 の 増 強 を 報 告 し た [16、 17]。 こ れ ら の 報 告 及 び 我 々 の 研 究 結 果 か ら 、ROCK 阻 害 剤 は ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 し 、細 胞 接 着 を 増 強することにより増殖を促進していると考えられる。. 18.
(27) 第 5節. 結言. 本 研 究 に お い て 、 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し て ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 を 培 養 し た 結 果 、培 地 に ROCK 阻 害 剤 を 0-20 µM の 濃 度 で 添 加 し た 場 合 、未 分化を維持したまま培養することができるが、それ以上の濃度で添加 するとコロニーの形状が崩れ、未分化の状態を維持できないことが分 か っ た 。 さ ら に 、 10 µM の ROCK 阻 害 剤 を 培 地 に 添 加 し て 培 養 す る こ と で、細胞の増殖が促進されることを明らかにした。 以 上 の 結 果 、ROCK 阻 害 剤 に は 細 胞 増 殖 を 促 進 さ せ る 効 果 が あ る こ と が 示 さ れ た 。次 章 で は 、分 化 促 進 剤 と し て ROCK 阻 害 剤 を 用 い て 分 化 培 養 を 行 い 、ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 や 筋 肉 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼす影響について検討した結果について述べる。. 第 6節 [1]. 参考文献. M.J.. Evans,. M.H.. Kaufman,. Establishment. in. culture. of. pluripotential cells from mouse embryos, Nature 292 (1981) 154 – 156. [2] G.R. Martin, Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by te ratocarcinoma stem cells, Proceedings of the National Academy of Science USA 78 (1981) 7634–7638. [3] K. Takahashi, S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors, Cell 126 (2006) 663–676. [4] K. Watanabe, M. Ueno, D. Kamiya, A. Nishiyama, M. Matsumura, T. Wataya, J.B. Takahashi, S. Nishikawa, S. Nishikawa, K. Muguruma,. 19.
(28) Y. Sasai, A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells, Nature Biotechnology 25 (2007) 681–686. [5] M. Ohgushi, M. Matsumura, M. Eiraku, K. Murakami, T.Aramaki, A. Nishiyama, K. Muguruma, T. Nakano, H. Suga, M. Ueno, T. Ishizaki, H. Suemori, S. Narumiya, H. Niwa, Y. Sasai , Molecular pathway and Cell State Responsible for dissociation -induced apoptosis in human pluripotent stem cells, Cell Stem Cell 7 (2010) 225 -239. [6] M. Ohgushi, Y. Sasai, Lonely death dance of human pluripotent stem cells: ROCKing between metastable cell states, Trends in Cell Biology 21 (2011) 274-282. [7] L. Warren, P.D. Manos, T. Ahfeldt, Y.H. Loh, H. Li, F. Lau, W. Ebina, P.K. Mandal, Z.D. Smith, A. Meissner, G.Q. Daley, A.S. Brack, J.J. Collins, C. Cowan, T.M. Schlaeger, D.J. Rossi, Highly efficient. reprogramming. to. pluripotency. and. directed. differentiation of human cells with synthetic modified mRNA, Cell Stem Cell 7 (2010) 618-630. [8]I.H. Park, R. Zhao, J.A. West, A. Yabuuchi, H. Huo, T.A. Ince, P.H. Lerou, M.W. Lensch, G.Q. Daley, Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors, Nature 45 (2008) 141-146. [9] N. Emre, J.G. Vidal, J. Elia, E.D. O ’ Connor, R.I. Paramban, M.P. Hefferan, R. Navarro, D.S. Goldberg, N.M. Varki, M. Marsala , C.T. Carson, The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence -activated cell sorting with multiple cell surface markers, PLos One 5 ( 2010) e12148.. 20.
(29) [10] R.M. Ibanez, C. Unger, A. Stromberg, D. Baker, J.M. Canals, O. Hovatta, Novel cryopreservation method for dissociated human embryonic stem cells in the presence of a ROCK inhibitor, Human Reproduction 23 (2008) 2744-2754. [11] D.A. Claassen, M.M. Desler, A. Rizzino, ROCK inhibition enhances the recovery and growth of cryopreserved human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, Molecular Reproduction ＆ Development 76 (2009) 722-732. [12] X. Li, R. Krawetz, S. Liu, G. Meng, D.E. Rancourt, ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder -free single human embryonic stem cells, Human Reproduction 24 (2009) 580-589. [13] A. Schmandke, A. Schmandke, S.M. Strittmatter, ROCK and Rho: Biochemistry and neuronal functions of Rho-associated protein kinases, Neuroscientist 13 (2007) 454–469. [14] L. Castellani, E. Salvati, S. Alemá, G. Falcone, Fine regulation of RhoA and Rock is required for skeletal muscle differentiation, Journal of Biological Chemistry 281 (2006) 15249–15257. [15] M. Koyanagi, J. Takahashi, Y. Arakawa, D. Doi, H. Fukuda, H. Hayashi, S. Narumiya, N. Hashimoto, Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during Transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors, Journal of Neuroscience Research 86 (2008) 270-280. [16] H. Kitajima, H. Niwa, Clonal expansion of human pluripotent. 21.
(30) stem cells on gelatin-coated surface, Biochemical and Biophysical Research Communications 396 (2010) 933 -938. [17] M. Pakzad, M. Totonchi, A. Taei, A. Seifinejad, S.N. Hassani, H. Baharvand, Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder -free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging, Stem Cell Reviews and Reports (2010) 96-107.. 22.
(31) (A) Control. (B) AP staining. (C) AP staining. Fig.1-1 Optical micrographs of ES cells Scale bar: 100 µm. 23.
(32) (A) Control. (B) AP staining. (C) AP staining. Fig.1-2 Optical micrographs of iPS cells Scale bar: 100 µm. 24.
(33) 0 μM. 5 μM. 10 μM. 20 μM. 50 μM. 100 μM. Fig.1-3 Effects of ROCK inhibitor on the proliferation of undifferentiated ES cell colonies ROCK inhibitor was added to the culture medium in the range of 0-100 µM. Scale bar: 100 µm 25.
(34) 0 μM. 5 μM. 10 μM. 20 μM. 50 μM. 100 μM. Fig.1-4 Effects of ROCK inhibitor on the proliferation of undifferentiated iPS cell colonies ROCK inhibitor was added to the culture medium in the range of 0-100 µM. Scale bar: 100 µm 26.
(35) Number of cells (×104). 25 20 15 10 5 0 0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. 35. 40. ROCK inhibitor concentration (µM). 2 d of culture. 4 d of culture. 6 d of culture. Fig.1-5 Effects of ROCK inhibitor on the proliferation of ES cells. 27.
(36) Number of cells (×104). 80 70 60 50. 40 30 20 10 0 0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. ROCK inhibitor concentration (µM). 2 d of culture. 4 d of culture. 6 d of culture. Fig.1-6 Effects of ROCK inhibitor on the proliferation of iPS cells. 28.
(37) 第 2章. ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 分 化 に 及 ぼ す 影 響. 第 1節. 緒言. 第 1 章 で は 、増 殖 培 養 時 に 低 濃 度 の ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と に よ り、未分化状態を維持したまま効率良く増殖させることができること を 明 ら か に し た 。本 研 究 で 用 い た ROCK 阻 害 剤 Y-27632 は 、最 初 に 血 管 平 滑 筋 弛 緩 薬 と し て 合 成 さ れ た 化 合 物 で あ る [1]。そ の 後 の 研 究 に よ り 、 細胞遊走、アクチン細胞骨格やアポトーシスなど様々な細胞機能に関 わ っ て い る こ と が 報 告 さ れ た [2、 3]。 ま た 、 高 血 圧 の モ デ ル ラ ッ ト に おいて血圧を下げる効果があることや、血管攣縮に関連するくも膜下 出 血 に 対 す る 有 効 性 な ど も 報 告 さ れ て い る [4、 5]。 さ ら に Fasudil と い う ROCK 阻 害 剤 は 、眼 圧 を 下 げ る こ と で 緑 内 障 の 治 療 薬 と し て 使 わ れ て い る 。こ れ ら の こ と か ら 、ROCK 阻 害 剤 は 人 体 に 適 用 し や す い と 考 え ら れ 、分 化 促 進 剤 と し て ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 分 化 を 促 進 さ せ る 効 果 が あった場合、再生医療分野、とくに神経再生や移植治療などに用いる 細胞を作成する際に利用できる可能性が期待できる。 Hirose ら 及 び Bito ら は 、 神 経 芽 細 胞 種 N1E-115 細 胞 や 中 枢 神 経 系 の 神 経 細 胞 に お い て Rho/ROCK シ グ ナ ル 伝 達 経 路 が 軸 索 の 退 縮 に 関 わ っ て お り 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で そ の 作 用 が 抑 制 さ れ る こ と を 報 告 し た [6、7]。こ れ ら の 報 告 か ら 、 ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 分 化 培 養 時 に ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 、神 経 細 胞 へ の 分 化 を 促 進 さ せ る 可 能 性が示唆される。 本 章 に お い て 、分 化 培 養 時 に ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と に よ る 、ES 細 胞 や iPS 細 胞 の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し 、ROCK 阻 害 剤 が 神 経細胞と筋肉細胞への分化を促進させる効果を有することを見出した. 29.
(38) 結果について述べる。. 第 2節 2.2.1. 実験方法 培地等の調製. 0.1%ゼ ラ チ ン 溶 液 第 1 章 1.2.1 に 記 述 し た よ う に 調 製 し た 。. 分化用培地 49% Dulbecco’ s modified Eagle medium に 49% F-12K nutrient mixture（ 21127-022；GIBCO BRL）、1% N-2 supplement（ 17502-048; GIBCO BRL）、 1% penicillin-streptomycin を 添 加 し て 分 化 用 培 地 と し た 。. 2.2.2. 培養プレートの調製. 0.1%ゼ ラ チ ン 溶 液 を 用 い て 、 第 1 章 1.2.2 項 に 記 述 し た よ う に ゼ ラ チ ン コ ー ト 96 穴 組 織 培 養 プ レ ー ト を 調 製 し た 。. 2.2.3 マ ウ ス ES 細 胞 の 浮 遊 培 養 第 1 章 に 記 述 し た よ う に 、ES 細 胞 を フ ィ ー ダ ー 細 胞 上 で 3-4 日 間 培 養 し 、 継 代 培 養 を 行 っ た 。 細 胞 数 を 計 数 後 、 ES 細 胞 （ 5×10 5 cells） を 非 接 着 性 100 mmφ デ ィ ッ シ ュ （ AU3100； 栄 研 化 学 株 式 会 社 ） に 播 種 し 、ES 細 胞 用 増 殖 培 地 を 加 え て 全 量 を 10 mL に し た も の を 37℃ 、5% CO 2 条 件 で 8-9 日 間 培 養 し た 。3 日 毎 に 半 分 量 の 培 地 を 交 換 し 、直 径 200 µm の ES 細 胞 コ ロ ニ ー を 形 成 さ せ た 。 浮遊培養の際に、播種する細胞数が多すぎるとコロニー同士が接着 して直径が大きなコロニーが多数形成され、細胞数が少なすぎると長. 30.
(39) 期培養してもコロニーが殆ど形成されない。. 2.2.4 マ ウ ス iPS 細 胞 の 浮 遊 培 養 2.2.3 項 に 記 述 し た ES 細 胞 の 場 合 と 同 様 に 、浮 遊 培 養 に よ り 直 径 200 µm の iPS 細 胞 コ ロ ニ ー を 形 成 さ せ た 。な お 、培 養 期 間 を 6-7 日 間 と し 、 3 日毎に半分量の培地を交換した。. 2.2.5 浮 遊 培 養 で 形 成 さ れ た 細 胞 コ ロ ニ ー の 未 分 化 状 態 の 確 認 直 径 200 µm の 細 胞 コ ロ ニ ー を 実 体 顕 微 鏡 下 で 観 察 し な が ら ピ ペ ッ ト マ ン を 用 い て 採 取 し 、2 mL の PBS を 入 れ た 35 mmφ デ ィ ッ シ ュ（ 430165； CORNING） に 入 れ て 洗 浄 し た 。 PBS を 除 去 し 、 1.2.8 項 で 記 述 し た よ う に AP 染 色 を 行 い 、浮 遊 培 養 に よ り 形 成 さ れ た 細 胞 コ ロ ニ ー が 未 分 化 状 態を維持しているかどうかを調べた。. 2.2.6. 細胞コロニーの分化培養. ES 細 胞 、iPS 細 胞 と も に 浮 遊 培 養 す る こ と で 得 ら れ た 直 径 200 µm の 細胞コロニーを、実体顕微鏡下でピペットマンを用いて採取し、ゼラ チ ン コ ー ト 96 穴 組 織 培 養 プ レ ー ト の 1 ウ ェ ル あ た り 1 個 の コ ロ ニ ー を 播 種 し た 。 培 養 開 始 時 に 、 分 化 用 培 地 に ROCK 阻 害 剤 ま た は ROCK 阻 害 剤 と 10 ng/mL の 神 経 成 長 因 子 （ Recombinant Human β -NGF ： 256-GF-100/CF； R&D Systems, Inc.） を 添 加 し て 、 37℃ 、 5% CO 2 条 件 で 12 日 間 培 養 し た 。3 日 毎 に 半 分 量 の 培 地 を 交 換 し た 。ROCK 阻 害 剤 の 添 加 濃 度 の 検 討 に は 、分 化 用 培 地 に ROCK 阻 害 剤 を 0、5、10、20、50 µM になるように添加して培養した。. 31.
(40) 2.2.7. 免疫蛍光染色法. 細 胞 を 分 化 培 養 し た 96 穴 組 織 培 養 プ レ ー ト の 各 ウ ェ ル か ら 培 地 を 少 し 残 し て 除 去 し 、 細 胞 を 冷 PBS で 3 回 洗 浄 し た 後 、 4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド・リ ン 酸 緩 衝 液 を 用 い て 、室 温 で 30 分 間 反 応 さ せ て 固 定 し た 。 冷 PBS で 3 回 洗 浄 後 、細 胞 を 99.8%の 冷 メ タ ノ ー ル （ 131-01826； 和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 ）を 用 い て － 80℃ で 15 分 間 処 理 し た 。冷 PBS で 3 回 洗 浄 し た 後 、 5% bovine serum albumin（ BSA； 019-21272； Wako） を 含 む 0.5% Ttiton X-100 溶 液 で ブ ロ ッ キ ン グ し た 。 1 次 抗 体 を サ ン プ ル に 加 え 、 4℃ で 一 晩 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 1 次 抗 体 に は 、 250 倍 希 釈 し た 神 経 細 胞 の マ ー カ ー で あ る 抗 β Ⅲ -tubulin 抗 体 （ MAB1637 ； Millipore）、 500 倍 希 釈 し た 運 動 神 経 細 胞 の マ ー カ ー で あ る 抗 Lim-3 抗 体 （ AB3202； Millipore）、 500 倍 希 釈 し た 感 覚 神 経 細 胞 の マ ー カ ー で あ る 抗 Brn-3 抗 体（ sc-6026；Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）、 500 倍 希 釈 し た 筋 肉 細 胞 の マ ー カ ー で あ る 抗 α -actinin 抗 体 （ sc-7453； Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ）、 250 倍 希 釈 し た 平 滑 筋 細 胞 マ ー カ ー で あ る 抗 α -smooth muscle 抗 体 （ A5228； Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA ）、 250 倍 希 釈 し た 心 筋 細 胞 マ ー カ ー で あ る 抗 cardiac troponin I 抗 体 （ ab47003 ； Abcam, Cambridge, UK）、 250 倍 希 釈 し た 骨 格 筋 細 胞 マ ー カ ー で あ る 抗 actinα -1 抗 体 （ C0121； Assay Biotechnology, Sunnyvale, CA, USA ） を 使 用 し た 。 1 次 抗 体 を 除 去 し 、 冷 PBS で 3 回 洗 浄 し た 後 、 Alexa Fluor 488-labeled 2 次 抗 体（ A-11005 or A-11008；Molecular Probes, Eugene, OR, USA） を 用 い て 、 振 盪 し な が ら 室 温 で 30 分 間 蛍 光 標 識 し た 。 2 次 抗 体 を 除 去 し 、 冷 PBS で 3 回 洗 浄 し た 後 、 フ ル オ ロ ・ イ メ ー ジ ア ナ ラ イ ザ ー （ FLA-3000GF; 富 士 フ ィ ル ム 株 式 会 社 、 東 京 ） を 用 い て パ ソ コ. 32.
(41) ンに蛍光イメージを取り込み、画像解析ソフトにより蛍光強度を解析 し、各細胞への分化率を求めた。. 2.2.8. フローサイトメトリーによる陽性細胞数の計数. 分 化 培 養 し た 細 胞 を 冷 PBS で 3 回 洗 浄 し た 後 、 ト リ プ シ ン /EDTA 溶 液を添加して室温で 2 分間インキュベートした。血清入りの培地を添 加 し て ト リ プ シ ン /EDTA の 働 き を 止 め た 。15 mL 遠 心 チ ュ ー ブ に 細 胞 を 移 し 、 800 rpm、 5 分 間 遠 心 分 離 し た 。 冷 PBS で 細 胞 を 洗 浄 し 、 1.5 mL エッペンチューブに細胞を移した。ピペッティングにより細胞コロニ ー を 分 散 さ せ 、 4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド ・ リ ン 酸 緩 衝 液 を 用 い て 、 室 温 で 30 分 間 反 応 さ せ て 固 定 し た 。 1200 rpm、 5 分 間 遠 心 分 離 し た 後 、 冷 PBS で 洗 浄 し た 。 1200 rpm、 5 分 間 遠 心 分 離 し た 後 、 細 胞 を 99.8% の 冷 メ タ ノ ー ル を 用 い て － 80℃ で 15 分 間 処 理 し た 。 1200 rpm、 5 分 間 遠 心 分 離 し た 後 、冷 PBS で 洗 浄 し た 。1 次 抗 体 を 加 え 4℃ で 一 晩 反 応 さ せ た 。冷 PBS で 3 回 洗 浄 し た 後 、2 次 抗 体 を 加 え 室 温 で 30 分 間 蛍 光 標 識 し た 。 冷 PBS で 4 回 洗 浄 後 、 フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー （ JSAN ； Bay Bio-science, Kobe, Japan） を 用 い て 陽 性 細 胞 数 を 計 数 し た 。. 2.2.9. 統計分析. 測 定 値 を 平 均 値 ±標 準 誤 差 で 示 し た 。 各 デ ー タ を 多 重 比 較 法 の 一 次 元 配 置 分 散 分 析 （ one-way ANOVA） に お け る Tukey-Kramer test を 用 い て 検 定 し 、 p<0.05 の と き 統 計 学 的 に 有 意 で あ る と 判 断 し た 。. 33.
(42) 第 3節 2.3.1. 実験結果 ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 コ ロ ニ ー の 未 分 化 状 態 の 確 認. 5×10 5 cells の 未 分 化 マ ウ ス ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 を 、非 接 着 性 100 mm φ デ ィ ッ シ ュ に 増 殖 用 培 地 を 用 い て 浮 遊 培 養 し 、直 径 200 µm の 細 胞 コ ロ ニ ー を 形 成 さ せ た 。浮 遊 培 養 中 の デ ィ ッ シ ュ に は 、直 径 400 µm 以 上 のもの、コロニー同士が接着しているものやコロニー内の細胞 が詰ま っていないものが混在していた。以前の研究で、コロニー内の細胞が 詰 ま っ て い な い も の は 分 化 能 が 悪 く 、直 径 が 400 µm 以 上 の も の は 分 化 を始めているコロニーである可能性があることが明らかになっている [8]。 そ こ で 本 研 究 に は 直 径 200 µm で 、 か つ コ ロ ニ ー 内 の 細 胞 が 詰 ま っ て い る コ ロ ニ ー を 用 い た 。Fig.2-1（ 1）及 び（ 2）に 示 す 直 径 200 µm の 細 胞 コ ロ ニ ー は AP 染 色 に よ り 赤 く 染 ま っ て い た こ と か ら 、未 分 化 状 態を維持できていた。 分 化 培 養 す る 際 に 一 部 の 細 胞 コ ロ ニ ー を AP 染 色 し 、未 分 化 状 態 を 維 持しているかどうかを確認してから使用した。. 2.3.2. ROCK 阻 害 剤 添 加 に よ る 神 経 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す 影 響. ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し た 。浮 遊 培 養 を 行 い 、直 径 200 µm の 細 胞 コ ロ ニ ー を 形 成 さ せ た 後 、96 穴 組 織 培 養 プ レ ー ト に 播 種 し た 。ROCK 阻 害 剤 ま た は ROCK 阻 害 剤 と NGF（ 10 ng/mL） を 同 時 に 添 加 し て 12 日 間 分 化 培 養 し、フルオロ・イメージアナライザーを用いて神経細胞のマーカーで あ る β Ⅲ -tubulin の 蛍 光 強 度 を 測 定 し た 。ES 細 胞 の 結 果 を Fig.2-2（ A） に 、 iPS 細 胞 の 結 果 を Fig.2-3 に 示 す 。 ROCK 阻 害 剤 や NGF を 添 加 せ ず に 培 養 し た ES 細 胞 と iPS 細 胞 コ ロ ニ ー の 蛍 光 強 度 を 100％ と し た 。ROCK. 34.
(43) 阻害剤を添加した場合の蛍光強度は、無添加の場合の蛍光強度より高 い と い う 結 果 が 得 ら れ た 。さ ら に 、ROCK 阻 害 剤 と 同 時 に NGF を 添 加 し た 場 合 の 蛍 光 強 度 は 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 の 蛍 光 強 度 よ り 高 く 、 神 経 細 胞 へ の 分 化 促 進 効 果 が 増 大 し た 。ES 細 胞 、iPS 細 胞 と も に 20 µM の ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 に 最 も 神 経 細 胞 へ の 分 化 が 促 進 さ れ た こ と か ら 、こ れ 以 降 の 分 化 培 養 に は 20 µM の ROCK 阻 害 剤 を 用 い た 。蛍 光 顕 微 鏡 を 用 い て ES 細 胞 由 来 の 神 経 細 胞 を 観 察 し た 結 果 を Fig.2-2（ B） に 示 す 。コ ン ト ロ ー ル と 比 較 し て 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 神 経 突 起 の 数 が 増 加 し て お り 、 NGF を 同 時 に 添 加 す る こ と で さ ら に 増 加 し た。 ROCK 阻 害 剤 の 分 化 促 進 効 果 が 、ア ポ ト ー シ ス を 抑 制 し た こ と で 、生 細 胞 数 が 増 加 し た 結 果 に よ る も の か ど う か に つ い て 検 討 し た 。ROCK 阻 害 剤 ま た は ROCK 阻 害 剤 と NGF を 同 時 に 添 加 し て 12 日 間 分 化 培 養 を 行 い 、生 細 胞 数 を 計 数 し た 結 果 を Fig.2-4 に 示 す 。ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 、ROCK 阻 害 剤 と NGF を 同 時 に 添 加 し た 場 合 と も に 、コ ン ト ロ ー ル に 比 較 し て 細 胞 数 に 大 き な 差 は 見 ら れ な か っ た 。 こ れ よ り 、ROCK 阻 害剤は生細胞のアポトーシスを抑制して、分化した細胞数を増加させ る の で は な く 、 ROCK 阻 害 剤 に は ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分化を促進させる効果があると考えられる。 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 、ど の 程 度 の 割 合 で 神 経 細 胞 に 分 化 し て い る か に つ い て 検 討 し た 。12 日 間 分 化 培 養 を 行 っ た ES 細 胞 及 び iPS 細胞コロニーを免疫蛍光染色し、フローサイトメーターを用いて陽性 細 胞 数 を 計 数 し た 。 ES 細 胞 の 結 果 を Fig.2-5 に 、 iPS 細 胞 の 結 果 を Fig.2-6 に 示 す 。 ES 細 胞 の 場 合 、 分 化 用 培 地 で 培 養 す る と 44%が 神 経 細 胞 に 分 化 し た 。 さ ら に 、 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 に は 61%、 ROCK. 35.
(44) 阻 害 剤 と NGF を 同 時 に 添 加 し た 場 合 に は 71%が 神 経 細 胞 に 分 化 し た 。 こ の と き 、ROCK 阻 害 剤 や NGF を 添 加 せ ず に 培 養 し た コ ン ト ロ ー ル に 対 し て 統 計 処 理 し た と こ ろ 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 に p <0.05、ROCK 阻 害 剤 と NGF を 添 加 し た 場 合 に p <0.01 で 統 計 的 に 有 意 差 が あ る こ と が 示 さ れ た 。iPS 細 胞 の 場 合 、分 化 用 培 地 で 培 養 す る と 25%が 神 経 細 胞 に 分 化 し た 。ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 に は 34%、ROCK 阻 害 剤 と NGF を 同 時 に 添 加 し た 場 合 に は 38%が 神 経 細 胞 に 分 化 し た 。 こ の と き 、 ROCK 阻 害 剤 や NGF を 添 加 せ ず に 培 養 し た コ ン ト ロ ー ル に 対 し て 統 計 処 理 し た と こ ろ 、 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 及 び ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 と も に p <0.05 で 統 計 的 に 有 意 差 が あ る こ と が 示 さ れ た 。ま た 、フ ル オロ・イメージアナライザーによる蛍光強度の結果と、フローサイト メーターによる分化した神経細胞の割合の結果が一致した。. 2.3.3. 分化した神経細胞の種類の同定. ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 が 促 進 さ れ る と い う 結 果 が 得 ら れ た こ と か ら 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し て 分 化 し た 神 経 細 胞 の 種 類 に つ い て 検 討 し た 。 以 前 の 研 究 で は 、 ES 細 胞 は 主 に 運 動 神 経 細 胞 及 び 感 覚 神 経 細 胞 に 分 化 し て い た [9]。 12 日 間 分 化 培 養 し た ES 細 胞 を 、運 動 神 経 細 胞 の マ ー カ ー で あ る Lim-3 と 感 覚 神 経 細 胞 マ ー カ ー で あ る Brn-3 で 標 識 し 、 フ ル オ ロ ・ イ メ ー ジ ア ナ ラ イ ザ ー を 用 い て 蛍 光 強 度 を 測 定 し た 結 果 を Fig.2-7 に 示 す 。ROCK 阻 害 剤 や NGF を 添 加 せ ず に 培 養 し た ES 細 胞 コ ロ ニ ー の 蛍 光 強 度 を 100％ と し た 。運 動 神 経 細 胞 及 び 感 覚 神 経 細 胞 と も に ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 蛍 光 強 度 が 高 く な っ た 。し か し 、 ROCK 阻 害 剤 と 同 時 に NGF を 添 加した場合、蛍光強度の増加は見られなかった。. 36.
(45) ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 、ど の 程 度 の 割 合 で 各 神 経 細 胞 に 分 化 し て い る か に つ い て 検 討 し た 。 12 日 間 分 化 培 養 を 行 っ た ES 細 胞 コ ロ ニーを免疫蛍光染色し、フローサイトメーターを用いて各種陽性細胞 数 を 計 数 し た 結 果 を Fig.2-8（ A）に 示 す 。ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 運 動 神 経 細 胞 （ 抗 Lim-3 抗 体 に よ り 染 色 さ れ た 細 胞 ） が 28%、 感 覚 神 経 細 胞 （ 抗 Brn-3 抗 体 に よ り 染 色 さ れ た 細 胞 ） が 24%と い う 結 果 が 得 ら れ た 。 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 61%が 神 経 細 胞 に 分 化 し て い た こ と か ら 、分 化 し た 神 経 細 胞 の 内 約 50%が 運 動 神 経 細 胞 、約 40%が 感 覚神経細胞に分化していることが明らかになり、この結果はフルオ ロ・イメージアナライザーで測定した蛍光強度の結果と一致した。ま た 、 蛍 光 顕 微 鏡 観 察 の 結 果 を Fig.2-8（ B） に 示 す 。 蛍 光 写 真 か ら も 、 感覚神経細胞より運動神経細胞に多く分化している様子が観察できた。. 2.3.4. ROCK 阻 害 剤 添 加 に よ る 筋 肉 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す 影 響. こ れ ま で の 研 究 で 、ES 細 胞 や iPS 細 胞 は 神 経 細 胞 以 外 に 筋 肉 細 胞 に も 分 化 す る こ と が 明 ら か に な っ て い る [10]。ま た 、ROCK は Rho フ ァ ミ リーによるアクチン細胞骨格のコントロールなど、様々な細胞応答に 関 わ っ て い る こ と が 明 ら か に な っ て い る [3]。こ れ ら の こ と か ら 、ROCK 阻害剤の添加は神経細胞以外に筋肉細胞への分化も促進している可能 性 が 示 唆 さ れ る 。 そ こ で 、 ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 筋 肉 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し た 。12 日 間 分 化 培 養 を 行 い 、 筋 肉 細 胞 の マ ー カ ー で あ る 抗 α -actinin 抗 体 で 標 識 し 、フ ル オ ロ ・ イ メ ー ジ ア ナ ラ イ ザ ー を 用 い て 蛍 光 強 度 を 測 定 し た 。 ES 細 胞 の 結 果 を Fig.2-9（ A）に 、iPS 細 胞 の 結 果 を Fig.2-10 に 示 す 。ROCK 阻 害 剤 及 び NGF を 添 加 せ ず に 培 養 し た 場 合 の 蛍 光 強 度 を 100%と し た 。ES 細 胞 と iPS. 37.
(46) 細 胞 と も に 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 蛍 光 強 度 が 高 く な っ た 。一 方 、ROCK 阻 害 剤 と NGF を 同 時 に 添 加 し た 場 合 、ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 に 比 較 し て 蛍 光 強 度 は 低 く な っ た 。 こ れ は 、 NGF を 添 加 す る こ と で神経細胞への分化が促進されたためであると考えられる。また、蛍 光 顕 微 鏡 観 察 の 結 果 を Fig.2-9（ B）に 示 す 。蛍 光 写 真 か ら も 、ROCK 阻 害剤を添加することで筋肉細胞に多く分化している様子が観察できた。 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 、ど の 程 度 の 割 合 で 筋 肉 細 胞 に 分 化 し て い る か に つ い て 検 討 し た 。 12 日 間 分 化 培 養 を 行 っ た ES 細 胞 コ ロ ニ ーを免疫蛍光染色し、フローサイトメーターを用いて陽性細胞数を計 数 し た 結 果 を Fig.2-11 に 示 す 。 ROCK 阻 害 剤 及 び NGF を 添 加 せ ず に 培 養 し た 場 合 、 16%が 筋 肉 細 胞 に 分 化 し た 。 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し た 場 合 に 28%、 ROCK 阻 害 剤 と 同 時 に NGF を 添 加 す る こ と で 18%が 筋 肉 細 胞 に 分化した。この結果は、フルオロ・イメージアナライザーで測定した 蛍光強度の結果と一致した。. 2.3.5. 分化した筋肉細胞の種類の同定. ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し て 分 化 し た 筋 肉 細 胞 の 種 類 に つ い て 検 討 し た 。 12 日 間 分 化 培 養 し た ES 細 胞 を 、 平 滑 筋 細 胞 の マ ー カ ー で あ る α -smooth muscle の 抗 体 、 心 筋 細 胞 の マ ー カ ー で あ る cardiac troponin I の 抗 体 や 骨 格 筋 細 胞 マ ー カ ー で あ る actin-α -1 の 抗 体 で 標 識 し 、フ ルオロ・イメージアナライザーを用いて蛍光強度を測定した結果を Fig.2-12 に 示 す 。 ROCK 阻 害 剤 及 び NGF を 添 加 せ ず に 培 養 し た ES 細 胞 コ ロ ニ ー の 蛍 光 強 度 を 100％ と し た 。平 滑 筋 細 胞 で は ROCK 阻 害 剤 を 添 加しても蛍光強度はほとんど変らず、心筋細胞及び骨格筋細胞におい て ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 蛍 光 強 度 が 高 く な っ た 。. 38.
(47) 第 4節. 考察. 浮 遊 培 養 に よ り 得 ら れ た 直 径 200 µm の 細 胞 コ ロ ニ ー を AP 染 色 し た 結 果 （ Fig.2-1）、 赤 く 染 ま っ た こ と か ら 未 分 化 状 態 を 維 持 し て い た 。 Osakada ら は 、ヒ ト 多 能 性 幹 細 胞 を ROCK 阻 害 剤 で 処 理 す る こ と で 、胚 様 体 の 形 成 が 促 進 さ れ る こ と を 報 告 し た [11]。 こ の こ と か ら 、 浮 遊 培 養 時 に ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 、細 胞 コ ロ ニ ー の 形 成 が 改 善 さ れ る可能性が考えられる。 ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 神 経 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し た 。 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し て 12 日 間 分 化 培 養 し た 結 果 （ Fig.2-2 及 び Fig.2-4）、 20-50 µM の ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で ES 細 胞 、iPS 細 胞 と も に 神 経 細 胞 へ の 分 化 が 促 進 し た 。さ ら に 、 20 µM の ROCK 阻 害 剤 と NGF を 同 時 に 添 加 す る こ と で 、 よ り 神 経 細 胞 へ の 分化が促進した。他の研究者たちが、骨髄由来間葉系幹細胞、胎盤由 来 の 多 能 性 細 胞 、脂 肪 組 織 由 来 幹 細 胞 、マ ウ ス 神 経 幹 細 胞 、マ ウ ス ES 細 胞 に お け る ROCK 阻 害 剤 の 影 響 に つ い て 報 告 し た [12-16] 。 ま た Minase ら は 、低 濃 度 の NGF で 処 理 し た PC12 細 胞 に ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 、 神 経 突 起 伸 長 が 促 進 さ れ る こ と を 報 告 し た [17]。 こ れ ら の 報 告 及 び 我 々 の 研 究 結 果 か ら 、 ROCK 阻 害 剤 は ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 から神経細胞へ分化させる際の分化促進剤として有用であると考えら れる。 ま た 、 ROCK 阻 害 剤 が ES 細 胞 や iPS 細 胞 か ら 筋 肉 細 胞 へ の 分 化 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し た 。 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 し て 12 日 間 分 化 培 養 し た 結 果 （ Fig.2-9 及 び Fig.2-10）、 ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 筋 肉 細 胞 へ の 分 化 が 促 進 さ れ た 。 Krawetz ら は 、 胚 性 癌 細 胞 の P19 細 胞 を ROCK 阻 害 剤 で 処 理 す る こ と で 、外 胚 葉 及 び 中 胚 葉 系 の 細 胞 へ の 分 化. 39.
(48) を 増 強 す る こ と を 報 告 し た [18]。こ れ ら の こ と か ら 、ROCK 阻 害 剤 は 神 経細胞への分化だけでなく、筋肉細胞への分化も促進させる効果があ ると考えられる。. 第 5節. 結言. ES 細 胞 及 び iPS 細 胞 の 分 化 培 養 時 に ROCK 阻 害 剤 を 添 加 す る こ と で 、 神経細胞と筋肉細胞への分化を促進させる効果があることを見出した。 さ ら に 、ROCK 阻 害 剤 と 同 時 に NGF を 添 加 す る こ と で 、相 乗 効 果 に よ り 神経細胞への分化が促進されることを見出した。また、分化した神経 細胞と筋肉細胞の割合を比較すると、神経細胞に多く分化しているこ とを明らかにした。 以 上 の こ と か ら 、 ROCK 阻 害 剤 は ES 細 胞 や iPS 細 胞 を 分 化 さ せ る 際 の 分 化 促 進 剤 と し て 有 効 で あ る こ と が 示 唆 さ れ る 。 次 章 で は 、ROCK 阻 害剤を添加することで、どのようなシグナル伝達経路を活性化させて 神経細胞への分化を促進させるかについて検討した結果について述べ る。. 第 6節. 参考文献. [1] 石 崎 敏 理 , Rho 情 報 伝 達 と そ の 生 理 的 意 義 , 日 薬 理 誌 , 121 （ 2003） 153-162. [2] K. Watanabe, M. Ueno, D. Kamiya, A. Nishiyama, M. Matsumura, T. Wataya, J.B. Takahashi, S. Nishi kawa, S. Nishikawa, K. Muguruma, Y. Sasai, A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells, Nature Biotechnology 25 (2007) 681–686. [3] L. Castellani, E. Salvati, S. Alemá, G. Falcone, Fine. 40.
(49) regulation of RhoA and Rock is required for skeletal muscle differentiation, Journal of Biological Chemistry 281 (2006) 15249–15257. [4] M. Uehata, T. Ishizaki, H. Satoh, T. Ono, T. Kawahara, T. Morishita, H. Tamakawa, K. Yamagami, J. Inui, M. Maekawa, S. Narumiya, Calciumsensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension, Nature 389 (1997) 990-994. [5] M.F. Olson, Applications for ROCK kinase inhibitor, Current Opinion in Cell Biology 20 (2008) 242-248. [6] M. Hirose, T. Ishizaki, N. Watanabe, M. Uehata, O. Kranenburg, W.H. Moolenaar, F. Matsumura, M. Maekawa, H. Bito, S. Narumiya, Molecular. dissection. of. the. Rho -associated. protein. kinase. (p160ROCK)-regulated neurite remodeling in neuroblastoma N1E-115 cells, Jounal of Cell Biology 141 (1998) 1625-1636. [7] H. Bito, T. Furuyashiki, H. Ishihara, Y. Shibasaki, K. Ohashi, K. Mizuno, M. Maekawa, T. Ishizaki, S. Narumiya, A critical role for a Rho-associated kinase, p160ROCK, in determining axon outgrowth in mammalian CNS neurons, Neuron 26 (2000) 431-441. [8] 北 澤 彩 子. 東洋大学大学院生命科学研究科生命科学専攻, 博士論. 文 , (平 成 19 年 度 ). [9] A. Kitazawa, N. Shimizu, Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into neurons using conditioned medium of dorsal root ganglia, New Biotechnology 28 (2011) 326 -333. [10] 原 優 里 菜. 東洋大学大学院生命科学研究科生命科学専攻, 修士. 41.
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