マボヤの被嚢に含まれるセルロースからのL-乳酸の生産

．緒

言

宮城県ではホヤの一種であるマボヤ（ ）の養殖が盛んである．農林水産省の統計調査 によると，令和元年の宮城県でのホヤ類の収穫量は ， トンとなっており）_{，食用とされているホヤ類} が主としてマボヤであることから），収穫量の大部分 はマボヤであると考えられる．マボヤは，体の表面を 覆う被嚢部分を除いた中身が食され，被嚢部分は廃棄 されるため，マボヤの被嚢は未利用バイオマス資源と して利活用できる可能性を有している． ホヤ類はセルロースを生合成できる唯一の動物であ る，）．生合成されたセルロースは被嚢に存在してお り）_{， マボヤの被嚢にもセルロースが存在している}）_． そのため，マボヤの被嚢の利活用方法として，被嚢に 含まれるセルロースを利用する方法が考えられる．実 際に，ホヤ類の被嚢に含まれるセルロースから様々な セルロース材料を調製する研究が報告されており，マ ボヤの被嚢から酢酸セルロース）が，カタユウレイボ ヤ（ ）の被嚢からセルロースナノファ イ バ ー）や セ ル ロ ー ス ナ ノ 結 晶）が，他 の ホ ヤ 類 （ ）の被嚢からセルロースナノ ウィスカー）が調製されている．これらは，近年注目 されているセルロース材料であり，マボヤの被嚢の利 活用に応用可能ではあるものの，用途としては特定の 材料としての利用に限られてしまう．そのため，セル ロース材料としての利活用方法に加えて，幅広い用途 に対応可能なマボヤの被嚢の利活用方法の検討も必要 と考えた． セルロースは，バイオリファイナリープロセスによ り有機酸やアルコールなどの様々な化合物に変換する ことも可能であり，得られた化合物は，燃料や化学品 として幅広い用途に利用できる ）．セルロースのバイ オリファイナリーでは，セルロースが加水分解される ことでグルコースが生成し，生成したグルコースは微 生物の発酵により目的の化合物に変換されるため，発 酵微生物の種類や，その代謝経路を変えるだけで生産 する化合物を変えることができる．マボヤの被嚢も， セルロースのバイオリファイナリーにより有機酸やア ルコールに変換できれば，幅広い用途に利活用できる ことが期待される．さらに，陸上植物の場合，酵素に よるセルロースの加水分解を妨害するリグニンが細胞 壁に多く含まれるが，動物であるホヤ類は細胞壁を持 たないため，その被嚢にはリグニンが含まれていない 年 月 日受付， 年 月 日受理 ＊宮城大学食産業学群 Mitsunori YANAGISAWA

研究ノート

マボヤ

の

被嚢

に

含

まれる

セルロース

からの

L

―

乳酸

の

生産

柳 澤 満 則

＊ 要 旨 廃棄物であるマボヤの被嚢に含まれるセルロースから生分解性プラスチックの原料となる L―_{乳酸の生産} を試みた．マボヤ被嚢粉末をセルラーゼで分解することで，イナワラ粉末やタケ粉末よりも高いセルロー ス変換率でセルロースを分解可能であることを確かめた．また，環境負荷やエネルギー消費を抑えた前処 理と同時糖化発酵を組み合わせることにより，マボヤ被嚢粉末から ． g/L の L―_{乳酸を生産することに成} 功した． キーワード：マボヤ，被嚢，セルロース，L―乳酸，同時糖化発酵 ３４ 環 境 技 術 ―１５０―

と考えられる．そのため，マボヤの被嚢からは，環境 負荷やエネルギー消費が大きい条件での前処理を施さ なくても，高効率で目的化合物を生産できることが予 想される． しかしながら，ホヤ類の被嚢のバイオリファイナ リーとしては，カタユウレイボヤの被嚢に含まれるセ ルロースからエタノールを生産した研究が報告されて いるのみであり ）_{，マボヤの被嚢のバイオリファイナ} リーを試みた研究は報告されていない．また，上述の カタユウレイボヤの被嚢からエタノールを生産した研 究においては，有機溶媒を用いて高温・高圧条件で加 熱処理するオルガノソルブ 処 理 を 被 嚢 に 施 し て お り ），リグニンを含まないメリットが生かせていない． 本研究では，バイオリファイナリーによりマボヤの被 嚢を利活用することを目的とし，環境負荷やエネル ギー消費を抑えた前処理と同時糖化発酵（SSF）によ り，生分解性プラスチックの原料となる L―_乳酸を生 産することを試みた．

．実 験 方 法

． 使用したバイオマスとセルラーゼ マボヤの被嚢は，殻付きホヤを 個購入し，食用部 を取り除くことで回収した．この時，殻付きホヤの総 重量と被嚢の重量を測定し，総重量に対する被嚢の湿 重量の割合を算出した．その後，被嚢を ℃で 日間 乾燥させ，乾燥後の重量を測定し，総重量に対する被 嚢の乾燥重量の割合を算出した．乾燥後の被嚢は，粉砕 機（ワンダークラッシャー WC― L，大阪ケミカル㈱） を用いて粒子径が約 ㎜以下になるように粉砕し，マ ボヤ被嚢粉末として使用した．また，セルロース，た んぱく質，脂質，無機物の含有率を測定した．セルロー ス含有率は，バイオマス標準分析法（米国再生可能エ ネルギー研究所（NREL）））_{でセルロースを完全に加} 水分解し，生成したグルコースの濃度を測定キット（グ ルコース CII―_{テストワコー，富士フイルム和光純薬} ㈱）で定量した．たんぱく質，および脂質の含有率は， ㈱アレルギー食品検査センターに依頼し，それぞれ燃 焼法（改良デュマ法），およびエーテル抽出法（ソッ クスレー抽出法）により測定した．無機物含有率は， ℃に設定したマッフル炉で有機物を燃焼させ，残っ た固体の重量を測定し，求めた． さらに，リグニンを多く含むセルロース性バイオマ スとして，イナワラ粉末とタケ粉末も用意してマボヤ 被嚢粉末と比較した．イナワラには，宮城大学食産業 学群の農場で発生したものを ∼ ㎝長にカットして 使用し，タケには，著者が既報 ）で入手したタケチッ プを使用した．いずれも，マボヤ被嚢粉末と同様に粉 砕してイナワラ粉末，タケ粉末とし，セルロース含有 率を同様に測定した． セルラーゼには， 由 来のセルラーゼ（Sigma-Aldrich，C ― G）を使用 した．本セルラーゼの活性は，セルロース粉末から 時 間で µmol のグルコースを生産する酵素量を unit とした場合， ． units/㎎であることがわかっている． ． バイオマスの糖化 マボヤ被嚢粉末，イナワラ粉末，およびタケ粉末に 対して糖化処理を行い，それぞれに含まれるセルロー スの分解性を確かめた．さらに，糖化の前処理として 水熱処理の効果も確かめた． 水熱処理をしない糖化では， mL 容三角フラスコ に乾燥重量で ． g のバイオマスを投入し， ℃で 分間のオートクレーブ処理による滅菌後，滅菌水と セルラーゼ溶液を添加した．水熱処理をする糖化では， あらかじめ mL 容三角フラスコ内で ． g のバイオ マスと mL の蒸留水を混合し，オートクレーブ処理 による水熱処理を兼ねた滅菌後，セルラーゼ溶液を添 加した．なお，セルラーゼ溶液は，クエン酸緩衝液（pH ．， mM）にセルラーゼを溶解し，孔径 ． µm のメンブレンフィルタで濾過滅菌した．また，いずれ の糖化手法も，最終的な液量が mL，バイオマスの 濃度が g/L，クエン酸緩衝液の濃度が mM，セル ラーゼの濃度が g/L となるように調製した．糖化は， 振盪培養機を用いて ℃， rpm の回転振盪で 時 間行い，生成したグルコースの濃度を測定した． ． 糖化におけるマボヤ被嚢粉末の濃度の影響 水熱処理マボヤ被嚢粉末の糖化において，マボヤ被 嚢粉末の濃度と，生成するグルコースの濃度の関係を 調べた． mL 容三角フラスコ内で mL の蒸留水と混合す るマボヤ被嚢粉末を， ．， ，および g の 通り に変化させ， ．と同様の方法により，水熱処理マボ ヤ被嚢粉末の糖化を行った．なお，マボヤ被嚢粉末の 濃度は， ， ，および g/L，セルラーゼの濃度 は，それぞれ ， ，および g/L に調製した． Vol. No. （ ） ３５ ―１５１―

． SSF による水熱処理マボヤ被嚢粉末からの L―乳酸の生産 セルラーゼと乳酸菌を同時に作用させる SSF によ り，水熱処理マボヤ被嚢粉末からの L―乳酸の生産を 試みた．乳酸菌には， NBRC を使用した． mL 容三角フラスコ内で g のマボヤ被嚢粉末と mL の蒸留水を混合し，オートクレーブ処理をした． また，クエン酸緩衝液（pH ．，約 mM）に，セ ルラーゼ，酵母エキス，およびペプトンを溶解し濾過 滅菌し，培養液を調製した．オートクレーブ処理後の フラスコ内に， ． mL の培養液と ． mL の乳酸菌を 前培養したものを添加し，ホヤ被嚢粉末の濃度が g/L，クエン酸緩衝液の濃度が mM，セルラーゼの 濃度が g/L，酵母エキスの濃度が g/L，ペプトン の濃度が g/L，乳酸菌の濃度が約 CFU/mL とな るように調製した．なお，乳酸菌は，GYP 液体培地（グ ルコース g/L，酵母エキス g/L，ペプトン g/L， 酢酸ナトリウム三水和物 g/L，硫酸マグネシウム七 水和物 ． g/L，硫酸マンガン四水和物 ． g/L，硫 酸鉄七水和物 ． g/L，塩化ナトリウム ． g/L）に 接種し， ℃で 時間静置することで前培養した．SSF は，振盪培養機を用いて ℃， rpm の回転振盪で 時間行い，pH，乳酸菌濃度，グルコース濃度，お よび L―乳酸濃度を測定した．乳酸菌濃度は，GYP 液 体培地に寒天を g/L となるように加えた GYP 寒天 培地を用いた希釈平板法により測定し，L―_乳酸濃度

は測定キット（E―キット L―乳酸，R-Biopharm AG）を 用いて測定した．なお， 時間おきに，滅菌した M の水酸化ナトリウム水溶液を添加することで，混合物 の pH を ．∼ ．に合わせた．

．結果と考察

． バイオマスの組成 殻付きホヤの総重量に対する被嚢の湿重量，および 被嚢の乾燥重量の割合を算出したところ，それぞれ約 ％，および約 ．％であった．このことから，宮城 県で令和元年に収穫された ， トンのホヤ類からは， 湿重量で約 ， トン，乾燥重量で約 トンのマボヤ の被嚢が排出されたと予想された． マボヤ被嚢粉末に含まれる成分とその割合を表 に 示す．セルロースの割合は ．％であり，測定した項 目の中では，たんぱく質の割合が最も高く，脂質の割 合が低いこともわかった．なお，たんぱく質は窒素源 になることから，ホヤ被嚢粉末から乳酸を生産した後 の残渣は，肥料化することでさらなる利活用ができる と期待された．さらに，無機物の割合が ．％であり， 海水中の塩が含まれていることが示唆された．なお， 測定した 種類の成分の和が ．％となることから， 糖類のような窒素を含まない有機物が ．％程度含ま れていると考えられた． 一方，イナワラ粉末，およびタケ粉末のセルロース 含有率は，それぞれ ．％，および ．％であり，マ ボヤの被嚢のセルロース含有率は，陸上のセルロース 性バイオマスに比べると低めであることがわかった． ． バイオマスの糖化 マボヤ被嚢粉末，イナワラ粉末，およびタケ粉末の 糖化において，水熱処理の有無によるセルロース変換 率を図 に比較して示す．ここで，セルロース変換率 は，糖化により生成したグルコースの濃度から，バイ オマスに含まれるセルロースがグルコースに変化した 割合として求めた． 水熱処理をしない糖化において，イナワラ粉末やタ ケ粉末よりもマボヤ被嚢粉末が高いセルロース変換率 を示した．さらに，水熱処理によるセルロース変換率 の上昇は，イナワラ粉末で ．％から ．％の ．倍， タケ粉末で ．％から ．％の ．倍であったのに対 表 マボヤ被嚢粉末の組成 成 分 含有率（％） セルロース たんぱく質 脂質 無機物 ． ． ． ． 図 バイオマスの糖化におけるセルロース変換率 の比較（n＝ ） ３６ 環 境 技 術 ―１５２―

し，マボヤ被嚢粉末では ．％から ．％の ．倍と 格段に高い値となり，マボヤ被嚢粉末に含まれるセル ロースが，リグニンを多く含むセルロース性バイオマ スに比べて分解しやすいことが確かめられた． ． 糖化におけるマボヤ被嚢粉末の濃度の影響 水熱処理マボヤ被嚢粉末の糖化において，マボヤ被 嚢粉末の濃度を変化させた時のグルコースの濃度を 図 に比較して示す．マボヤ被嚢粉末の濃度を上げる ことにより，生成するグルコースの濃度も上昇した．し かしながら，生成するグルコースの濃度がマボヤ被嚢 粉末の濃度に比例せず，マボヤ被嚢粉末濃度を g/L から ， ，および g/L に上昇させることで， セルロース変換率 は ．％か ら ．， ．，お よ び ．％に低下した．この原因として，マボヤ被嚢粉末 の濃度を上げることにより，マボヤ被嚢粉末に対する 水の割合が低くなったために水熱処理効果が低下した こと，塩の濃度が高くなったためにセルラーゼに対す る阻害が強くなったこと，生成するグルコースの濃度 が高くなったためにセルラーゼに対する生成物阻害が 強くなったことなどが考えられた．ただし，グルコー スによるセルラーゼに対する生成物阻害については， SSF により一旦生成したグルコースを速やかに微生 物に消費転換させることで抑制することが可能であ る．そのため，次に水熱処理マボヤ被嚢粉末の SSF を試みた． ． SSF による水熱処理マボヤ被嚢粉末からの L―乳酸の生産 水熱処理マボヤ被嚢粉末の SSF における pH と乳 酸菌濃度の経時変化を図 に示す．pH は， 時間以 降に低下幅は小さくなったものの SSF の期間中低下 し続けたことから，乳酸が生成し続けていたことが考 えられた．また，乳酸菌濃度は 時間後には開始時の 約 倍となり， 時間以降にやや低下したものの， 高濃度を維持することができた．このことから，pH を調整することで乳酸菌の活性を維持することがで き，乳酸菌には基質であるグルコースが供給し続けら れていたことが考えられた． SSF におけるグルコース濃度と L―乳酸濃度の経時 変化を図 に示す．グルコースは， 時間後にやや蓄 積したものの低濃度に維持されており，糖化で生成し たグルコースが速やかに乳酸菌に消費されていたこと が示唆された．また，L―乳酸濃度は SSF の期間中上 昇し続け， 時間後には ． g/L となった． ここで， 時間後のグルコース濃度， および L―_{乳酸濃度から，} セルロースがグルコースや L―乳酸に変化した割合を セルロース変換率として計算すると， ．％となった． マボ ヤ 被 嚢 粉 末 の 糖 化 で は，セ ル ロ ー ス 変 換 率 が 図 マボヤ被嚢粉末濃度を変化させた糖化におけ るグルコース濃度の比較（n＝ ） 図 水熱処理マボヤ被嚢粉末の SSF におけるグル コース濃度と L―_{乳酸濃度の経時変化（n＝ ）} 図 水熱処理マボヤ被嚢粉末の SSF における pH と 乳酸菌濃度（n＝ ）の経時変化 Vol. No. （ ） ３７ ―１５３―

．％であったことから，SSF によりセルロース変 換率が上昇することがわかった．これは，SSF にお いて，グルコースによるセルラーゼに対する生成物阻 害が抑制されたためであると考えられた．ただし，セ ルロース変換率の上昇幅は小さく，マボヤ被嚢粉末の 濃度が低い時の糖化よりもセルロース変換率は低い値 となった．このことから，糖化においてマボヤ被嚢粉 末の濃度を高めた時にセルロース変換率が低下する原 因は，生成物阻害の影響よりも前述のその他の影響の 方が強いことが判明した． さらに， g/L のマボヤ被嚢粉末から ． g/L の L―乳酸が生成したことから，マボヤの被嚢からの L― 乳酸収率は ． g-L-lactic acid/g-tunic となる．この ことから，宮城県で令和元年に排出されたと予想され る乾燥重量で トンのマボヤの被嚢からは，約 ト ンの L―乳酸が生産できると考えられた．また，被嚢 に含まれるセルロースを全て乳酸に変換できれば，約 トンの L―_{乳酸が生産可能であると期待された．} セルロース性バイオマスからの乳酸の生産について は，これまでに多くの研究が報告されている．その中 でも，今回マボヤ被嚢粉末から生産された L―乳酸と 同程度の濃度の乳酸が生産されている報告について， バイオマスの前処理条件や生成した乳酸の濃度を表 に比較して示す．マボヤ被嚢粉末では，有機溶媒，酸， アルカリを用いることなく，低温度，短時間での加熱 処理で乳酸を生産することができた．このことから， マボヤの被嚢は，リグニンを多く含むセルロース性バ イオマスよりも，環境負荷やエネルギー消費を抑えた 前処理でバイオリファイナリーに利用できるバイオマ スであることが期待された．

．ま と め

本研究では，マボヤの被嚢をバイオリファイナリー により利活用することを目的とし，マボヤの被嚢に含 まれるセルロースから L―_{乳酸を生産することを試み} た． マボヤ被嚢粉末に含まれるセルロースは，イナワラ 粉末やタケ粉末に含まれるセルロースよりも分解しや すく，水熱処理により ．％と高いセルロース変換率 で分解できることを確かめた．また，マボヤ被嚢粉末 の濃度を上げることにより，セルロース変換率は低下 するものの，生成するグルコースの濃度を上げること が可能であった．さらに，SSF により ． g/L の L― 乳酸を生産することに成功し，リグニンを多く含むセ ルロース性バイオマスから乳酸を生産する場合に比べ て，環境負荷やエネルギー消費を抑えた前処理で，同 等の乳酸を生産可能であった． 参 考 文 献 ）農林水産省；“海面漁業生産統計調査”，農林水産省， https : / / www. maff. go. jp / j / tokei / kouhyou / kaimen _ gyosei/，（参照 ― ― _）． ）日下兵爾，加賀靖，斉木康弘，太田静行；ホヤ脂質の 脂肪酸組成とその季節的変化，油化学， ，（ ），p. ― ， ． ）土 屋 靖 彦，鈴 木 芳 夫；マ ボ ヤ， v. DRASCHE の生化学的研究―_{Ⅷ． 一般成分について，} 日本水産学会誌， ，（ ），p. ― _{， ．} ）堀川祥生，杉山淳司；セルロースの基本構造と天然分 布，日本ゴム協会誌， ，（ ），p. ― _{， ．} ）笹倉靖徳；カタユウレイボヤにおける固着生活とセル ロースの関係，Sessile Organisms， ，（ ），p. ― _， ． ）巽大輔，井上翔太；分子量の異なるセルロースから調 製した酢酸セルロースの材料特性，材料， ，（ ）， p. ― ， ．

）Zhao Y., Moser C., Lindström M. E., Henriksson G., Li J.; Cellulose nanofibers from softwood, hardwood, and tunicate: preparation‒structure‒film performance interrelation, ACS Applied Materials & Interfaces,

，

（ ）, p. ― _{, .}

）Dunlop M. J., Acharya B., Bissessur R.; Isolation of nanocrystalline cellulose from tunicates, Journal of Environmental Chemical Engineering, ，（ ），p. ―

, .

）Le Goff K. J., Jouanneau D., Garnier C., Aubry T.; Gelling of cellulose nanowhiskers in aqueous suspension, Journal of Applied Polymer Science,

， （ ）, , ． 表 セルロース性バイオマスからの乳酸の生産 バイオマス 前処理条件 生成物と濃度 文 献 マボヤ被嚢 ブナ マツ イナワラ コーンストーバー 水を用いて ℃で 分間 ％エタノールを用いて ℃で 分間 ％エタノールを用いて ℃で 分間 ．％硫酸を用いて ℃で 分間 g/L 水酸化ナトリウムを用いて ℃で 分間 ． g/L の L―乳酸 ． g/L の乳酸 ． g/L の乳酸 ． g/L の D―_乳酸 約 g/L の D―_乳酸 本研究 ３８ 環 境 技 術 ―１５４―

）蓮沼誠久，石井純，荻野千秋，近藤昭彦；バイオリファ イナリーの現状と展望，化学と生物， ，（ ），p. ―

， ．

）Hrůzová K., Matsakas L., Karnaouri A., Norén F., Rova U. , Christakopoulos P.; Second-generation biofuel production from the marine filter feeder , ACS Sustainable Chemistry & Engineering, ，（ ）, p. ― _{, .}

）Ruiz R., Ehrman T.; Determination of carbohydrates in biomass by high performance liquid chromatography, Chemical analysis and testing task laboratory analytical procedure, LAP― , .

）柳澤満則；高濃度エタノール生産のためのタケの微粉 化と常温アルカリ処理，環境技術， ，（ ），p. ― _，

．

）Karnaouri A., Asimakopoulou G., Kalogiannis K. G.,

Lappas A. , Topakas E.; Efficient D-lactic acid production by subsp. through conversion of organosolv pretreated lignocellulosic biomass, Biomass and Bioenergy, , , .

）Vishnu Prasad J., Sahoo T. K., Naveen S., Jayaraman G.; Evolutionary engineering of

reduces enzyme usage and enhances conversion of lignocellulosics to D-lactic acid by simultaneous saccharification and fermentation, Biotechnology for Biofuels, , , .

）Zhang Y., Vadlani P. V.; D-lactic acid biosynthesis from biomass-derived sugars via

fermentation, Bioprocess and Biosystems Engineering， ，（ ），p. ― _{， ．}

Production of L-Lactic Acid from Cellulose in the Tunic of

Mitsunori YANAGISAWA＊

＊Miyagi University, School of Food Industrial Sciences

ABSTRACT

The tunic of , which is a waste product, was used as the cellulosic biomass to produce L-lactic acid as the raw material for biodegradable plastic. Cellulose in the tunic powder was hydrolyzed by commercial cellulase, with a higher conversion rate than that in rice straw powder and bamboo powder. The tunic powder was pretreated under conditions with low environmental impact and energy requirements. L-lactic acid was produced from the pretreated tunic powder through simultaneous saccharification and fermentation. The L-lactic acid concentration reached ． g/L at the end of the process.

Key Words: , tunic, cellulose, L-lactic acid, simultaneous saccharification and fermentation

Vol. No. （ ） ３９