氏 名 松 居 翔 学位（専攻分野の名称） 博 士（食品栄養学） 学 位 記 番 号 甲 第 667 号 学 位 授 与 の 日 付 平成 26 年 3 月 20 日 学 位 論 文 題 目 UVB 照射による皮膚-脳-肝臓 axis の解析とその生物学的 意義 論 文 審 査 委 員 主査 教 授・博士（農学） 大 石 祐 一 教 授・農 学 博 士 上 原 万里子 教 授・博士（農学） 服 部 一 夫 論 文 内 容 の 要 旨 はじめに 皮膚は独立した人体最大の臓器で，他の臓器と有機的 に関わりながら一個体を形成している。皮膚と他の臓器 をつなぐメカニズムには，内分泌経路と自律神経，神経 ペプチドを介する神経系の経路がある。皮膚の炎症によ る反応を例に挙げると，内分泌経路では，炎症が皮膚に 生じると炎症性サイトカインが産生される。そして，産 生されたサイトカインは，血液を介して全身の炎症反応 を引き起こす。もう一つのルートである神経系は，皮膚 の炎症による熱感や疼痛が脳で感知されるように，上向 性の知覚神経を介して局所の皮膚での炎症反応は脳に伝 わり，脳内サイトカイン産生を増幅させる。つまり，皮 膚での炎症は不快，不安，全身倦怠感などの脳で感知さ れる病的感覚に繋がる。従って，皮膚への刺激は，皮膚 に限られたものだけでなく，他臓器とネットワークを形 成し，身体へ様々な影響を及ぼすことが考えられる。 我々の皮膚は常に外界から様々な刺激にさらされてい る。その刺激の代表的なものとして太陽光線中の紫外線 が挙げられる。紫外線は，UVA（320-400nm），UVB （280-320nm），UVC（＜280nm）に分けられ，UVA は オゾン層に吸収されることなく地表に届き，波長の短い UVC は地表に届かない。UVB だけが成層圏のオゾン 層量によってその照射量が変動する。現在，熱帯地域を 除き長期的・全地球的にオゾン層の減少傾向が続いてい る。特に顕著なのは南極上空のオゾン層の減少である が，日本においても，晴天時の UVB の地上照射量とオ ゾン全量との間には負の相関があることが確認されてい る。オゾン全量の減少の結果，地表に降り注ぐように なった UVB により，皮膚では炎症や色素沈着，皮膚の 老化，光アレルギー，皮膚癌，DNA 損傷などが引き起 こされ，皮膚に対して大きなダメージを与えることが知 られている。一方で，UVB による変性には違いない が，皮膚にとってプラスの効果も存在する。その一つ に，UVB の照射は，皮膚に蓄えられたプロビタミン を，活性ビタミン D3 に変化させることがある。ビタミ ン D3 は，脂溶性ビタミンの 1 つであり，カルシウム代 謝において中心的な役割を果たすとともに，細胞の分化 や増殖の根幹にも関わるプロセスなどでも多彩な作用を 有している。つまり，過度の UVB は皮膚にとって悪影 響であるが，身体の健康を維持するためには最小限の UVB は必要である。このように，皮膚に対する UVB の影響については，多くの報告があり，UVB の危険性 と重要性，双方の面でよく理解されている。しかし，皮 膚以外の臓器に対する UVB の暴露の影響を検討した報 告は極めて少ない。そこで本研究では，UVB 照射シグ ナルが，どのようにして皮膚以外の臓器に伝わるのか， また，その生物学的意義について検討した。 実験 1 UVB 照射ヘアレスマウスにおける血清アディ ポネクチン濃度に及ぼす影響 これまでの報告で，UVB を照射されたマウスの血中 アディポネクチン量は，減少することがわかっている。 しかし，UVB 照射により，血中アディポネクチン量が 減少する理由はわかっていない。そこで，実験 1 では， UVB の照射の血中アディポネクチン量減少に繋がるメ カニズムについて検討した。実験動物には，Hos : HR-1 ヘアレスマウス（6 週齢，雌）を用いた。飼料には MF を与え，自由摂食とした。マウスは 7 日間の馴化飼 育後，UVB（−）群（n＝6）と UVB（＋）群（n＝6）に 群分けを行った。UVB（−）群は，馴化飼育と同様の条 件下で飼育を行い試験に用いた。UVB（＋）群に関して は UVB 照射試験を行った。UVB のエネルギー量は 1.6 J/cm2とした。UVB（−）群，UVB（＋）群ともに試験 24 時間後，解剖を行い，皮膚，視床下部，肝臓，内臓 ─ 36 ─
脂肪組織の摘出および採血を行った。各摘出臓器は，群 ごとにサンプルをプールし，cDNA マイクロアレイを 行った。各摘出臓器の mRNA 量は，Real time PCR 法 にて測定した。各 mRNA 量は，b-actin の mRNA 量当 たりの相対値として求めた。また，視床下部，肝臓，血 清中の各タンパク質濃度は ELISA 法にて測定した。 まず，血清中のアディポネクチン量および内臓脂肪組 織中のアディポネクチン mRNA 量を測定した。その結 果，血清アディポネクチン量および内臓脂肪組織中のア ディポネクチン mRNA 量は，UVB（−）群に比して， UVB（＋）群で有意な減少を示した。また，内臓脂肪組 織においてアディポネクチンの発現の上方制御に関わる Peroxisome proliferator-activated receptor（PPAR）g， CCAAT/enhancer binding protein（C/EBP）a，C/EBPb， Fatty acid binding protein 4（aP2）の mRNA 量は， UVB（−）群に比して UVB（＋）群で有意に減少した。 一方，下方制御に関わる Interleukin（IL）-6，Monocyte chemoattractant protein（MCP）-1 の mRNA 量は有意 な増加を示した。これらのことから，UVB 照射による 血清アディポネクチン量の減少は，内臓脂肪組織での PPARg，C/EBPa，C/EBPb，aP2 の 減 少 と IL-6 と MCP-1 の増加によるアディポネクチン発現の低下が要 因であることが考えられた。
これまでに，Serum amyloid A（SAA）は，脂肪細胞 において PPARg，C/EBPa，C/EBPb，aP2 の mRNA 量の減少と IL-6，MCP-1 mRNA 量の増加を引き起こす ことが報告されている。そこで，SAA に着目したとこ ろ，主要な合成組織である肝臓において，UVB（−）群 に比して UVB（＋）群で，SAA の mRNA 量が顕著に増 加していた。また，血清 SAA 量も，UVB（−）群に比 して UVB（＋）群で有意な増加を示した。よって，本 研究において，血中で増加した SAA が脂肪細胞に働き かけ，アディポネクチンの発現を抑制したことが考えら れた。また，これらのことから UVB 照射のシグナル は，何らかの経路を介し，肝臓を刺激していることが示 唆された。
これまでの報告で，Calcitonin gene-related peptide （CGRP）タンパク質の局所増加は，脳を介した神経経 路を介して，全身の CGRP 発現と放出を増加させるこ とが報告されている。そこで，cDNA マイクロアレイ による皮膚，肝臓，視床下部の CGRP の遺伝子発現の 結果を検討した。その結果，摘出臓器のすべてで CGRP の遺伝子発現の増加が認められた。これらの結果を Real time PCR 法にて確認したところ，皮膚，肝臓，視 床下部で，UVB（−）群に比して UVB（＋）群で CGRP mRNA 量 は 有 意 な 増 加 を 示 し た。ま た，組 織 中 の CGRP のタンパク量を測定したところ，視床下部，肝 臓で有意な増加を示した。よって，本研究においても UVB の刺激が，皮膚中で CGRP の発現を増加させ，そ の増加が引き金となり，脳を介して肝臓の CGRP の発 現と放出を促したことが推察された。
実験 2 HepG2 cells における CGRP の SAA 発現に 及ぼす影響 実験 1 の結果，肝臓において CGRP と SAA の発現の 増加が確認されたが，その 2 つの因子の関係性について は不明である。そこで実験 2 では，in vitro の肝臓モデ ルとして知られる HepG2 cells を用いて，CGRP の肝 臓における SAA 発現に対する影響を検討した。HepG2 cells を 10% FBS を含む DMEM-F12 HAM 培地でサブ コンフルエントまで培養し，24 時間のスタベーション 後，以下の実験を行った。CGRP（100nM）を培地に 添加後，SAA の mRNA 量は，4 時間で有意な増加を示 した。また，CGRP（10 or 100nM）を培地に添加し， 24 時間後に，SAA ELISA kit を用いて培地中の SAA 量を測定したところ，100nM で SAA 量が有意に増加 した。さらに，SAA の上流に存在する IL-1b，IL-6， Tumor necrosis factor（TNF）a は，IL-6 のみ 2 時間で mRNA 量の有意な増加が認められ，IL-1b と TNFa の mRNA 量には変化が認められなかった。これらのこと から，CGRP による SAA の増加は，IL-6 の作用を介し ていることが考えられた。そこで，この仮説を証明する ために，IL-6 中和抗体（0.1 or 1mg/mL）を添加し， CGRP による SAA の mRNA 量の変動を確認した。そ の結果，CGRP により誘導された SAA mRNA 量の増 加が IL-6 中和抗体により抑制された。したがって， CGRP は IL-6 の作用を介して SAA の発現を促進して いることが考えられた。 以上の結果から，実験 1 で認められた UVB 照射によ る肝臓中での SAA の増加は，CGRP により増加した IL-6 の作用に起因することが考えられた。 実験 3 UVB 照射がヘアレスマウスの肝臓 Trans-forming growth factor d1 と Plasminogen activa-tor inhibiactiva-tor-1 遺伝子発現に及ぼす影響 実験 3 では，血中アディポネクチンと負の相関を示す ことが知られている，肝臓中の Transforming growth factor（TGF）b1 と，そ の 下 流 に 存 在 し，細 胞 外 マ ト リックスの沈着，蓄積を促進し，線維化を主体とする組 織病変の進展に深く関与する Plasminogen activator ─ 37 ─
inhibitor（PAI）-1 の発現に着目した。サンプルは，実験 1 と同様のものを用いた。その結果，肝臓中の TGFb1 mRNA 量は，UVB（−）群に比して UVB（＋）群で有 意 な 増 加 を 示 し た の に 対 し，PAI-1 の mRNA 量 は UVB（−）群に比して UVB（＋）群で有意な減少を示し た。この結果は，TGFb1 の下流に PAI-1 が存在する点 から矛盾が生じる。これまでに，CGRP の働きの一つ に，肝線維化の進行を緩和させる効果が報告されてい る。すなわち，UVB 照射により，線維化に対して重要 な因子である PAI-1 の遺伝子発現が減少したのは， CGRP の肝臓線維化の緩和作用に起因するものではな いかと推測した。そこで，この仮説を証明するために， HepG2 cells を用いて CGRP の PAI-1 の発現に対する 効果を検討した。培養方法は実験 2 と同様とし，追加条 件として，実験 3 では，TGFb1 を添加し，PAI-1 を強 制発現させた試験群を設けた。その結果，TGFb1 によ り誘導された PAI-1 の培地中タンパク質量は，CGRP （10 or 100nM）添加により TGFb1 のみ添加した群に比 して，24 時間で有意に減少した。また，CGRP（100 nM）添加により，TGFb1 が誘導した PAI-1 の mRNA 量は，TGFb1 のみ添加した群に比して 4，8 時間で有意 な減少を示した。これまでに，CGRP は，神経細胞で cAMP/PKA pathway を活性化させることが報告されて いる。そこで，PKA の阻害剤の一つである H89（10 mM）を添加した。その結果，TGFb1 により誘導され た PAI-1 の遺伝子発現を抑制していた CGRP の効果が 阻 害 さ れ た。ま た，TGFb1 pathway に は，Smad と Mitogen-activated protein kinase（MAPK）pathway が 良く知られているが，cAMP/PKA pathway は，MAPK （Extracellular signal-regulated kinase（ERK），c-jun N-terminal kinase（JNK），p38）の活性を抑制するこ とが知られている。そこで ERK，JNK，p38 のリン酸 化 を MAPK ELISA kit を 用 い て 測 定 し た と こ ろ， TGFb1 により引き起こされた ERK，JNK，p38 のリン 酸化のレベルが，CGRP 添加により基礎培地で培養し た HepG2 cells のリン酸化レベルまで戻ることが明らか となった。これらのことから，UVB 照射により肝臓で 増加した TGFb1 による PAI-1 の発現を増加させる効果 は，肝臓で増加した CGRP の cAMP/PKA pathway を 介した MAPK（ERK，JNK，p38）pathway の阻害作 用により，抑制されたことが示唆された。 まとめ 実験 1 の結果より，UVB 照射による血中アディポネ クチン濃度の減少は，肝臓で合成された SAA が主な要 因であることが考えられた。また，臓器間の情報伝達に 重要な役割を担う CGRP の mRNA 量が，皮膚，視床 下部，肝臓で増加していたことから，CGRP の増加を 介して，UVB 照射のシグナルが皮膚から脳を介して肝 臓に伝わることが示唆された。加えて，実験 2 の結果よ り，肝臓における CGRP の作用は，IL-6 の発現を増加 させ，SAA の合成を間接的に制御していることが明ら かとなった。これら 2 つの実験から，UVB 照射のシグ ナルには CGRP が重要な役割を担っていることが明ら かとなった。実験 3 では，UVB 照射による血中アディ ポネクチン量の減少による肝臓への影響を検討した結 果，肝臓中の TGFb1 が増加していた。このことは， PAI-1 が減少する点と矛盾を生じたが，これらの矛盾の 原因の一つに，CGRP が MAPK pathway の活性を抑制 することが考えられた。ただし，CGRP の PAI-1 発現 の抑制効果は顕著ではなかったため，他の因子も関わる ことが示唆された。本研究では，UVB 照射による臓器 間のシグナルは，皮膚-脳-肝臓 axis を介して CGRP の 発現と放出の増加という形で伝わることを提案した。さ らに，その情報が身体に伝わることで，脂肪組織におけ るアディポネクチン mRNA 量の減少，および血清ア ディポネクチン量の低下を招くことが示唆された。その 結果，皮膚に対する UVB 照射の影響は，直接の皮膚に 対する障害に加え，皮膚構成分子の合成に大きく関わる 血中アディポネクチン量の減少という形で，内部からも 皮膚に悪影響を及ぼすことが示唆された。一方，UVB 照射は肝臓中の CGRP を増加させ，肝線維化の増悪化 に重要な役割を担う PAI-1 の発現を減少させる効果を 有した。すなわち，UVB 照射シグナルは，CGRP が重 要な働きを担い，その効果は，血中アディポネクチン量 の減少というネガティブな効果と，肝臓 PAI-1 発現の 減少というポジティブな効果，双方の影響を示すことが 明らかとなった。 審 査 報 告 概 要 皮膚への UVB 照射がアディポネクチンの脂肪細胞で の合成，血中濃度を減少させる機構について検討した。
UVB 照射は，皮膚で CGRP（Calcitonin gene-related peptide）を増加させ，神経経路を介して脳の CGRP 増 ─ 38 ─
加，さ ら に は 肝 臓 で の CGRP を 増 加 さ せ た。肝 臓 CGRP は，IL-6 を介して Serum amyloid A 合成を促進 し，アディポネクチンを減少させたことが明らかとなっ た。また，UVB 照射が肝臓の TGFb1 を増加させるも の の，CGRP 増 加 に よ り 肝 線 維 症 に 関 わ る PAI-1 （Plasminogen activator inhibitor-1）を減少させ，肝線 維症増悪化を抑制することが示唆された。以上の結果に より，皮膚 UVB 照射が皮膚-脳-肝臓 axis での CGRP の発現と放出の増加という形で伝わり，そのシグナル は，血中アディポネクチン量の減少というネガティブな 効果と肝臓 PAI-1 発現の減少というポジティブな効果， 双方の影響を示すという生物学的意義の一端が明らかと なった。以上の結果は，新たな皮膚，肝臓などを含めた 臓器間ネットワーク制御機構の解明に寄与するものであ る。 よって，審査員一同は博士（食品栄養学）の学位を授 与する価値があると判断した。 ─ 39 ─
