Title イヌジステンパーウイルスの感染メカニズムと宿主域に関する研究( 本文(Fulltext) ) Author(s) 大槻, 紀之 Report No.(Doctoral Degree) 博士(獣医学) 乙第131号 Issue Date 2014-09-24 Type 博士論文 Version ETD URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/50401 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
イヌジステンパーウイルスの感染メカニズムと
宿主域に関する研究
大槻 紀之
2014年
目次 緒言・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１ 図・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・６ 第１章 ヒトネクチン４を受容体としたイヌジステンパーウイルス感染の検討 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・７ １． 序論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・７ ２． 材料および方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・９ １． 細胞 ２． フローサイトメトリー解析 ３． ウイルス ４． ウイルス増殖能 ５． ウイルス力価測定 ６． 膜融合実験 ７． イヌジステンパーウイルスH 遺伝子の解析 ３． 結果・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１４ １． ヒトネクチン４を受容体としたイヌジステンパーウイルス感染の検 討 ２． ネクチン４発現ヒト肺胞上皮細胞におけるイヌジステンパーウイル ス増殖能の検討 ３． 親株と馴化株におけるH タンパク質の塩基配列の比較 ４． 考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１７ 図表・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２０
第２章 H358 細胞馴化ウイルスの馴化にかかわるウイルス側因子の探 索・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２８ １． 序論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２８ ２． 材料および方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２９ １． 次世代シークエンス解析 ２． ダイレクトシークエンス法によるP 遺伝子の塩基配列解析 ３． 膜融合実験 ３． 結果・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３２ １． Ac96I-VDS 株馴化過程におけるウイルス遺伝子の変異 ２． 007Lm-VDS 株馴化過程におけるウイルス遺伝子の変異 ３． C タンパク質のアミノ酸配列比較 ４． 007Lm-VDS 株の H タンパク質を用いた膜融合実験 ４． 考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３５ 図表・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・４０ 第３章 イヌジステンパーウイルスV タンパク質の機能の検討・・・・・４６ １． 序論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・４６ ２． 材料および方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・４８ １． 細胞とウイルス ２． ウイルス増殖能 ３． ウイルス力価測定 ４． ウエスタンブロッティング ５． 免疫染色によるIRF3（IFN-regulatory factor 3）核移行の検出
６． RT-PCR による IFN 活性化遺伝子群（ISGｓ）転写量の定量 ３． 結果・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・５３ １． V タンパク質発現 H358 細胞におけるウイルスの増殖 ２． V タンパク質発現 H358 細胞におけるウイルス感染時の IRF3 の核 移行 ３． V タンパク質発現 H358 細胞における ISGs 転写活性の比較 ４． 考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・５５ 図・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・５９ 結論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・６３ 謝辞・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・６６ 引用文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・６７
緒言 ジステンパーは，発熱・くしゃみ・下痢さらには痙攣・麻痺などの神経症状 を引き起こす致死率の高い，イヌにおける代表的なウイルス感染症の一つであ る(1)。本病の病原体であるイヌジステンパーウイルスは，イヌや他のイヌ科動 物のみならず，他のほ乳類にも感染し(15)，1987 年にはバイカル湖のアザラシ を大量死させ(36)，1994 年にはセレンゲティにおけるライオンでの大規模な流 行を引き起こす(57)など，新興感染症の原因としても知られている。 イヌジステンパーウイルスはパラミクソウイルス科，モルビリウイルスに属 し，近縁のウイルスには牛疫ウイルス，小反芻獣疫ウイルス，麻疹ウイルスな どがあり，いずれも致死率の高いウイルスである。これらジステンパーウイル スに近縁のウイルスは，麻疹ウイルスではヒトが，牛疫ウイルスではウシや水 牛など，小反芻獣疫ウイルスではヒツジやヤギなどが固有の宿主動物である。 一方，これらのウイルスではイヌジステンパーウイルスのように多種多様な動 物への感染は報告されていない。イヌジステンパーの予防のため，我が国では 細胞培養馴化生ウイルスワクチンが使用され，飼育犬における本病の発生はほ ぼ制御されている。一方で，日本や世界各地で，フェレット(51)や野生のアライ グマ(59)，動物園のトラ(42)などにおいて，本症の感染・流行が報告されている。 イヌジステンパーウイルスの一般的な感染経路は感染動物の鼻汁，唾液など を介した経気道的なものであり，体内に侵入したウイルスは呼吸器周囲にある リンパ節や扁桃などのリンパ組織で増殖をする。感染後 3 から 5 日に最初の発 熱がみられ一度解熱し，数日後に再び発熱する。この様な二峰性の発熱はジス テンパーに特徴的なものである。通常，発熱時に鼻汁，咳，結膜炎などの症状
を示し，ウイルスの全身への感染に伴い呼吸器症状および血便を伴う下痢など の消化器症状が現れる。呼吸器および消化器症状は，しばしば二次感染により 重篤化する。また，初期の発熱時には白血球減少症がみられる。ウイルスが脳 内に侵入すると，痙攣･麻痺などの神経症状を呈するジステンパー脳炎を引き起 こす。脳炎を引き起こすと予後が非常に悪くなる(2, 5, 41)。この中枢神経系へ の高い侵襲性は同じモルビリウイルス属である牛疫ウイルスや麻疹ウイルスと 大きく異なる点である(85)。なお，感染病理学的にはジステンパーウイルスは主 に，リンパ系組織および上皮組織を標的としている。 イヌジステンパーウイルスの属するモルビリウイルス属の研究は，ヒトへ感 染し麻疹を引き起こす麻疹ウイルスで多くなされている。麻疹は，ワクチン接 種率の低い国や地域では今なお多くの感染者を出し，発展途上国の小児では未 だに死亡率の高い急性感染症である。麻疹ウイルスは上部呼吸器から体内に侵 入し，ジステンパーウイルスと同様に鼻炎，結膜炎，上気道炎，二峰性発熱な どの症状と全身の発疹，免疫抑制などを引きおこす。麻疹によるウイルス脳炎 の発生頻度は低いが，麻疹罹患 7 10 年後に，亜急性硬化性全脳炎と呼ばれる 脳炎を数万人に 1 人の頻度で引き起こす。麻疹もイヌジステンパーと同様に有 効な生ワクチンが存在し，世界的に接種されている(71)。 モルビリウイルス属は一本鎖マイナス鎖 RNA をゲノムとしエンベロープを 有するウイルスである(30, 41)。イヌジステンパーウイルスゲノムは６個の構造 タンパク質と２個の非構造タンパク質をコードしている。エンベロープ上には， 細胞接着能を有する受容体結合タンパク質（Hemagglutinin ;H タンパク質）お よび細胞融合能を有する融合タンパク質（Fusion protein ;Ｆタンパク質）が存 在 し ， ウ イ ル ス 粒 子 中 に は RNA ゲノムとそれに結合した核タンパク質 （nucleoprotein ;N タンパク質）で構成されるヌクレオカプシドを有する(30)。
ヌクレオカプシドにP（phosphoprotein）タンパク質および L（large）タンパ ク質から構成されるRNA 依存性 RNA ポリメラーゼが結合し，リボ核タンパク 質（RNP）複合体を形成している。また，M（matrix）タンパク質はエンベロ ープを裏打ちすると共に H および F タンパク質のウイルス粒子内部分と RNP 複合体双方と結合し粒子形成に関わっている（図 A）。なお，ウイルスゲノム 上にコードされている遺伝子は以上 6 種のタンパク質をコードするもので，3’ 端からN，P，M，F，H，L 遺伝子の順で並んでいる（図 B）(30, 41)。 イヌジステンパーウイルスは 6 種の構造タンパク質以外に非構造タンパク質 として，アクセサリータンパク質と呼ばれるV タンパク質および C タンパク質 を有する。この 2 つのタンパク質はともにＰ遺伝子上にコードされている。す なわち P 遺伝子を鋳型として転写される際に鋳型であるゲノム上には存在しな い１ヌクレオチドがmRNA の特定部位に挿入される RNA editing と呼ばれる 現象によりV タンパク質 mRNA が作られ，V タンパク質が合成される。このた め，Ｖタンパク質は P タンパク質とは RNA editing が生じる点までは共通の mRNA を有し，アミノ末端側は同一であるが，カルボキシル末端側は異なると いう特徴を持つ。C タンパク質はＰおよびＶタンパク質とは異なる P タンパク 質mRNA 上の読み枠を利用し翻訳される（図 B）。アクセサリータンパク質は パラミクソウイルス亜科のウイルスが共通して有しており，基本的なウイルス 増殖には不要であるものの，宿主のインターフェロン機能に対抗する機能を有 するタンパク質であることが明らかとなっている(16, 21, 43, 54, 81)。 イヌジステンパーウイルスの宿主細胞への侵入は，H および F タンパク質が 協調して働くことにより引き起こされている。モルビリウイルス属の細胞侵入 機構は，1993 年に麻疹ウイルスワクチン株の受容体として，CD46 が同定され たことから研究が進んできた(19, 45)。しかし CD46 が受容体として機能するの
は麻疹ウイルスワクチン株のみであり，野外株や他のモルビリウイルス属にお いては受容体として利用できないことから真の受容体ではないと考えられた(7)。 その後，2000 年になって，SLAM（signaling lymphocyte activation molecule; CD150）が麻疹ウイルスの受容体として同定された(82)。さらに，2001 年には， 牛疫ウイルスおよびイヌジステンパーウイルスが，それぞれ，ウシおよびイヌ のSLAM を受容体として利用できることが報告され(83)，SLAM がモルビリウ イルス属共通の細胞受容体として機能することが分かった。SLAM は成熟樹状 細胞，胸腺細胞，リンパ球などの免疫細胞表面に存在しており，リンパ系組織 を標的とするイヌジステンパーウイルスや麻疹ウイルスの感染分布とも一致し ている。またモルビリウイルス感染でみられる白血球減少症や免疫抑制は， SLAM 陽性 T 細胞の減少が関係することが報告されている(65)。これらのこと より，SLAM がモルビリウイルスの受容体であることとウイルスの感染個体内 での分布や免疫抑制病態とは密接な関係があると考えられる。また，イヌジス テンパーウイルスの受容体がイヌ SLAM と同定された後，イヌ SLAM 恒常発 現Vero 細胞を用いることにより，これまで分離が困難であった野外感染動物か らのジステンパーウイルスの分離が容易となった(67)。 一方で，麻疹ウイルスにおいてSLAM を発現していない非免疫系細胞である 内皮細胞，上皮細胞および神経細胞への感染がin vivo で認められており(37, 39)， SLAM 以外のウイルス受容体の存在が強く疑われてきた。2011 年になり，麻疹 ウイルスの上皮細胞における受容体がネクチン 4 であることが明らかにされた (40, 47)。ネクチン４は極性をもつ上皮細胞に発現している分子であり，細胞の 極性化，分化など様々な細胞活性を制御している(74)。その後，2012 年には， イヌジステンパーウイルスの上皮細胞受容体がイヌネクチン４であることが報 告された(52)。ヒトにおいてネクチン４は中枢神経系には発現していないが，イ
ヌにおいてはネクチン４が脳内で発現していることが確認され，ジステンパー が神経症状を強く起こすことに関係している可能性が示唆されている(52)。 細胞表面上のウイルス受容体は，ウイルスの宿主域やウイルスの指向性に大 きく関わることが知られている(10, 58)。細胞上の受容体が動物種間で大きな差 がない場合はウイルスの宿主域が広がることが予測される。先にも述べたよう に，イヌジステンパーウイルスは多くのほ乳類に感染し，病気を引き起こすこ とが報告されている。近年，中国や日本においてサルへの致死的な感染が報告 されているものの(53, 62)，これまでにヒトへの感染に関する報告はない。本研 究では，イヌジステンパーウイルスのヒトへの感染リスク評価の一助とするた めに，ウイルス受容体の細胞上での発現と感染性の関係から，イヌジステンパ ーウイルスのヒト上皮細胞への感染メカニズムおよび宿主域を規定するウイル スおよび宿主細胞の要因について検討を行った。 第１章では，イヌジステンパーウイルスがヒトネクチン４を受容体として利 用可能か否かを検討し，さらに増殖性との関連性についても解析を行った。第2 章では，同様の受容体結合能を有するにもかかわらず細胞内での増殖能が異な るウイルス株間での集団（準種）としての遺伝子変化（アミノ酸置換）を比較･ 解析し，受容体以外の増殖に係わるウイルス側の要因について検討した。さら に，第 3 章では，このウイルス因子が引き起こした細胞内での増殖のメカニズ ムの違いについて解析を行った。
第１章：ヒトネクチン４を受容体としたイヌジステンパーウイルス感染の 検討 序論 イヌジステンパーウイルスのH タンパク質は宿主細胞上の受容体との結合能 を，F タンパク質はウイルスエンベロープと細胞膜との融合能を有している。 細胞へのウイルスの侵入はH タンパク質が受容体に結合することにより始まる。 初めにH タンパク質が細胞表面の受容体と結合することにより，F タンパク質 の構造変化が引き起こされる。次に構造変化を起こした F タンパク質の機能に より細胞膜とウイルスエンベロープが融合する(24) (図１−１)。このように，両 タンパク質が協調的に機能することにより膜融合を引き起こし，ウイルスの宿 主細胞への侵入が起きる。 イヌジステンパーウイルスは，イヌSLAM およびイヌネクチン４を受容体と して利用できることが報告されている(52, 83)。SLAM は主にリンパ球系細胞に 発現している。一方，ネクチン４は極性をもつ上皮細胞に発現している。それ に加え，イヌでは中枢神経系にもネクチン４が発現していることが知られてい る(52)。モルビリウイルス属は SLAM を受容体として利用するが，宿主とは異 なる種の SLAM は基本的には利用できないことが報告されているが(67, 83)， これまでにイヌジステンパーウイルスがヒトネクチン４を受容体として利用可 能か否かについては調べられていない。 一方，麻疹ウイルスH タンパク質との結合に重要なヒトネクチン 4 の V ドメ イン(40, 47)とイヌネクチン 4 の V ドメインのアミノ酸の間には僅か 6 アミノ酸 の違いしかなく(48)(図１-２)，イヌジステンパーウイルスがヒトネクチン４を受
容体として利用できる可能性は否定できない。 そこで，第１章では，初めにイヌネクチン４がイヌジステンパーウイルスの 受容体であることを同定した手法(52)と同様に，アフリカミドリザル腎由来細胞 であるVero 細胞にヒトネクチン４を発現させた細胞を作製し，本細胞において イヌジステンパーウイルスが増殖可能かを検討した。次に，ヒトネクチン４を 発現する麻疹ウイルス感受性ヒト肺胞上皮細胞においてイヌジステンパーウイ ルスが増殖可能か否かを検討した。これら２種の細胞を用いた試験結果より， イヌジステンパーウイルスが，ヒトネクチン４を受容体として利用できるか否 かを評価した。
材料および方法
1. 細胞
Vero 細胞（九州大学大学院 柳雄介教授より分与）は 5％ウシ胎子血清（FCS） （製品番号：10437028，Invitrogen）添加 Dulbecco’s modified Eagle’s medium （DMEM）(製品番号：D6429，SIGMA)で培養された。麻疹ウイルス感受性ヒ ト肺胞上皮細胞NCI-H358(H358)細胞(78)は 10％FCS 添加 RPMI-1640（製品 番 号 ：22400 ， Invitrogen ） で 培 養 さ れ た 。 イ ヌ SLAM 発 現 Vero 細 胞 （Vero.dogSLAMtag ） (67) ， お よ び イ ヌ ネ ク チ ン ４ 発 現 Vero 細 胞 (Vero/dN4)(52)は 5％FCS および 1 mg/ml G418（製品番号：10131，Invitrogen） 添加DMEM（5％FCS DMEM+G418）で培養された。ヒトネクチン４発現 Vero 細胞（Vero/hN4）は以下のように作製された。H358 細胞より QIAamp RNA Blood Mini kit(製品番号：52304，Qiagen)を用い Total RNA を抽出し， Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit（製品番号：04379012001， Roche Applied Science）を用いた逆転写反応により cDNA を得た。得られた cDNA を鋳型として KOD-plus-（製品番号：ＫＯＤ-201，TOYOBO），プライ マ ー セ ッ ト 5 -GAATTCAGTCTGCCTTTCAACCA-3’ お よ び 5’-GCGGCCGCAGGCAGGCCTGGGTCA-3’（下線は制限酵素 EcoRI および NotI の切断配列を示す）を用いＰＣＲ法にてヒトネクチン４の cDNA を増幅さ せ た 。 得 ら れ た ヒ ト ネ ク チ ン ４cDNA 断 片 を pCNX ２ ベ ク タ ー (46) の EcoRI/NotI クローニング領域に挿入し，ヒトネクチン４発現ベクター， pCNX2-hNectin4 ベ ク タ ー を 作 製 し た 。 pCNX2-hNectin4 ベ ク タ ー を TransIT-LT1（製品番号：MIR2304，Mirus）を用い Vero 細胞に導入すること
により，ヒトネクチン４恒常発現Vero 細胞，Vero/hN4 を作出した。Vero/hN4 は5％FCS DMEM+G418 培地で培養された。いずれの細胞も５％CO2，95％空 気，37℃の条件で培養され，細胞培養プレートで培養する場合は 2 3x105個/ml の細胞密度で，0.5 ml（24 穴プレート），1 ml（12 穴プレート），3 ml（6 穴プ レート）ずつ各穴に加えられ培養された。 2. フローサイトメトリー解析 細胞表面のネクチン４の発現量を確認するために，24 穴細胞培養プレート（製 品番号：3524，Corning）で培養された Vero/hN4 細胞，Vero/dN4 細胞および H358 細胞を 0.1％EDTA-リン酸緩衝液処理にて回収し，ブロッキング液（0.3％ 牛血清アルブミン，0.1％NaN3-リン酸緩衝液）にて処理を行った。その後，一
次抗体として抗ヒトネクチン４ヤギ血清（製品番号：AF2659，R&D system） を，対照血清として正常ヤギIgG（製品番号：500-G00，PEPROTECH）を反 応させた。次に二次抗体としてAlexa Flour488 抗ヤギ IgG ロバ抗体（製品番号： A-11055，Molecular probes）を反応させた後， FACSCalibur フローサイト メーター（Becton Dickinson）により 1ｘ104個の細胞表面上の蛍光を解析した。 3. ウイルス 表１−１に示す 6 株の野外分離ウイルスを実験に用いた（宮崎大学 山口良二 教授より分与）。用いたウイルス株はいずれも，ジステンパー罹患イヌあるいは ジステンパーにより死亡したイヌより Vero.dogSLAMtag 細胞を用いて分離さ れたものであった(32, 33)。Ac96I 株および 007Lm 株については，継代後 3−4 日目の単層培養状態の Vero.dogSLAMtag 細胞に感染多重度（multiplicity of infection: MOI）= 0.02 で接種し，2−3 日培養後上清を回収し，その上清を新た
なVero.dogSLAMtag 細胞に接種することを１−２回繰り返した後，その上清を ストックウイルスとした。それぞれをAc96I-VDS 株，007Lm-VDS 株と名付け た。 H358 細胞馴化ウイルス株を得るために，Ac96I-VDS 株および 007Lm-VDS 株を継代後4 日目の単層培養状態の H358 細胞に MOI= 0.02 で接種した。感染 細胞を 8 代継代した後，セルスクレイパーを用い細胞を掻き取り培養液ごと 3 回の凍結融解を繰り返し，700ｘｇ，20 分，4℃で遠心を行い，その上清をスト ックウイルスとした。それぞれをAc96I-H358 株及び 007Lm-H358 株と名付け た。 4. ウイルス増殖能 24 穴の細胞培養プレート(製品番号：3524，Corning)で 2 日間培養し単層培 養状態となった Vero 細胞，Vero/dN4 細胞，Vero/hN4 細胞および H358 細胞 に，各ウイルス株を MOI=0.01 で接種した。細胞を５％CO2，95％空気，37℃
の条件下で培養し，Vero 細胞，Vero/dN4 細胞および Vero/hN4 細胞では 24， 48，72 及び 96 時間後に，H358 細胞では 1，3，5 および 7 日後に培養上清を 回収した。回収した上清のウイルス力価を後述の「ウイルス力価測定」に従い 測定した。 5. ウイルス力価測定 Vero.dogSLAMtag 細胞を 2 日間培養し単層培養状態とした 6 穴の細胞培養プ レート(製品番号：3506，Corning)から培養液を除いた後，10 倍階段希釈を行 ったウイルス液0.1 ml を接種した。37℃，5％ＣＯ2，95％空気の条件下で１時 間ウイルスを吸着させた後，2％FCS および 0.8％アガロース（製品番号：50013，
IWAI Chemicals）を添加した Eagle’s minimal essential medium（MEM）(製 品番号：05900，NISSUI Pharmaceutical)（0.8% アガロース MEM）を各穴 に3 ml 加えた。接種後７日目に，各穴に 0.01%のニュートラルレッド（製品番 号：N2889，SIGMA）を含む 0.8%アガロース MEM を 2 ml 加え，さらに 2 日 後に形成されたプラックを計測してウイルス力価PFU を算出した。
6. 膜融合実験
Ac96I-VDS 株の H タンパク質発現ベクターを次のように作製した。ストック ウ イ ル ス よ り ウ イ ル ス RNA を，High Pure Viral RNA Kit(製品番号： 11858882001，Roche Applied Science)を用い抽出した。得られたウイルス RNA を鋳型として SuperScriptIII reverse Transcriptase(製品番号：18080044， Invitrogen)を用い cDNA を合成させた後，Prime STAR GXL DNA ポリメラー ゼ （ 製 品 番 号 ：R050A ， Takara-bio ） お よ び プ ラ イ マ ー セ ッ ト 5’- GGACACTTAGTGATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTGGGTG-3’ お よ び ， 5 -CTCCACAGGGTGTCAAGGTTTTGAACGGTTACATGAGA-3’（下線は制 限酵素DraIII の切断配列を示す）を用い PCR にて H 遺伝子を増幅させた。増 幅させた H 遺伝子断片をタンパク質発現ベクターpCA7(77)のマルチクローニ ングサイトにDraIII のクローニングサイトを導入し作製した pCA7-DraIII ベク ターのDraIII クローニング領域に挿入し，H タンパク発現ベクターを作製した。 12 穴の細胞培養プレート（製品番号：3512，Corning）に単層培養状態の Vero 細胞，Vero/dN4 細胞および Vero/hN4 細胞に Ac96I 株の F タンパク発現ベク ター(63)（0.3μg）単独又は作製した H タンパク発現ベクター（0.3μｇ）と共 にTransIT-LT1（製品番号：MIR2304，Mirus）を用い導入した。細胞融合に よる多核巨細胞を容易に観察できるように，Seki らの報告(68)に従い蛍光タン
パク発現ベクター（pCR-FR-mCherry;0.3μg）も，同時に細胞に導入した。発 現ベクター導入48 時間後に，蛍光顕微鏡 Axio Observer D1（Zeiss)を用い細胞 を観察した。
7. イヌジステンパーウイルス H 遺伝子の解析
ストックウイルスよりウイルスRNA を，High Pure Viral RNA Kit（製品番 号：11858882001，Roche Applied Science）を用い抽出した。得られたウイル ス RNA を鋳型として SuperScriptIII reverse Transcriptase (製品番号： 18080044，Invitrogen)を用い cDNA を合成させた後，Prime STAR GXL DNA ポリメラーゼ（製品番号：R050A，Takara-bio）およびプライマーセット CDV-ff1， CDV-HS-2(31)を用いた PCR にて H 遺伝子を増幅させた。得られた PCR 産物 をQIAQuick Gel extraction kit（製品番号：28706，Qiagen)を用い精製し， Big Dye terminator v3.1 cycle Sequencing Kit（製品番号：4337455，Applied biosystems）およびキャピラリーシークエンサー（3130xl ジェネティックアナ ライザ，Applied biosystems）を用いて PCR 産物の塩基配列を決定した。
結果 1. ヒトネクチン４を受容体としたイヌジステンパーウイルス感染の検討 フローサイトメトリーによる解析の結果，作製した Vero/hN4 細胞において ネクチン４の発現が確認された。Vero/hN4 細胞での蛍光のピークは 1x102.0付 近にあり 1x102.8付近にピークを有する Vero/dN4 細胞に比べ低く，Vero/hN4 細胞表面上のネクチン４分子の発現量は Vero/dN4 細胞のそれより少ないこと が示された（図１−３）。
作製したVero/hN4 細胞と Vero 細胞ならびに Vero/dN４細胞に６株のウイル スを接種した結果，Vero/hN4 細胞および Vero/dN4 細胞では全てのウイルス株 接種群で多核巨細胞を形成する細胞変性効果（CPE）が観察された（図１−４）。 一方で，Vero 細胞ではいずれのウイルス接種群においても CPE は観察されな かった。
次に各細胞でのウイルスの増殖能を確認するために，Ac96I-VDS 株および 007Lm-VDS 株を Vero 細胞，Vero/hN4 細胞および Vero/dN４細胞に接種後， 経時的に各培養上清中のウイルス力価を測定した。その結果，両株とも， Vero/hN4 細 胞 ， Vero/dN ４ 細 胞 で ， 感 染 後 96 時 間 目 に お い て 104.9 105.2PFU/ml の力価で増殖した。また，Ac96I-VDS 株では培養期間を通して， Vero/hN4 細胞，Vero/dN４細胞間での増殖性に差は確認できなかったが， 007Lm-VDS 株については Vero/hN4 細胞でのウイルス力価が接種後 72 時間目 まで， Vero/dN4 のそれに比べ約 3 倍高かった。（図１−５）。一方，Vero 細胞 においては両株とも効率的な増殖は確認できなかった。 次に，H タンパク質が多核巨細胞の形成に直接的に関与しているかを確認す るために，H および F タンパク質発現系を用いた膜融合実験を 3 種の細胞（Vero
細胞，Vero/hN4 細胞，Vero/dN4 細胞）で実施した。その結果，いずれの細胞 においても F タンパク質発現ベクター単独では膜融合が観察されなかった（図 １−６）。一方，H タンパク質発現ベクターを同時に導入することにより Vero/hN4 細胞，Vero/dN４細胞では多核巨細胞の形成を伴う膜融合が確認され た。Vero 細胞では膜融合は観察されなかった。観察された多核巨細胞を比較す ると，Vero/dN４細胞における多核巨細胞が，Vero/hN4 細胞で観察されるそれ より大きかった。 2. ネクチン４発現ヒト肺胞上皮細胞におけるイヌジステンパーウイルス の増殖能の検討 前項において，ヒトネクチン４を発現させたVero 細胞において，イヌジステ ンパーウイルスが増殖することが確認できたが，この現象はほ乳動物でのタン パク質発現ベクターを用いて人為的に作製した細胞で観察されたため，ヒトネ クチン４を発現している細胞で同現象を確認する必要がある。そこで，ネクチ ン４を発現しているヒト肺胞上皮細胞 H358 細胞でイヌジステンパーウイルス が増殖可能かを調べた。 フローサイトメトリー解析の結果，H358 細胞での蛍光のピークは 1ｘ101.4 にあり，1ｘ102.0付近にピークを有するVero/hN4 細胞に比べ低く，H358 細胞 表面上のヒトネクチン４の発現量は，Vero/hN4 細胞のそれより少ないことが示 された（図１−７ A）。この H358 細胞における Ac96I-VDS 株および 007Lm-VDS 株の感染後5 日目のウイルス力価は 1ｘ102.0PFU/ml 程度で，他の 4 株のウイル ス力価（1ｘ103.0 １ｘ104.0PFU/ml）と比較して明らかに低かった（図１−７ B）。 次に H358 細胞で十分な増殖が確認されなかった Ac96I-VDS 株および 007Lm-VDS 株について，同細胞に感染させ，感染後 1，3，5，7 日後のウイル
ス力価を測定したところ，007Lm-VDS 株は，ほとんど増殖が確認できなかっ た。また，Ac96I-VDS 株でも，接種 7 日後には僅かながら増殖が確認できたも のの，感染後5 日目までは増殖がほぼ抑制されていた（図１−７ C）。そこで， 両株を感染させたH358 細胞を 8 代継代した後，細胞および上清を 3 回凍結融 解し，遠心後の上清を回収することにより馴化ウイルス Ac96I-H358 および 007Lm-H358 を得た。馴化ウイルス Ac96I-H358 および 007Lm-H358 の H358 細胞での増殖能を確認するために，親株と同様の方法でウイルス増殖を確認し た。その結果，両株とも，7 日目に 105.2PFU/ml の力価を示し，H358 細胞でよ く増殖することが確認された。 3. 親株と馴化株における H タンパク質の塩基配列の比較 Ac96I-VDS 株および 007Lm-VDS の H358 への馴化が，H タンパク質の変化 により獲得された表現系であるかを確認するために，親株であるAc96I-VDS 株 および007Lm-VDS 株，そして各馴化株である Ac96I-H358 株，007Lm-H358 株のH 遺伝子について，PCR ダイレクトシークエンス法により塩基配列を比較 した。その結果，親株と馴化株間で受容体結合能のあるH タンパク質コード遺 伝子の塩基配列の違いは確認できなかった。
考察 本章では，Vero 細胞にヒトネクチン４を発現させた細胞を用いて，イヌジス テンパーウイルスがヒトネクチン４をイヌネクチン４とほぼ同程度受容体とし て感染時に利用できることを示した。 今回，使用したウイルス株は全てイヌあるいはヒトネクチン４を発現させた Vero 細胞に効率よく多核巨細胞を形成させることが確認された（図１−４）。ウ イルスの増殖能についてはAc96I-VDS 株では発現させたネクチン４の動物種差 は認められず，007Lm-VDS 株では接種後７２時間目まではイヌネクチン４発 現細胞でやや増殖が悪かったが，９６時間目では動物種差は認められなかった。 以上，Vero/dN4 細胞と Vero/hN4 細胞間でイヌジステンパーウイルスによる多 核巨細胞の形成の差が認められなかったこと，また，両細胞間でウイルスの増 殖に大きな違いが認められなかったことより，発現させているネクチン４の動 物種間の差によるウイルス感受性の違いはないと考えられた。
Lan ら(32)が報告しているように，Ac96I-VDS 株は Vero 細胞での増殖がほ とんど認められないが，007Lm-VDS 株では，ウイルスは完全には排除されず 感染が成立していることが推察された（図１−５）。これはVero 細胞にイヌジス テンパーウイルスに対する別の受容体があることを示すデータであると考えら れる。しかしながら，Ac96I-VDS 株は Vero 細胞内で殆ど増殖できず，ウイル スは排除されていくことから，本株は 007Lm-VDS 株が利用していると予想さ れる未知の受容体を利用できないと考えられる。このことより，このVero 細胞 上に存在すると考えられる未知の受容体は，イヌジステンパーウイルス共通の 受容体ではなく，ウイルス株特異的な受容体であることが示唆された。 続いてウイルス感染を指標とするのではなく，細胞の受容体とH タンパクと
の結合に引き続き細胞融合が生じていることを確認するため，H および F タン パク質発現系を用いた膜融合実験を行った（図１−６）。その結果，Vero/hN4 細 胞においても，細胞融合が引き起こされ，H タンパク質とヒトネクチン４の結 合性が強く示唆された。Vero/hN4 細胞と Vero/dN４細胞での細胞の融合性を比 較したところ，同じ量の両タンパク質発現ベクターを加えているにも関わらず， Vero/dN４細胞での細胞融合が Vero/hN4 細胞に比して強く出ている像が認め られた。この結果は，H タンパク質とネクチン４の結合能の違いを反映してい るのではなく，図１−３に示した細胞表面上のネクチン４発現量の差に起因する ものと考えられた。 一方で，麻疹ウイルスの細胞レベルでの宿主域を決める要因は受容体の利用 能だけでなく，宿主細胞内の要因もあることが報告されている(26)。そこで，ヒ ト細胞への感染の有無を確認するため，ヒトネクチン４を発現する H358 細胞 でのウイルスの増殖能を調べた（図１−７）。その結果，試験に用いた６株中４ 株のウイルスは H358 細胞でウイルスの増殖が確認された，これらの株はヒト ネクチン４を受容体として利用し，ヒト細胞内で効率よく増殖が可能であるこ とが示された。一方で，Ac96I-VDS 株および 007Lm-VDS 株は同細胞での増殖 が強く抑制され，H358 細胞において両株は，ウイルスの増殖のいずれかの段階 で抑制されていると考えられた。そこで，両株を H358 細胞で増殖が可能とな るように馴化させ，馴化の過程でH タンパク質の遺伝子配列に変化が生じるか を確認した。この結果，両株とも馴化の過程でH タンパク質の遺伝子変化は認 められなかったことから，馴化のメカニズムには受容体の結合性の変化と関連 性がないと考えられた。このことは，イヌジステンパーウイルスが細胞に侵入 した後，細胞内での複製能力が株間で違うことを示唆するものである。 以上，イヌジステンパーウイルスはヒトネクチン４を受容体として利用し，
細胞への感染を成立させることを示すことができた。さらに，ネクチン４発現 ヒト由来細胞において増殖が抑制されるイヌジステンパーウイルスの解析から， 受容体結合性とは異なる細胞内の増殖要因の存在が示唆された。
第２章：H358 馴化ウイルスの馴化にかかわるウイルス側の因子の探索 序論 第１章ではイヌジステンパーウイルス野外株がヒトネクチン４を受容体とし て利用できることを示した。一方で，Ac96I-VDS 株および 007Lm-VDS 株の２ 株はヒトネクチン４を発現する H358 細胞での増殖が強く抑制されていた。し かし，両株とも H358 細胞で８代継代することにより容易に H358 細胞で増殖 する馴化ウイルスを得ることができた。この馴化はウイルスの受容体結合タン パクであるH タンパク質をコードする遺伝子の変異を伴うものでなかった。こ のことより，馴化の仕組みはH タンパク質の受容体結合能に起因するものでは なく，細胞内でのウイルスの複製能力の違いによると推測された。 パラミクソウイルス属の宿主域を決定する因子として，受容体利用能以外に 宿主細胞の自然免疫に対抗する機能の有無が報告されている(22, 23, 28)。また， それ以外のウイルス側の要因により細胞レベルでの宿主域が規定されている可 能性もある。 そ こ で 本 章 で は ，H358 細 胞 に お け る Ac96I-VDS 株 と 馴 化 ウ イ ル ス Ac96I-H358 株，007Lm-VDS 株と馴化ウイルス 007Lm-H358 株間での複製能 力の違いを規定するウイルス側の因子を特定するため，両ウイルスの親株と馴 化株の遺伝子配列を次世代シークエンス解析によりウイルスの集団（準種）と して遺伝子変化（アミノ酸置換）を比較・解析した。
材料および方法
1. 次世代シークエンス解析
第 一 章 と 同 様 の 方 法 で 継 代 後 2 日 間 培 養 し ， 単 層 培 養 状 態 と な っ た Vero.Dog.SLAMtag 細胞に Ac96I-VDS 株および 007Lm-VDS 株を MOI=0.01 で接種し 2 日間培養した上清，ならびに継代後 2 日間培養し単層培養状態とな ったH358 細胞に Ac96I-H358 株および 007Lm-H358 株を MOI=0.01 で接種し ６日間培養した上清を回収した。回収したウイルス上清を1/5 量の 30 w/v %シ ョ糖 NTE 緩衝液（0.1M NaCl，0.01M Tris，1mM EDTA，pH7.4）の上にの せ，185,000 ｇ，4℃，2 時間遠心を行った。沈殿として得られた精製ウイル スから，Isogen（製品番号：371-02503，NIPPON Gene）を用いウイルス RNA を抽出した。ウイルスRNA より Scriptseq v2 RNA-Seq Library Preparation Kit（製品番号：SSV21106，Epicentre Biotechnologies）を用いて RNAseq ラ イブラリーを作製した。Pair-end short reads によるディープシークエンスは MiSeq (illmina)および GAIIｘ system（illmina）を用い解析を行った。得られ た塩基配列について，007Lm 株の全塩基配列（Acc.No.AB474397.1）を参照配 列として，BWA マッピングツール(34)を用い解析した後，各塩基のバリエーシ ョンをカウントした。得られたマッピングデータの可視化には GenomeJack viewer (Mitsubishi Space softwear)を用いた。
2. ダイレクトシークエンス法による P 遺伝子の解析
各ウイルス株よりウイルスRNA を，High Pure Viral RNA Kit（製品番号： 11858882001，Roche Applied Science）を用い抽出した。得られたウイルス RNA を鋳型として SuperScriptIII reverse Transcriptase (製品番号：18080044，
Invitrogen)を用い cDNA を合成させた後，Prime STAR GXL DNA ポリメラー ゼ （ 製 品 番 号 ： R050A ， Takara-bio ） お よ び プ ラ イ マ ー セ ッ ト 5’-ACCAGTGAAGAGAGTTTCTCCTGTC-3’ ， 5’-GATCCAAATGTTCTTCCAATCGG-3’を用い PCR にて P 遺伝子を増幅させ た。得られたPCR 産物を QIAQuick Gel extraction kit（製品番号：28706， Qiagen）を用い精製し，Big Dye terminator v3.1 cycle Sequencing Kit（製品 番号：4337455，Applied biosystems）およびキャピラリーシークエンサー （3130xl ジェネティックアナライザ，Applied biosystems）を用いて PCR 産物 の塩基配列を決定した。これら塩基配列より，C タンパク質および V タンパク 質の推定アミノ酸配列を決定した。 3. 膜融合実験 007Lm-VDS 株の H タンパク質発現ベクターを次のように作製した。ストッ クウイルスよりウイルス RNA を，High Pure Viral RNA Kit（製品番号： 11858882001，Roche Applied Science）を用い抽出した。得られたウイルス RNA を鋳型として SuperScriptIII reverse Transcriptase (製品番号：18080044， Invitrogen)を用い cDNA を合成させた後，Prime STAR GXL DNA ポリメラー ゼ （ 製 品 番 号 ：R050A ， Takara-bio ） お よ び プ ラ イ マ ー セ ッ ト 5’- GGACACTTAGTGATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTGGGTG-3’ お よ び ， 5 -CTCCACAGGGTGTCAAGGTTTTGAACGATTACATGAGA-3’ （ 下 線 は DraIII の切断配列を示す）を用い PCR にて H 遺伝子を増幅させた。増幅させ た H 遺伝子断片を第 1 章「膜融合実験」で使用したタンパク質発現ベクター pCA7-DraIII の DraIII クローニング領域に挿入し，H タンパク発現ベクターを 作製した。作製した007Lm-VDS 株 H タンパク質発現ベクターと，第 1 章で使
用したAc96I 株の F タンパク質発現ベクターを用い，第 1 章「膜融合実験」の 方法に従い，膜融合実験を実施した。
結果 1. Ac96I-VDS 株馴化過程におけるウイルス遺伝子の変異 表２−１および図２−１ A に Ac96I-VDS 株と Ac96I-H358 株間でのウイルス の塩基配列の獲得変異あるいは，存在比率（各塩基番号における総リード数を 分母とし，各塩基リード数を分子として算出する百分率）の変動が生じた塩基 のうち，15％以上比率の変動が確認された塩基を示した。表に示すように馴化 の過程で15％以上の存在比率が変動した塩基は 13 塩基あった。このうち 10 塩 基についてはアミノ酸置換を誘導する変化であり，N 遺伝子上に 3 箇所，M 遺 伝子上に4 箇所，P 遺伝子，F 遺伝子，L 遺伝子上に各 1 箇所存在した。この中 で最も存在比率が変動したのはP 遺伝子上に存在する 2198 番目の塩基であった。 Ac96I-VDS 株の 2198 番目の塩基は 91%がチミン（T），残りの 9％がシトシン （C）であるのに対し，馴化株である Ac96I-H358 株では全て C に変化してい た。このP 遺伝子の変化により，P タンパク質および V タンパク質の 133 番目 のアミノ酸が，Ac96I-VDS 株では 91%がバリン，9%がアラニンをコードして いたのに対し，Ac96I-H358 株ではアラニンをコードするもののみとなった。こ のP 遺伝子の変異により，C タンパク質のアミノ酸にも置換が生じ，Ac96I-VDS 株では126 番目のアミノ酸に相当する箇所が終止コドンとなるものが 91％，残 り9%がグルタミンをコードしているのに対し，Ac96I-H358 株では全てがグル タミンとなっていた。 2. 007Lm-VDS 株馴化過程におけるウイルス遺伝子の変異 表２−２および図２−１ B に 007Lm-VDS 株と 007Lm-H358 株間でのウイル スの塩基配列の獲得変異あるいは，存在比率の変動が生じた塩基のうち，表２−
１と同様に15％以上比率の変動が確認された塩基を示した。007Lm-VDS 株の 馴化過程では，6 箇所の塩基の比率変動が認められた。このうち 3 箇所はアミノ 酸置換を伴うものであった。アミノ酸置換を伴った変異は，P 遺伝子上，H 遺 伝子上およびF 遺伝子上に各１箇所あった。P タンパク質の 267 番目のアミノ 酸が 007Lm-VDS 株ではメチオニン（48%）とバリン（52%）がほぼ同じ比率 で存在するのに対し，007Lm-H358 株では殆どがバリン（97%）となっていた。 このP 遺伝子の変異により，V タンパク質の 267 番目のアミノ酸も親株ではチ ロシン（48%）とシステイン（52%）がほぼ同じ比率で存在するのに対し，馴化 株ではその殆どがシステイン（97%）であった。また，F タンパク質の 116 番 目のアミノ酸がシステインからチロシンに，H タンパク質の 548 番目のアミノ 酸がメチオニンとトレオニンがほぼ同じ比率で混在していたものが，馴化の過 程により全てトレオニンに置換されていた。 3. C タンパク質のアミノ酸配列比較 Ac96I-VDS 株において，C タンパクの 126 番目のアミノ酸に相当する箇所に 終止コドンが入っていることが，次世代シークエンス解析の結果から判明した。 この終止コドンによりAc96I-VDS 株は Ac96I-H358 株に比してカルボキシル末 端が短い C タンパクを有することが明らかとなった。そこで，C タンパク質に おけるカルボキシル末端欠損が他の野外ウイルス株でも生じているのか確認す るため，第１章で用いたウイルス株のP 遺伝子の塩基配列を PCR ダイレクトシ ークエンス法により決定した。決定された塩基配列より予想される C タンパク 質のアミノ酸配列を得て，各株間での比較を行った（図２−２）。この結果， Ac96I-VDS 株を除いた各株（007Lm-VDS 株，82Con 株，55L 株，M24Cr 株， Th12 株）全てが，174 アミノ酸残基より構成される C タンパクを有していた。
一方，Ac96I-VDS 株のみが，2198 番目の塩基が T に変化することで生じた終 止コドンにより，カルボキシル末端が欠損した125 残基より構成される C タン パクを有することが明らかとなった。 4. 007Lm-VDS 株の H タンパク質を用いた膜融合実験 次世代シークエンス解析の結果，007Lm-VDS 株と 007Lm-H358 株の H タン パク質の 548 番目のアミノ酸において，大きな比率の変動が認められていた。 すなわち，親株ではメチオニンとトレオニンがほぼ同じ比率で存在していたの に対し，馴化株では全てがトレオニンに置換されていた。H タンパク質は受容 体結合性を有するため，この変異がヒトネクチン４の利用能に差を与えるか確 認する必要が有る。そこで，H タンパク質の 548 番目のアミノ酸がメチオニン である007Lm 株 H タンパク質発現ベクター（548Met）および 548 番目のアミ ノ酸がトレオニンである H タンパク質発現ベクター（548Thr）と Ac96I-VDS 株の F タンパク質発現ベクターを用いた膜融合実験を行った。その結果，F タ ンパク質発現ベクター単独では膜融合が確認されなかった（図２−３)。一方，同 時に 548Met または 548Thr 導入することにより Vero/hN4 細胞および Vero/dN4 細胞では膜融合が観察された。Vero 細胞では H および F タンパク質 発現ベクターを同時に導入しても膜融合は観察されなかった。
考察 本章では，H358 細胞で増殖が抑制されたウイルス株 Ac96I-VDS 株および 007Lm-VDS 株とそれらを親株として H358 細胞で増殖可能となった馴化ウイ ルスAc96I-H358 株および 007Lm-H358 株の合計４株を次世代シークエンスに より解析を行った。得られた遺伝子情報より，ウイルスの集団（準種）として 遺伝子変化（アミノ酸置換）を確認し，H358 細胞においてウイルスの複製が可 能となったウイルス側の因子を検討した。 次世代シークエンス解析の結果，Ac96I-VDS 株においては H タンパク質遺伝 子上には馴化の過程で変異は認められず，本株の馴化にH タンパク質の受容体 への結合能が影響しないことを示すことができた。このことは第 1 章で述べた イヌジステンパーウイルスはヒトネクチン４を受容体として利用できるという という結論を支持するものであると考えられた。 Ac96I-VDS 株の馴化過程で最も大きく変化したのは P 遺伝子上の 2198 番目 の塩基の変化であった（表１−１）。P 遺伝子は P タンパク質以外に非構造タン パク質であるC および V タンパク質をコードしている。C および V タンパク質 は培養細胞でのウイルス複製には必須ではないが，宿主の自然免疫に対する対 抗機能を有するタンパク質である(17, 44, 60, 69)。Ac96I-VDS 株の殆ど（91%） は 2198 番目の塩基がチミンであり，それによりカルボキシル末端欠損の C タ ンパク質を有していた (図２−２)。一方，馴化株である Ac96I-H358 株の C タン パク質は完全長である 174 残基を有するものだけであった。これらのデータか ら完全長のC タンパク質の発現は H358 細胞でのウイルス複製に重要であるが， Vero/hN4 並びに Vero.dogSLAMtag では重要でないことが示唆された。麻疹ウ イルスの報告では麻疹ウイルスのC タンパク質を 157 番目以降のアミノ酸から
欠損させると宿主のインターフェロンに対抗する機能を失うと報告されている (44)。また，Vero 細胞で増殖させた麻疹ウイルスにおいてはカルボキシル末端 欠損C タンパク質や，C タンパク質にアミノ酸置換を引き起こす変異が P 遺伝 子上に生じることが知られている(38, 76, 80)。さらに，Vero 細胞はインターフ ェロン産生能が欠損しているが(11, 20)，H358 細胞はインターフェロン産生機 構を有することが報告されている(25)。これらのことを考慮すると，Ac96I-VDS 株がカルボキシル末端欠損 C タンパク質を有する理由として，自然界で得たと いうより，ウイルスを分離継代する際に Vero.dogSLAMtag を用いたために生 じたと考えられる。 以上，C タンパク質が Ac96I-H358 株の H358 細胞での増殖に重要な役割を 果たしている可能性を示した。一方，C タンパク質以外の変異も H358 細胞で の増殖に影響を及ぼしている可能性も否定できない。次世代シークエンス解析 の結果より H358 細胞での増殖能に影響を与える可能性があるアミノ酸置換を 伴う遺伝子の変化がN および M タンパク質をコードする遺伝子上に存在してい た。それらのアミノ酸置換はN タンパク質では，129 番目の残基がロイシンか らバリンに 296 番目がイソロイシンからメチオニンに，467 番目がグルタミン 酸からリジンへの変化でであった。M タンパク質においては，84 番目がトレオ ニンからプロリンに，178 番目がフェニルアラニンからロイシンに，206 番目が アスパラギンからアスパラギン酸に変化していた。麻疹ウイルスの研究では， M タンパク質の変異が宿主ではない種の培養細胞での増殖に影響するという報 告がある(18, 38, 72, 73)。それゆえ，Ac96I-H358 株における M および N タン パク質の変異がヒト細胞での増殖に影響するか否かについては今後の課題であ る。 他にも，M タンパク質の 329 番目の残基がロイシンからグルタミンに，F タ
ンパク質の331 番目がアルギニンからプロリンに，L タンパク質の 1748 番目が アスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換が確認された。しかしなが ら，これら３箇所の変異は，Ac96I-VDS 株での主要なアミノ酸であったものが （72-84％），馴化により 100％の比率になっただけであるため，H358 細胞での 増殖に影響を与えないと予想された。 007Lm-VDS 株の馴化過程では，次世代シークエンス解析の結果より H タン パク質をコードする遺伝子上に 50％近い存在比率の変動が確認された（表２− ２）。その箇所は8721 番目の塩基であり，この変異は H タンパク質においてア ミノ酸置換を引き起こすものであった。この8721 番目の塩基の存在比率が変動 することにより，親株ではH タンパク質の 548 番目の残基がトレオニン 52%， メチオニン 48％の比率で混在していたものが，馴化株である 007Lm-H358 株 では100％トレオニンに置換されていた。この H タンパク質 548 番目のアミノ 酸の変化がヒトネクチン４の利用能に影響するかを膜融合実験で確認をした。 その結果，548 番目のアミノ酸がトレオニンであってもメチオニンであっても， Vero/hN4 細胞で細胞融合が確認されたことから（図２−３），この変異は H タ ンパク質のヒトネクチン４への結合能に影響しないと考えられた。H タンパク 質の機能が受容体への結合であることを考慮すると，ヒトネクチン４への結合 能に影響を与えない8721 番目の塩基の存在比率の変動は，007Lm-VDS 株にお けるH358 細胞での増殖に影響を与えないと予想された。 H タンパク質のアミノ酸置換以外に，P 遺伝子および F 遺伝子上にアミノ酸 置換を伴う遺伝子配列の変異が確認された。P 遺伝子上の変異は 2599 番目の塩 基であり，007Lm-VDS 株ではアデニンが 48％，グアニンが 52％の比率で存在 していた。2599 番目の塩基は P タンパク質だけでなく V タンパク質もコードす る領域であり，この塩基に変異が入ることによりP および V タンパク質のアミ
ノ酸配列が変化することが予想された。P 遺伝子上の 2599 番目の塩基がアデニ ンであれば，P タンパク質の 267 番目のアミノ酸がメチオニンに，グアニンで あればバリンをコードする。V タンパク質においては，2599 番目の塩基がアデ ニンであれば V タンパク質の 267 番目のアミノ酸がチロシン（Tyr267）に，グ アニンであればシステイン（Cys267）をコードする。図２−４に示すようにCys267 はパラミクソウイルス科のウイルス間で高度に保存されている V タンパク質の ７個のシステイン残基の一つに相当し(84)，Zinc finger ドメインを形成するの に重要な残基である(35)。それゆえ，Cys267が Tyr267に置換されるとドメイン の構造を維持できず，V タンパク質の機能が失われると考えられた。パラミク ソウイルスのV タンパク質の機能として C タンパク質と同様に宿主の自然免疫 機構への対抗能が知られており(13)，Cys267がH358 細胞での増殖に重要な役割 を果たしている可能性が示された。007Lm-VDS 株の V タンパク質が Tyr267を 有する理由として，ウイルスを分離継代する際に Vero.dogSLAMtag を用いた ために生じた可能性が考えられる。つまりIFN 産生能を欠く Vero.dogSLAMtag での増殖時には抗自然免疫機能が不要であるため，分離継代過程において， 007Lm 株の分離材料中に存在していた V タンパク質の抗自然免疫機能が失われ たクローンが選択されたか，あるいはCys267からTyr267への置換が，IFN 系の
自然免疫機能の働かない細胞内でのウイルス増殖に有利であるために生じた可 能性が考えられた。 F タンパク質の変異は 5281 番目の塩基が親株では殆どがグアニンであるの対 し，馴化株ではグアニンが23％，アデニンが 76％の比率となっていた。この変 異によりF タンパク質の 116 番目の主要なアミノ酸がシステインからチロシン へと置換されていた。F タンパク質はウイルスの引き起こす膜融合において重 要な役割を果たすことより，この変異がウイルスの H358 細胞への馴化に影響
するか否かの検討は今後の課題である。 近年，麻疹ウイルスの分離にVero/ｈSLAM 細胞，イヌジステンパーウイルス の分離にVero.dogSLAMtag などのように Vero 細胞由来の培養細胞で多くのウ イルス分離が行われている(50, 67)。確かにインターフェロン産生能を欠いてい るVero 細胞およびその関連細胞を用いることは，ウイルスの分離にとっては優 位性があると考えられる。一方で，宿主細胞の自然免疫に対する対抗機能が低 いクローンを選択的に分離することや，分離の過程で自然免疫への対抗機能を 失う変異を獲得させてしまう危険性がある。本章で解析したイヌジステンパー ウイルス２株も，本来自然免疫対抗機能を有するＣあるいはＶタンパク質に特 徴的な変異が確認されており，この変異はウイルス分離に Vero.dogSLAMtag 細胞を用いたために生じたことも推測された。この点を考慮すると，ウイルス の病原性を評価する場合，ウイルスの分離は H358 細胞のようなインターフェ ロン産生機構が働いている細胞を使用することが望ましいと考えられた。 本章では，H358 細胞で増殖が抑制されていたウイルス株がどのような過程で H358 細胞での増殖が可能となったのかを，次世代シークエンスによる解析を行 い検討した。その結果，Ac96I-VDS 株では C タンパク質の欠損が，007Lm-VDS 株では V タンパク質の変異が，H358 細胞での増殖抑制に影響しており，これ らの変異が解消されることにより増殖が可能となることを示すデータを得た。 このことは，イヌジステンパーウイルスのアクセサリータンパクが H358 細胞 の自然免疫系に対抗する機構を有するという，新たな情報を提供できた。
表 2 -1 Ac 9 6 I-VD S 株から Ac 9 6 I-H3 5 8 株への馴化過程で生じ た 変異 Ac 96I -VD S Ac 96I -H358 総リ ー ド 数 存在 比率 (% ) 総リ ー ド 数 存在比率 (% ) アミ ノ 酸 置 換 遺伝子 塩基番号 A C G T A C G T タン パ ク 質 N 792 349 0 0 0 100 138 0 0 75 a 25 N L229V N 974 541 0 1 0 99 148 0 32 0 68 N - N 995 340 0 0 0 100 116 0 0 43 57 N I296M N 1506 100 0 0 100 0 33 18 0 82 0 N E467K P/ V /C 2198 1024 0 9 0 91 101 0 100 0 0 P and V V 133A C 126Q b M 3681 364 98 0 2 0 73 78 22 0 0 M T84P M 3965 63 0 0 0 100 46 50 0 0 50 M F178L M 4047 48 100 0 0 0 37 73 0 27 0 M N206D M 4417 81 84 0 0 16 31 100 0 0 0 M L329Q F 5926 196 0 78 22 1 61 0 100 0 0 F R331P F 6074 167 26 0 74 0 37 97 0 3 0 F - L 9107 194 2 0 98 0 23 17 0 82 0 L - L 14271 39 72 0 28 0 50 100 0 0 0 L D1748N a 下線は 獲得又は選択されてきた塩基を示す b 126 番目の終止コドンがグルタミンに置換された
表 2 -2 007Lm -VD S 株から 007Lm -H358 株への馴化過程で生じた変異 007Lm -VD S 株 007Lm -H358 株 総リ ー ド 数 存在 比 率 (% ) 総リ ー ド 数 存在 比 率 (% ) アミ ノ 酸 置 換 遺伝子 塩基番号 A C G T A C G T タン パ ク 質 P/ V 2599 5725 48 0 52 0 1155 3 0 97 a 0 P M267V V Y 267C F 5281 171 1 0 99 0 56 76 0 23 0 F C116Y F 6885 583 0 9 0 90 459 0 76 0 24 F - H 872 1 42 0 52 0 48 72 0 100 0 0 H M548T L 13079 1760 46 0 53 0 440 3 0 97 0 L - L 14939 1251 89 0 11 0 467 12 0 88 0 L - a 下線は獲得又は選択されてきた塩基を示す
第 3 章：イヌジステンパーウイルス V タンパク質の機能の検討 序論 第 2 章では H358 細胞で増殖出来なかったウイルスは，アクセサリータンパ ク質であるC または V タンパク質に変異があることを示した。さらに，これら の変異によりアクセサリータンパク質の機能の一つである自然免疫への対抗機 構が充分に働かないため，インターフェロン産生能を有する H358 細胞での増 殖が抑制されている可能性を示した。 第 2 章で検討したウイルスのうち，007Lm-VDS 株はパラミクソウイルス科 のウイルスで高度に保存されている V タンパク質のシステイン残基に変異が生 じていた。麻疹ウイルスの V タンパク質はそのカルボキシル末端が病原体を認 識する宿主因子であるmad-5 と相互作用することにより，自然免疫機構である 1 型インターフェロン（IFN）の産生を抑制することが報告されている(12, 55, 75)。また，1 型 IFN が細胞表面上の受容体に結合することで活性化される JAK-STAT 経路を麻疹ウイルスの V タンパク質が抑制し，この経路を介して転 写が促進される抗ウイルスタンパクの発現を抑制する機能を有することも報告 されている(8, 9, 49, 79)。このように麻疹ウイルスの V タンパク質は宿主の自然 免疫系のIFN 誘導系および産生された IFN により活性化される IFN 応答系を 共に阻害し，自然免疫に対抗する機能を有している。
そこで，本章ではイヌジステンパーウイルスの V タンパク質がヒト肺胞上皮 細胞由来の H358 細胞において，細胞の自然免疫に対抗する機能を有している のか否かの検討を行った。さらに，V タンパク質が宿主の自然免疫に対する対 抗機能を有するとするのであれば，どの段階で対抗機能を有するのかを，
007Lm-VDS 株および 007Lm-H358 株由来の V タンパク質を H358 細胞に恒常 的に発現させた細胞を用いて検討を行った。
材料および方法 1. 細胞とウイルス
H358 細胞および Vero.DogSLAMtag 細胞は第 1 章に示す条件で培養された。 ヒトSLAM 発現 Vero 細胞である Vero/hSLAM 細胞(50)も Vero.DogSLAMtag 細胞と同条件で培養された。イヌジステンパーウイルスV タンパク質発現 H358 細胞は以下のように作製された。007Lm-VDS 株よりウイルス RNA を High Pure Viral RNA Kit（製品番号：11858882001，Roche Applied Science）を用 い抽出した。得られたウイルス RNA を鋳型として SuperScriptIII reverse Transcriptase (製品番号：18080044，Invitrogen)を用い cDNA を合成させた 後，Prime STAR GXL DNA ポリメラーゼ（製品番号：R050A，Takara-bio）
を お よ び プ ラ イ マ ー セ ッ ト 5’- GGAATTCATGGCAGAGGAGCAGGCCTATCATG-3’ ， 5’- CCCCAAGCTTTTAAGCATGTGTGATACTCTTGA-3’（下線は制限酵素 EcoRI およびHindIII 切断配列を示す）を用い PCR 法にて V タンパク質 cDNA 断片 を得た。得られたV タンパク質 cDNA 断片を pcDNA3.1(-)-V5 ベクター(29)の EcoRI/HindIII クローニング部位に挿入し，イヌジステンパーウイルス V タン パク質発現ベクターを作製した。pcDNA3.1(-)-V5 ベクターは発現させるタンパ ク質のアミノ末端側にV5 タンパク質をタグとして付加するベクターである。作 製したV タンパク質発現ベクターより，V タンパク質の 267 番目のアミノ酸が システイン（V-Cys267）およびチロシン（Try267）をコードするクローンを選択 し，それぞれをpcDNA3.1(-)-V-Cys267およびpcDNA3.1(-)-V-Tyr267と名付けた。
pcDNA3.1(-)-V-Cys267および pcDNA3.1(-)-V-Tyr267 をそれぞれ TransIT-LT1
（製品番号：MIR2304，Mirus）を用い H358 細胞に導入することにより，V タンパク質恒常発現 H358 細胞クローン，H358-V-Cys267-5，H358-V-Cys267-6
およびH358-V-Tyr267-11 を作製した。作製した V タンパク質発現細胞は 10％ FCS 添加 RPMI-1640（製品番号：22400，Invitrogen）に 1 mg/mlG418（製品 番号：10131，Invitrogen）添加した培地を用い培養された。イヌジステンパー ウイルス007Lm-VDS 株は第１章で使用したものを用いた。麻疹ウイルス V タ ンパク質の機能と同様の機能をイヌジステンパーウイルスの V タンパク質が有 するかを確認するために，V タンパク質欠損 EGFP 発現麻疹ウイルス（MVΔV） としてIkegame ら(25)が報告したものを使用した。 2. ウイルス増殖能 24 穴の細胞培養プレート（製品番号 3524，Corning）で 2 日間培養し単層培 養状態となったH358-V- Tyr267-11，H358-V- Cys267-6 および H358 細胞に，各 ウイルス株を MOI=0.01 で接種した。細胞を 37℃，5％CO2，95％空気の条件 下で 5 日間培養し，培養上清を回収した。回収した上清のウイルス力価を Vero.dogSLAMtag 細胞（007Lm-VDS 株）または Vero/hSLAM 細胞（MVΔV ウイルス）を用いて後述の「ウイルス力価測定」に従い測定した。 3. ウイルス力価測定 イヌジステンパーウイルスの力価測定は第1 章で示した方法を用いて行った。 MVΔV ウイルスの力価測定には，24 穴の細胞培養プレート（製品番号 3524， Corning） で 2 日間培養し単層培養状態となった Vero/hSLAM 細胞を用いた。 細胞培養プレートから培養液を除いた後，10 倍階段希釈を行ったウイルス液 0.1 ml を接種した。37℃，5％CO2，95％空気の条件下で１時間ウイルスを吸着さ せた後，2％FCS および 0.8％アガロース（製品番号：50013，IWAI Chemicals） を添加したMEM 培地（製品番号：05900，NISSUI Pharmaceutical）を各穴
に3 ml 加え，37℃，5％CO2，95％空気の条件下で培養した。接種 48 時間後に，
EGFP を発現するフォーカスを蛍光顕微鏡観察下（Axio Observer D1，Zeiss） で計測し，ウイルス力価FFU を算出した。
4. ウエスタンブロッティング
12 穴の細胞培養プレート（製品番号 3512，Corning） で 2 日間培養し単層 培養状態のH358-V-Tyr267-11，H358-V-Cys267-5，H358-V-Cys267-6 および H358
細胞を溶解緩衝液（150mM NaCl，10mM Tris-HCl pH7.4，1% Triton X-100， 1% sodium deoxycholate，0.1% SDS）に溶解し，得られた溶解液を 15,000 x g， 5 分，4℃で遠心分離を行った。遠心上清に等量のトリス SDS β-ME サンプル 処理液（製品番号：423437，COSMO BIO）を加え，95℃，5 分の加熱処理後， ポリアクリルアミド電気泳動を行った。泳動分離後，ゲル中のタンパク質をニ トロセルロース膜（製品番号：RPN303D，GE Healthcare）に転写した。転写 後，ニトロセルロース膜に，一次抗体として抗 V-5 マウスモノクローナル抗体 （製品番号：R960-25，Invitrogen）および抗チューブリンマウスモノクローナ ル抗体（製品番号：T5168，SIGMA）を反応させた後，二次抗体として西洋ワ サビペルオキシダーゼ標識抗マウス二次抗体（製品番号：55564，Cappel）を 反応させた。化学発光には ECL Advance Western blotting Kit（製品番号： RPN2135 ， GE Healthcare ） を 使 用 し ， 化 学 発 光 シ グ ナ ル 検 出 に は LAS-1000plus image analyzer（Fuji Film）を用いた。
5. 免疫染色による IRF3 （IFN-regulatory factor 3）核移行の検出 コラーゲンI コートカバーガラス（製品番号：4912-010，AGC Techno Glass） 上で2 日間培養し，単層培養状態となった H358-V-Tyr267-11，H358-V-Cys267-6
およびH358 細胞に 007Lm-VDS 株を MOI=0.1 で接種した。接種 48 時間後に 4％パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝液（PBS）を用い感染細胞を固定後， 0.5%Triton-X 含有 PBS 処理にて膜透過処理を行った。固定した細胞を PBS で 洗浄し，一次抗体として抗イヌジステンパーウイルスサル抗体および抗ヒト -IRF-3 マウス抗体（製品番号：550428，BD Biosciences），二次抗体として Alexa Fluor488 抗ヒト IgG ヤギ抗体 (製品番号：A11013，Molecular Probes)および Alexa Fluor 594 抗マウス IgG ロバ抗体 (製品番号：ab150108，Abcam)を二次 抗 体 と し て そ れ ぞ れ 反 応 さ せ た 。 ま た 細 胞 の 核 染 色 の た め diamidino-2-phenylindole (DAPI)（製品番号：D9542，SIGMA）による染色も 同時に行った。染色後，FV1000D 共焦点レーザー顕微鏡（Olympus）により観 察し，得られたデータをFV10-ASW（Olympus）および ImageJ softwear（NIH） を用い解析を行った。 6. RT-PCR による IFN 活性化遺伝子群（ISGs）転写量の定量 6 穴の細胞培養プレート（製品番号：3506，Corning） で 2 日間培養し単層 培養状態となったH358-V-Tyr267-11，H358-V-Cys267-6 および H358 細胞を 100 ユニット/ml のヒト IFN-β（商品名：フェロン，Toray）で処理を行った。IFN-β処理後0，2，4，8 時間後に Trizol（製品番号：15596-018，Invitrogen）に より細胞からトータルRNA を抽出した。トータル RNA より Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit（製品番号：04379012001，Roche Applied Science） およびランダムヘキサマーを用いてcDNA を合成した。定量的 PCR は合成した cDNA を鋳型として，LightCycler 480 Probe master（製品番号：04887301001， Roche Applied Science ）， universal probe library （ 製 品 番 号 ： 04688996001(ISG15) ， 04689020001(OAS1) ， 04685075001(ISG56) ，
04688589001(GAPDH)，04688961001(HPRT1)，Roche Applied Science）お よびライトサイクラー480 (Roche Applied Science)を用い，これらのプロトコ ールに従い行われた。IFN 活性化遺伝子の ISG15，OAS1 および ISG56 の cDNA はGAPDH 又は HPRT1 遺伝子を用いて標準化した後定量された。
