用いいたたココララーーゲゲンン配配向向測測定定

(1)

Osaka University

生

生体体組組織織のの非非線線形形光光学学効効果果をを   用

用いいたたココララーーゲゲンン配配向向測測定定

阪

阪大大院院・・基基礎礎工工、、奈奈良良医医大大

^*^*))

   安

安井井武武史史、、佐佐々々木木邦邦彦彦、、荒荒木木勉勉、、東東野野義義之之

^*^*))

第30回レーザー顕微鏡研究会シンポジウム

『生体の無染色イメージング』

(2)

イントロ

コ

コララーーゲゲンン配

配向向測測定定

従来法）解剖学的手法＠生検組織（電顕観測、X線回折他）

�� 非非侵侵襲襲・・非非破破壊壊・・非非接接触触・・３３次次元元空空間間分分布布

・超短パルス光との非線形相互作用

・コラーゲンから特異的に発生

・コラーゲンの密度や配向に敏感

第

第２２高高調調波波発発生生光光 ((生生体体SSH H G G 光光））コ

コララーーゲゲンン

生体構造タンパク質：生体組織の骨組み

� � � � � � � � 並並びび方方（（ココララーーゲゲンン配配向向））がが重重要要

� � � � � � � � � � 生体組織の形態的及び機能的特性

生

生体体ココララーーゲゲンンのの非非線線形形光光学学特特性性

ヒ

ヒトト組組織織ココララーーゲゲンン線線維維配配向向のの３３次次元元分分布布

�� ＠＠SS HHGG 偏偏光光解解析析&&SSHH GG イイメメーージジンンググ

Present talk

T. Yasui et al, Appl. Opt., Vol. 43, pp. 2861-2867 (2004).

T. Yasui et al, J. Biomed. Opt., Vol. 9, pp. 259-264 (2004).

ref) S. Roth et al, J. Chem. Phys. 70, pp.1637-1643 (1979).

☞SS HHGG 偏偏光光解解析析法法

(3)

SHG光とは？

^�

(f�r�e� �q�. �=� � f�)� � ^f� 2�f�

フェムト秒�

�ルスレー�ー�

音

光�

線�� 線��

音�

さ��

CW光�

�中��質� �中��質�

超短�

�ルス光�

��光� ��光�

�）��コラーゲン�

(4)

生体ＳＨＧ光発生の原理

Coherent

enhancement ! Constructive interference

+ + + + + +

==･･････

SHG seed (collagen)

1/µs

Biological tissue

Backscattered SHG light

SHG light

SHG phase matching is impossible in tissue!

N

Noo--PPMM SSHHGG condition

δ:散乱光路長=1/µs (µs散乱係数)=20~50µm@tissue l_c : コヒーレンス長= l^ω/[2*(n₂_ω- n_ω)] =5~13µm@tissue ω:角周波数, A:照射エリア

P: 入射パワー, n=(nω+n2ω)/2, d: 平均非線形光学定数

P_2ω = 8 µ₀ ε₀

%

&

' (

) *

3

2ω²_d²δ² n³ P_ω²

A sin²(πδ_/l_c)

πδ_/l_c

(1) l_c>δδ

(2) δδ/l_c≠≠1, 2, ..., m @ δδ/l_c>1

Ref) B.M. Kim, Appl. Opt., Vol. 38, p.7145 (1999).

生生体体SSHHGG P22ωω(a.u.)

0 2 4 6 8 10

0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05

δδ/lc

位位相相整整合合

SSHHGG

Focus of fs pulse light

(5)

コラーゲン線維の組織構造

コラーゲン分子

（ポリペプチド3重らせん構造）

非中心対称性構造

（対称要素は回転軸のみ）

生

生体体S SH HG G光光発発生生

線維束

線維原線維

マイクロフィブリル

回

回転転対対称称軸軸

（

（円円柱柱対対称称性性））

光

光波波長長オオーーダダーー

規

規則則的的配配向向ががS

SHHGG光

光をを増増強強

(6)

入射光偏光とコラーゲン配向の関係

・SHG光はコラーゲン線維配向に敏感

・偏光解析が有効

Collagen orientation

SHG light

Cross-sectional (Centrosymmetric)

Laser polarization

Collagen fiber

Collagen fiber Collagen fiber

Axial

(Non-centrosymmetric) Parallel Perpendicular

None Strong Weak

(7)

入

入射射光光ススポポッットトコ

コララーーゲゲンン線

線維維

Ｓ

ＳＨＨＧＧ強強度度レレーーダダーーググララフフ

（

（配配向向方方位位：：主主軸軸角角度度、

、配

配向向度度：：形形状状））

S

SH HG G光光偏偏光光解解析析（（理理論論値値））

単一軸配向直交２軸配向ランダム配向

0.20 0.40.6 0.81

0

90

180

SHG光強度

0.20 0.40.6 0.81

0

90

180

0.20 0.40.6 0.81

0

90

180

Ref) P. Stoller et al, J. Biomed. Opt., Vol. 7, pp. 205-214 (2002).

予測されるコラーゲン配向

(8)

実験装置（反射配置）

入射光・SHG光同期させて回転

サンプル固定サンプルを光軸回りに回転�

（�光固定）�

出力250mW 繰返周波数87MHz 中心波長808nm パルス幅80fs

ML Ti:Sapphire laser (NA=0.42)OL HS

PL (rotatory) Sample λ/2

SHG light scanning

stage

F AN

L L

(φ50µm)PH HS

(rotatory) λ/2

PMT

Lock-in amplifier

(9)

(

(11)) ヒヒトトアアキキレレスス腱腱�

76歳女性、厚さ約2mm�

ホルマリン固定後、乾燥�

線維と平行方向にスライス�

(

(22))ヒヒトト皮皮膚膚真真皮皮（（背背中中））�

厚さ約1mm�

ホルマリン固定後、乾燥�

皮膚表面と平行方向スライス�

(

(33))ヒヒトト歯歯牙牙象象牙牙質質��

20歳男性、厚さ約1mm�

歯牙軸方向にスライス�

((44)) ヒヒトト距距骨骨 ��

厚さ約1mmにスライス�

((55)) ココララーーゲゲンンススポポンンジジ ((牛牛アアキキレレスス腱腱))��

��コラーゲン�

�向�

アキレス腱� 歯牙��

サンプル

皮膚真皮� 距骨�

(10)

SHG偏光解析vs他の偏光解析

Intensity (normalized)

0.20 0.40.6 0.81

0 30 90 60

120

210

240 270 300

330 (H-PL) (V-PL) Polarization

angle (deg)

0.20 0.40.6 0.81

0 30 90 60

120

210

240 270 300

angle (deg)

Refelected light

0.20 0.40.6 0.81

0 30 90 60

120

210

240 270 300

angle (deg)

0.20 0.40.6 0.81

0 30 90 60

120

210

240 270 300

angle (deg)

0.20 0.40.6 0.81

0 30 90 60

120

210

240 270 300

angle (deg)

0 0.20.4 0.60.81

0 30 90 60

120

210

240 270 300

angle (deg)

Vertical orientation

Horizontal orientation

Intensity (normalized) 00.20.40.60.81

0 30 90 60

120

210

240 270 300

angle (deg)

Intensity (normalized) 00.20.40.60.81

0 30 90 60

120

210

240 270 300

angle (deg)

Transmitted light TPAF SHG light

＠ヒトアキレス腱（単一軸コラーゲン配向）

複

複屈屈折折異

異方方性性吸吸収収線線形形散散乱乱特特性性他他ののTPAFのの分

分離離鋭鋭いい偏偏光光依依存存性性

(11)

SHG intensity (a.u.)

0 90

270 0.0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

コラーゲンスポンジラ

ランンダダムム

0 90

270 0.0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

ヒト象牙質直

直交交２２軸軸

S

SH HG Gレレーーダダーーググララフフ

0 90

270 0.0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

ヒトアキレス腱単

単一一軸軸

0 90

270 0.0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

ヒト網状真皮ヒト距骨

0 90

270 0.0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0 90

270 0.0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

非

非直直交交２２軸軸不不完完全全単

単一一軸軸

ヒト乳頭真皮（表皮越し）

ラ

ランンダダムム

コ

コララーーゲゲンン配配向向のの組組織織依依存存性性

(12)

コラーゲン配向の 

面内分布測定

(13)

配

配向向評評価価パパララメメーータターー

（

（１１））配配向向方方位位＠＠主主軸軸方方位位角角：：θ θ

_m_maajj

（

（２２））配配向向度度＠＠ S SH HG G偏偏光光異異方方性性：：P PA A

I

_maj

+ I

_min

I

_maj

- I

_min

PA =

PA=1：単一配向（８の字）

PA=0 ：完全ランダム配向（円形）

直交２軸配向（ひし形）

SHG in

tens

ity (a.u.)

0 90

270 0.0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

θ_maj I_maj

I_min

SHGレーダーグラフ

(14)

0 25 50 75 100

2mm

Polarization // Orientation

0 25 50 75 100

2mm

Polarization ⊥ Orientation

2mm

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00

SHG anisotropy

Orientation degree

0 25 50 75 100

Polarization-resolved SHG imaging @ human Achilles tendon

2mm

2mm 2mm

2mm

SHG intensity (a.u.) PA value

Uniform distribution of high PA values

PA=0.86±0.06

Collagen orientation arranged with high organization

(15)

0 25 50 75 100

Vertical polarization Horizontal polarization

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00

Orientation degree

Polarization-resolved SHG imaging @ collagen sponge

2mm

2mm 2mm

2mm

SHG intensity (a.u.) PA value

Uniform distribution of low PA values

PA=0.07±0.05

Collagen orientation distributed equally in all directions

(16)

Polarization-resolved SHG imaging @ human talus

1mm

光顕像

水水平平配配向向

垂垂直直配配向向

骨

骨陵陵にに沿沿っったたコ

コララーーゲゲンン配配向向

(17)

Polarization-resolved SHG imaging @ human dentin

PA=0.23±0.11

Vertical polarization Horizontal polarization

100 75 50 25 0

Orientation degree

1.00 0.75 0.50 0.25 0

PA value

Enamel

Dentin

コ

コララーーゲゲンン配配向向のの部部位位依依存存性性

(18)

2D SHG polarimetry @ human dentin

aging

(19)

ヒ

ヒトト網網状状真真皮皮のの面面内内配配向向分分布布＠＠離離散散的的ママククロロ

55 mm

40 mm

10 mm

(A) (B)

(20)

ヒ

ヒトト網網状状真真皮皮のの配配向向分分布布＠＠連連続続的的ミミククロロ

配向方位：

θ_maj

配向度：PA

θmaj (deg)

Position (mm)

(A) (B)

reticular dermis Achilles tendon

collagen sponge

θ maj (deg)θ maj (deg)

reticular dermis collagen sponge

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Achilles tendon

0 90 180 270 360

0 2 4 6 8 10 0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0 2 4 6 8 10

Position (mm)

PAPA

reticular dermis Achilles tendon

collagen sponge

Achilles tendon

collagen sponge reticular dermis

(A) (B)

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

(21)

Microscopic 2D distribution of collagen orientation angle

　　

@reticular dermis

Polarization-resolved SHG image

2D mapping of orientation angle

Entangled structure of collagen fiber

1.0

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.0 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.0

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.0 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.0

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.0 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.0

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.0 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.0

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.0 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.0

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

1.0 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

0 500 1000

0deg

30deg

60deg

90deg

120deg

150deg 測定領域：1mm*1mm

　　　　　20µ mステップ

0deg

30deg

60deg

90deg

120deg

150deg

Area: 1mm*1mm

Microphotograph of bovine dermis

1mm

(22)

コラーゲン配向の 

断層分布測定

(23)

基本特性評価（１）

深

深ささ分分解解能能

（

（薄薄アアキキレレスス腱腱））

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0 100 200 300 400

SHG intensity (normalized)

Depth (µm) 22.6µm without pinhole 14.3µm

with pinhole

10^-1 10⁰ 10¹ 10² 10³ 10⁴ 10⁵

0 100 200 300 400 500

Human Achilles Human dermis human dentin

Depth (µm)

ダ

ダイイナナミミッッククレレンンジジ

(24)

基本特性評価（２）

(25)

深さ分解SHG偏光解析

Depth (µm)

Polarization angle (deg)

0 60 120 180 240 300 360

0 0.5 1.0

0 80 160 240 320 400

Depth (µm)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0 60 120 180 240 300 360

0 0.5 1.0

Depth (µm)

0 25 50 75 100 125 150

0 60 120 180 240 300 360

0 0.5

アキレス腱

1.0

象牙質

網状真皮

(26)

コ

コララーーゲゲンン配配向向のの３３次次元元分分布布

面内イメージの深さ分解測定＠ヒト距骨

Depth=0µm Depth=100µm

(27)

生

生体体S SH HG G光光をを用用いいたた皮皮膚膚真真皮皮計計測測

・

・皮皮膚膚診診断断

・

・火火傷傷診診断断

・

・皮皮膚膚美美容容

コ

コララーーゲゲンン配配向向

生

生体体SS H HG G 光光

フェムト秒パルスレーザー光

表皮

真

真皮皮

皮下組織

深

深浸浸透透性性非

非染染色色

３ ３次次元元ｲｲﾒﾒｰｰｼｼﾞﾞﾝﾝｸｸﾞﾞ非

非破破壊壊・・非非接接触触

in situ

B

BG G 光光フフリリーー

・

・表表面面反反射射光光

・

・拡拡散散反反射射光光

・

・蛍蛍光光

熱

熱ダダメメーージジ小小

表

表皮皮越越しし

コ

コララーーゲゲンン含

含有有率率7 7 0 0% %

(28)

SHGコヒーレンストモグラフィー

ML Ti:Sapphire laser

PMT HS

HS

BS

Pinhole

time delay

SHG crystal

sample

コ

コヒヒーーレレンントトななSHG過過程程低

低ココヒヒーーレレンンスス干干渉渉ヘ

ヘテテロロダダイインン検検出出

微

微弱弱SSHHGG光光増増強強、、多多重重散散乱乱光光除除去去断

断層層測測定定

(29)

用い いた たコ コラ ラー ーゲ ゲン ン配 配向 向測 測定 定

生

生体 体組 組織 織の の非 非線 線形 形光 光学 学効 効果 果を を 用

用い いた たコ コラ ラー ーゲ ゲン ン配 配向 向測 測定 定

阪

阪大 大院 院・ ・基 基礎 礎工 工、 、奈 奈良 良医 医大 大

安

安井 井武 武史 史、 、佐 佐々 々木 木邦 邦彦 彦、 、荒 荒木 木勉 勉、 、東 東野 野義 義之 之

第30回レーザー顕微鏡研究会シンポジウム

『生体の無染色イメージング』

イントロ

コ

コラ ラー ーゲ ゲン ン 配

配向 向測 測定 定

第

第２ ２高 高調 調波 波発 発生 生光 光 ((生 生体 体SSH H G G 光 光） ） コ

コラ ラー ーゲ ゲン ン

SHG光とは？

音

光�

線���� �線����

生体ＳＨＧ光発生の原理

コラーゲン線維の組織構造

コラーゲン分子

（ポリペプチド3重らせん構造）

非中心対称性構造

（対称要素は回転軸のみ）

生

生体 体S SH HG G光 光発 発生 生

線維束

光

光波 波長 長オ オー ーダ ダー ー

規

規則 則的 的配 配向 向が がS

光を を増 増強 強

入射光偏光とコラーゲン配向の関係

・SHG光はコラーゲン線維配向に敏感

・偏光解析が有効

（

（配 配向 向方 方位 位： ：主 主軸 軸角 角度 度、

配向 向度 度： ：形 形状 状） ）

S

SH HG G光 光偏 偏光 光解 解析 析（ （理 理論 論値 値） ）

単一軸配向 直交２軸配向 ランダム配向

実験装置（反射配置）

サンプル

SHG偏光解析vs他の偏光解析

＠ヒトアキレス腱（単一軸コラーゲン配向）

S

SH HG Gレ レー ーダ ダー ーグ グラ ラフ フ

コ

コラ ラー ーゲ ゲン ン配 配向 向の の組 組織 織依 依存 存性 性

コラーゲン配向の

面内分布測定

配

配向 向評 評価 価パ パラ ラメ メー ータ ター ー

（

（１ １） ）配 配向 向方 方位 位＠ ＠主 主軸 軸方 方位 位角 角： ：θ θ

（

（２ ２） ）配 配向 向度 度＠ ＠ S SH HG G偏 偏光 光異 異方 方性 性： ：P PA A

I

+ I

I

- I

PA =

PA=1：単一配向（８の字）

PA=0 ：完全ランダム配向（円形）

直交２軸配向（ひし形）

SHGレーダーグラフ

Polarization-resolved SHG imaging @ human Achilles tendon

Polarization-resolved SHG imaging @ collagen sponge

Polarization-resolved SHG imaging @ human talus

骨

骨陵 陵に に沿 沿っ った た コ

コラ ラー ーゲ ゲン ン配 配向 向

Polarization-resolved SHG imaging @ human dentin

コ

コラ ラー ーゲ ゲン ン配 配向 向の の部 部位 位依 依存 存性 性

2D SHG polarimetry @ human dentin

ヒ

用いいたたココララーーゲゲンン配配向向測測定定

生体体組組織織のの非非線線形形光光学学効効果果をを   用

用いいたたココララーーゲゲンン配配向向測測定定

阪大大院院・・基基礎礎工工、、奈奈良良医医大大

   安

安井井武武史史、、佐佐々々木木邦邦彦彦、、荒荒木木勉勉、、東東野野義義之之

コララーーゲゲンン配

配向向測測定定

第２２高高調調波波発発生生光光 ((生生体体SSH H G G 光光））コ

コララーーゲゲンン

線�� 線��

生体体S SH HG G光光発発生生

光波波長長オオーーダダーー

規則則的的配配向向ががS

光をを増増強強

（配配向向方方位位：：主主軸軸角角度度、

配向向度度：：形形状状））

SH HG G光光偏偏光光解解析析（（理理論論値値））

単一軸配向直交２軸配向ランダム配向

SH HG Gレレーーダダーーググララフフ

コララーーゲゲンン配配向向のの組組織織依依存存性性

コラーゲン配向の 

配向向評評価価パパララメメーータターー

（１１））配配向向方方位位＠＠主主軸軸方方位位角角：：θ θ

（２２））配配向向度度＠＠ S SH HG G偏偏光光異異方方性性：：P PA A

骨陵陵にに沿沿っったたコ

コララーーゲゲンン配配向向

コララーーゲゲンン配配向向のの部部位位依依存存性性

ヒトト網網状状真真皮皮のの面面内内配配向向分分布布＠＠離離散散的的ママククロロ

ヒトト網網状状真真皮皮のの配配向向分分布布＠＠連連続続的的ミミククロロ

コラーゲン配向の 

深ささ分分解解能能

（薄薄アアキキレレスス腱腱））

ダイイナナミミッッククレレンンジジ

コララーーゲゲンン配配向向のの３３次次元元分分布布

生体体S SH HG G光光をを用用いいたた皮皮膚膚真真皮皮計計測測

・皮皮膚膚診診断断

・火火傷傷診診断断

・皮皮膚膚美美容容

コララーーゲゲンン配配向向

生体体SS H HG G 光光

真皮皮

深浸浸透透性性非

非染染色色

３次次元元ｲｲﾒﾒｰｰｼｼﾞﾞﾝﾝｸｸﾞﾞ非

非破破壊壊・・非非接接触触

BG G 光光フフリリーー

・表表面面反反射射光光

・拡拡散散反反射射光光

・蛍蛍光光

熱ダダメメーージジ小小

表皮皮越越しし

コララーーゲゲンン含

含有有率率7 7 0 0% %

・生生体体S SH HG G光光のの偏偏光光解解析析をを用用いいたた　

　ココララーーゲゲンン配配向向測測定定

・ココララーーゲゲンン配配向向のの３３次次元元分分布布測測定定

＠＠S SH HG G偏偏光光分分解解イイメメーージジンンググ