UIプロジェクトX

(1)

新規キナーゼ基質ペプチドと、

それを用いた診断・創薬のための技術

九州大学

大学院

工学研究院

九州大学

先端医療イノベーションセンター

九州大学未来化学創造センター

教授

片山

佳樹

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1 九州大学, 2012

・キノーム解析用ペプチドアレイ

・迅速・簡便なラベルフリーキナーゼアッセイ

・キナーゼ応答型遺伝子送達システム

・キナーゼ蛍光プローブ

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2 九州大学, 2012

細胞内プロテインキナーゼ群は、

細胞機能を決定する主体である。

すなわち、

細胞の状態を知り(診断・創薬）

細胞を識別する（ターゲティング）

ためには

細胞内シグナルを計測し、クロストークし、

利用し、制御する必要がある。

そこで、本発表では、

プロテインキナーゼを測定し、診断創薬に画期的なツール

を提供する手法

と

プロテインキナーゼを利用して、病変細胞を識別し、

正常細胞では作用しない遺伝子送達法をご紹介する。

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3 九州大学, 2012

キノーム解析用ペプチドアレイ

Phos-tag

Cy3-streptavidin

O H H O O N N N N N H NH S N H N H N O N -Zn2+ _Zn₂₊ P O O O -O -R Phos-tagの構造細胞破砕液 P P P P P P P P _{P P P P} Microarray scannerにて蛍光シグナルを検出 基質ペプチドアレイ

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4 九州大学, 2012

蛍光イメージング検出の定量性評価

0 50 100 150 200 250 0 500 1000 1500 2000 _2-pY 2-Y , 2-F Peptide concentration (μM) F lu o resc en ce i nt en si ty ( a. u. ) R2 = 0.9866 R2 = 0.9963 0 400 800 1200 1600 2000 0 20 40 60 80 100 Percentage of 2-pY (%) F luor e s c e nc e i n te ns it y ( a . u .) 0.05 mM 0.02 mM 76.20 mm 25.40 mm 17.80 mm 9.25 mm 840 spots 2-pY 2-Y 2-F 0.25 mm 0 500 1000 1500 2000 2500 0 40 80 120 160 200 240 280 Spot number F lu o resce n ce i n ten si ty ( a. u .) 2-pY 2-Y 2-F

(6)

5

九州大学, 2012

HepG2

細胞における

PMA

刺激に伴う

PKC

α と

ERK2

活性化の確認

PMA －＋－＋－＋ Cytosol fraction Membrane fraction PMA p-ERK1/2 actin actin transferrin receptor PKCα PMA刺激するとPKCαが活性化され、それに伴いΕΡΚ2が活性化これがペプチドアレイで確認できるか？ PMA(+) PMA(-) -200 0 200 400 600 800 1000 -200 0 200 400 600 800 1000 PMA(-) PMA (+ )

Activated with the stimulation

Depression with the stimulation

Top 30 was selected.

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6 九州大学, 2012 - 4 .0 0 0 - 2 .0 0 0 0 .0 0 0 2 .0 0 0 4 .0 0 0 1 5 1 1 0 1 1 5 1 2 0 1 2 5 1 3 0 1 3 5 1 4 0 1 4 5 1 5 0 1 5 5 1 N o -4.000 -2.000 0.000 2.000 4.000 1 51 1 01 1 51 20 1 2 5 1 3 01 35 1 4 01 4 51 50 1 55 1 N o １ ← ペプチドID番号 → ５５７１ ← ペプチドID番号 → ５５７刺激で亢進刺激で抑制刺激で亢進刺激で抑制＜メトホルミン刺激による細胞に対するリン酸化変化のプロファイル＞ (Dr. Osamu Okitsu) ＜薬剤Ａ刺激による細胞に対するリン酸化変化のプロファイル＞リン酸化のフィンガープリントにより、薬理活性を表現できる！！

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7 九州大学, 2012

PKA基質ペプチドによるナノ粒子の凝集

リン酸化された基質ペプチド（+1） 金コロイドを分散カチオン性基質ペプチド（+3） 金コロイドを凝集リン酸化ペプチド基質ペプチド

この現象をリン酸化測定ツールに応用

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8 九州大学, 2012 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.01 0.1 1 10 O. D . 650 Peptide conc. / μM 2 2' PKCα (+6 to +4) 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.01 0.1 1 10 O.D. 65 0 Peptide conc. / μM 3 3' CaMK-II (+3 to +1) 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.01 0.1 1 10 O.D. 65 0 Peptide conc. / μM 4 4' MAPK-2 (+3 to +1) 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.01 0.1 1 10 O. D. 650 Peptide conc. / μM 5 5' MAPKAPK-2 (+4 to +2)

種々のキナーゼ基質で検出系を実現

2 2’ 3 3’ 4 4’ 5 5’

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9 九州大学, 2012

担がんマウスとヒトの摘出乳がんのPKCα活性検出

正常（皮膚）腫瘍（B16） 4 % 70 % 33 % 0 % inhibitor（μM） ‐ ‐ 0.5 5.0 Tumor Normal Tumor Normal OD 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

がん増殖活性の指標である

PKCα活性を実際のがんで

検出

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10 九州大学, 2012

ヒト肺がん保存血清サンプルでのPKCα

活性

cutoff value ProGRP < 46 pg/ml CEA < 3.2 ng/ml CYFRA < 3.5 ng/ml がんバイオマーカー：○ → PKCα：○ 6 / 8（75％）がんバイオマーカー：× → PKCα：○ 2 / 6（33％） Case 臨床診断組織型年齢性別臨床病期検出 1 原発性肺癌小細胞癌 69 M 4 ProGRP 191.3 ○ 2 原発性肺癌小細胞癌 63 M 3A × 3 原発性肺癌小細胞癌 61 M 4 ProGRP 482.1 ○ 4 原発性肺癌腺癌 57 M 4 CEA 40.7 ○ 5 原発性肺癌未分化 72 F 4 CEA 4.9 ○ 6 原発性肺癌未分化 54 M 4 CYFRA 96.4 ○ 7 原発性肺癌腺癌 70 F 4 CEA 70.5 × 8 原発性肺癌腺癌 58 M 4 CEA 9.8 ○ 9 原発性肺癌小細胞癌 67 M 4 ○ 10 原発性肺癌小細胞癌 55 M 4 × 11 原発性肺癌腺癌 68 M 4 CEA 11.6 × 12 原発性肺癌扁平上皮癌 59 F 1A × 13 原発性肺癌小細胞癌 71 M 4 ○ 14 原発性肺癌小細胞癌 49 M 4 × 既存の腫瘍マーカー

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11

九州大学, 2012

種々の薬剤のキナーゼ阻害能評価例

Protein kinse A inhibitors

H-89 [μM] 0 30 IC₅₀: 125 nM* H-89 Rottlerin IC₅₀: 2.18 μM 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

active p38α + inactive MAPKAPK-2 active MAPKAPK-2 [SB-202190] (nM) OD 65 0 active p38α + inactive MAPKAPK-2 active MAPKAPK-2 3000 1000 300 100 30 10 SB 202190 (nM) active p38α + inactive MAPKAPK-2 active MAPKAPK-2 3000 1000 300 100 30 10 SB 202190 (nM) p38 inhibitor (SB202190) 101 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 0.05 0.15 0.25 0.35 SU6656 PP2 Y27632 inhibitor (nM) OD 650 Src inhibitors

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12 九州大学, 2012

キナーゼ蛍光プローブ

C14-ＰＫＣ-S/pAsp-F3.7 N H O LRRASLG _NH₂ O H N N H O H N O O O-_Na+ HN O NH₂ HN O NH O Fluorescein l m n pAsp-F3.7 : l : m : n = 91.8 : 4.5 : 3.7 C/A =1.5で混合 QuenchedState FKKQGSFAKKK-NH2 カチオン性基質蛍光標識ポリアニオン高分子イオン錯体蛍光消光蛍光回復 O H N N H O H N O O O-_Na+ HN O NH₂ HN O NH O O O +_Na-_O +_Na-_O O l m n O a pAsp-F3.7 (l = 91.8, m = 4.5, n = 3.7) H N N N N NN O N H ALRRASLGW l m n LPEI-Kemp-S10.3 (l=79.6, m=10.3, n=10.1) Polyanion-fluorescent dye Lipid-PK substrate P P P P 蛍光ON

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13 九州大学, 2012 P P P P キナーゼによるリン酸化で複合体が緩み、濃度消光が解消

プロテインキナーゼ活性検出蛍光分子プローブ

PKCα添加後20分後の相対蛍光強度 PKCα (+) PKCα (-) Inactivated PKCα PKA活性の検出例

高分子錯体型

_脂質型

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14 九州大学, 2012

従来技術とその問題点（ペプチドアレイ）

既に実用化されているもの

RI検出定量性に乏しいすでに分かっているシグナルの再確認

新技術の特徴・従来技術との比較（ペプチドアレイ）

・

従来技術の問題点であった、定量性を改良することに成功した。

・

従来は感度（非特異吸着による妨害）・定量性の点ですでに判明しているキナーゼ活性化の再確認の目的に限られていたが、これらの問題を解決しており、細胞でのキナーゼ活性プロファイリングを行うことが可能となった。 Pepchip (Pepscan社） PamChip Array（PamGene社） CelluSpot Array (Intavis社）

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15 九州大学, 2012

従来技術とその問題点（金粒子法、蛍光プローブ）

既に実用化されているもの

高価定量性に乏しい細胞・組織サンプルは困難

新技術の特徴・従来技術との比較（金粒子法、蛍光プローブ）

・従来技術の問題点であった、細胞や組織サンプルへの適用を実現（金粒子）。・手術や生検でのサンプルで評価可能（金粒子）。・蛍光プローブ法は従来よりも高感度化を実現。 アルファスクリーン法 (キャリバー社） ＱＴＬ法（QTL Biosystems社） ＡＴＰ測定法ＦＲＥＴ法

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16 九州大学, 2012

想定される用途（ペプチドアレイ・金粒子法・蛍光プローブ）

・薬物探索（機能面からの探索）・薬効評価・投薬前診断・疾患の診断、予後評価・植物（農作物）の品種改良・幹細胞の品質評価・分化評価

実用化に向けた課題

・アレイ、金粒子法は、種々の細胞や組織におけるキナーゼでの定量的なリン酸化プロフィール取得が可能なところまで開発済み。しかし、さらに微量のサンプルへの適用のための計測ツールなどが必要。・蛍光プローブ法は、現時点ではキナーゼ阻害剤探索などに適用可能だが、細胞内への適用は、さらなる安定化が必要。・今後、細胞に加え、臨床サンプルについて実験データを取得し、診断や薬効評価に適用していく場合の条件設定を行っていく。

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17 九州大学, 2012 細胞表面情報によるターゲティング ☆病変組織は不均一な細胞集団 ➠すべてを標的化できない正常細胞との機能差キナーゼ活性を利用した識別 ☆病変細胞特異的亢進しているプロテインキナーゼの利用 ➠機能変化を利用して細胞識別増殖活性、転移活性 ☆標的部位への蓄積のみに注力 ➠蓄積は最大で５％正常臓器での副作用 ☆標的細胞以外では活性を抑制 ➠副作用の軽減 ☆可視化病変の存在箇所を可視化 (正確な予後判定困難） ☆治療ぜい弱な細胞ほど効果正常臓器での副作用従来：アクティブターゲティング・・細胞特異的な目印を利用

標的細胞特異的な遺伝子の送達

病変の機能(増殖活性など)を可視化 (正確な治療効果、悪性度を判定) 悪性度の高い細胞ほど効果正常臓器では作用なし

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18 九州大学, 2012

GFP

TexasRed

Phase-contrast

Polymer

LPS (100 ng/mL)

Type

(-)

(+)

(-)

(+)

(naked)

Ser

Ala

I-k-kinase（炎症細胞）応答型

CH₂ CH _m n CH₂ CH₃ O NH₂ O _{ALRRASLG NH} 2 [Link]₃-KKKKERLLDDRHDSGL-NH₂ I-κ-kinase responsive A

炎症反応特異的に

遺伝子発現

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19 九州大学, 2012 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

A431 A549 B16 HeLa

H epG 2 Hu H-7 N eur o-2a A431 B16 H epG 2 Hu H-7 br ain hear t kidney liv er lung muscl e pancr eas ski n spleen phos phoration ratio / % norm al tis s ue tum or tis s ue tum or c ell Peptide, 30 μM; ATP, 100 μM; MgCl_2, 1 mM; protein concentration, 0.2 μg/μl. Total volume : 30 μl PKCα特異基脂質：FKKQGSFAKKK 0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 160,000 180,000 α β I β II γ δ ε η θ ζ ι/λ Isozymes CP M Kang et al, Proteomics 10, 2006‐11 (08) α βΙβΙΙ γ δ ε η θ ζ ι/λ がん組織がん細胞正常組織 Kang et al, J. Am. Chem. Soc 2008 Tomiyama et al, Cancer Sci. 2009 Toita et al, J. Control. Released 2009

PKCa応答型システム

すぐれたがん特異性！ PPC(S) PPC(A) PPC(S) PPC(A) normal tissue cancer tissue

Lu min es cen ce i n ten sity (p /s ) 0 2 4 6 8 10 PPC(S) PPC(A) PPC(S) PPC(A) L uci fe ra se ac tivi ty (X1 0 5 RL U /m g pr ot ei n )

B16 melanoma Normal skin

0 2 4 6 8 10 PPC(S) PPC(A) PPC(S) PPC(A) L uci fe ra se ac tivi ty (X1 0 5 RL U /m g pr ot ei n )

B16 melanoma Normal skin

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20 九州大学, 2012

シグナル応答性、遺伝子活性化能を向上させた改良型

O NH₂ R m n O

PPC(S) or PPC(A) LPEI(S) or LPEI(A)

PPCタイプでは最大10倍の応答性であったが、 LPEIタイプでは最大500～1000倍に向上

従来型では適用できなかったがんにも適用可

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21 九州大学, 2012

従来技術とその問題点（遺伝送達技術）

既に実用化されているもの

正常組織での遺伝子抑制が不可能なため治療では副作用を回避できない。また、脆弱な細胞ほど効果イメージングでは、正常臓器で大きなシグナル病変部の場所は分かるが、機能変化は分からない。

新規技術のメリット

・従来技術の問題点であった、正常組織での遺伝子の抑制を実現・より悪性度の高い細胞で効果を発揮・病態機能を可視化できるウイルスキャリヤーカチオン性高分子カチオン性脂質ポリイオン錯体型ナノ粒子ポリ乳酸型カプセル ・・・・etc

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22 九州大学, 2012

想定される用途

・これまでデリバリーの問題で断念された治療遺伝子の復活・効果的な治療技術・動物レベルでの正確な薬効評価・正確な予後評価

実用化に向けた課題

・血中投与にはさらなる複合体の安定化が必要・遺伝子発現効率のさらなる改善が理想的

企業への期待

・複合体安定化については、糖鎖、脂質等による被覆で克服可能と考えている。・一度、遺伝子医薬を検討し断念した、あるいは検討中の企業には、本システムによる解決の可能性が見込まれる。・また、イメージングでは、創薬効率化技術を開発中の企業、診断分野、再生医療分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。

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23 九州大学, 2012

本技術に関する知的財産権

１．タンパク質キナーゼの新規基質ペプチド

PCT/JP2011/063699

２．プロテインキナーゼの検出及び活性測定法

PCT/JP2010/065721

３．癌診断用マーカーとしてのプロテインキナーゼCα

PCT/JP2010/062252

４．プロテインキナーゼのリン酸化酵素活性ならびに脱リン酸化

酵素活性の測定方法

特開2008-79610

５．細胞シグナル応答型遺伝子転写制御系

特登4290352（出願人：独立行政法人

科学技術振興機構）

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24 九州大学, 2012