博士（農学） 佐々木健太郎
学 位 論 文 題 名
シロイヌナズナの低温ショックドメインタンノヾク質 AtCSP2 の 生 理 機能 に関 する 分子 生物 学的 研究
学位論文内容の要旨
凍結を含む低温ス卜レスは様々な植物種の生育あるいは生存に影響を与え，地理分布を制限 する環境要因の1っである．北海道のような寒冷地帯では冬期に‑20℃以下に気温が低下する場 合があるが，このような場所での作物の生産性を向上させるためには，耐凍性強化が必要であ る．植物には，低温に応答して耐凍性を高める低温馴化というメカニズムが存在する．このメ カニズムの解明は，植物の耐凍性向上の鍵であると考えられる．低温は植物に限らず多様な生 物種の生長や生存を制限するため，低温適応の分子機構は保存性の高い進化を遂げていると考 えられる．しかし，原核生物から動植物まで，高度に保存された低温適応機構はこれまでに知 られていない．大腸菌では，低温に曝されると低温ショックタンパク質(CSP)を高蓄積する．
CSPは大腸菌が低温下で生育するために必須のタンパク質であり，低温下で形成されるRNA の二本鎖構造 を解消するRNAシヤペロンである，CSPは低温下において，転写および翻訳の 維持または活性化に働くと考えられている．CSPと構造が類似したタンパク質(CSDタンパク 質）が高等植物にも見出されたが，それらの機能に関する知見は乏しい．そこで，本研究では シロイヌナズ ナのCSDタンパク質の1っであるAtCSP2に着目し，その機 能解析を行った．
第2章では，AtCSP2の生化学的機能および発現様式の解析を行った．生化学的解析から，
AtCSP2はDNAおよ びRNAに 結 合し ，二 本鎖 核酸 を解 離す るこ とが 示さ れ， 大腸 菌CSPと 同様にRNAシャペロンとして機能すると考えられた．また，低温処理により，AtCSP2のmRNA およびタンパク質が蓄積することから，低温馴化への関与が示唆された．組織特異的発現解析 から，At CSP2は茎頂や根端，胚などの組織で特異的に発現しており，発生や生長への関与も示 唆された．さらに，AtCSP2の細胞内局在性は核と細胞質であることから，AtCSP2は核内にお けるRNAのプロセシングあるいは細胞質に おけるmRNAの機能発現制御に働く可能性が示唆 された．
第2章において，AtCSP2の低温馴化への 関与が示唆されたことから，第3章ではAt CSP2 の発現が40％程度に低下したa tcsp2‑3変異株およびAt CSP2過剰発現体を用いて，それらの耐 凍性の評価を行った．a tcsp2‑3変異株の耐凍性は低温馴化前および馴化後において，野生株と 同程度であっ た．そこで，At CSP2と最も相同性が高いAt CSP4との二重変異株（atcsp2‑3 a tcsp4‑1)を作出したところ，低温馴化後の耐凍性が顕著に向上することを見出した．一方，
At CSP2過剰発現体の耐凍性を調べると，馴化後の耐凍性が低下していることが判明した．した がって，AtCSP2は低温馴化に依存した耐凍性の負の制御因子であり，その機能はAtCSP4と 重複していると推定された．低温馴化の正の制御因子であるCBFの発現を二重変異株および過 剰発現体を用いて解析した結果，CB・Fの発現がAtCSP2により負に制御されることが判明し た．興味深い ことに，CBFの負の制御因子 であるMYB15（転写因子）の発現がAt CSP2過剰 発現体で著しく上昇しており，逆に変異株では低下していた．これらの結果から，AtCSP2は
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MYB15の 発 現 を 上 昇 さ せ る こ と で ， 耐 凍 性 を 負 に 制 御 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た ． At CSP2過 剰 発 現 体 は ， 耐 凍 性 の 低 下 に 加 え ， 生 長 お よ び 発 生 の 過 程 で 発 芽 の 遅 延 ， 植 物 体 サ イ ズ の 縮 小 化 ， 長 角 果 の 縮 小 化 等 の 多 面 的 な 表 現 型 を 示 し た ． そ こ で ， 第4章 で は ， 発 生 お よ び 生 長 過 程 に お け るAtCSP2の 機 能 解 析 を 行 っ た ．At CSP2過 剰 発 現 体 の 長 角 果 の 縮 小 化 の 原 因 を 解 明 す る た め ， 長 角 果 の 長 さ ， 長 角 果 あ た り の 種 子 数 等 を 解 析 し た 結 果 ，AtCSP2は 種 子 間 隔 の 負 の 制 御 因 子 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た ． 次 に ，At CSP2過 剰 発 現 体 の 発 芽 遅 延 の 原 因 を 調 べ る た め ，ABAお よ びGA含 量 の 測 定 ，ABAあ る い はGA代 謝 遺 伝 子 の 発 現 解 析 を 行 っ た ． そ の 結 果 ，At CSP2過 剰 発 現 体 のABA含 量 は 野 生 株 の2倍 程 度 に 上 昇 し て お り ，ABA生 合 成 遺 伝 子 の 発 現 上 昇 お よ び 分 解 遺 伝 子 の 発 現 低 下 が 確 認 さ れ た ． ま た ，GA生 合 成 遺 伝 子 の 発 現 は 低 下 し て い た ． し た が っ て ，AtCSP2はABAお よ びGAの 代 謝 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る こ と に よ り ， 発 芽 を 負 に 制 御 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た ．
こ れ ら の 結 果 か ら ，AtCSP2は 低 温 馴 化 に 加 え ， 植 物 の 様 々 な 生 理 的 プ ロ セ ス を 制 御 す る こ と が 明 ら か と な っ た ． こ れ ら の 生 理 的 プ ロ セ ス がAtCSP2を 介 し た 共 通 の メ カ ニ ズ ム に よ り 制 御 さ れ て い る か は ， 今 後 の 検 討 と し て 興 味 深 い ． 発 芽 過 程 に お い て ，AtCSP2はABA生 合 成 を 正 に 制 御 す る が ，ABAは 耐 凍 性 の 正 の 制 御 因 子 で も あ る ． 本 研 究 の 結 果 は ，AtCSP2が 耐 凍 性 の 負 の 制 御 因 子 で あ る こ と を 示 唆 し て い る ． こ の 相 違 は ，AtCSP2が 耐 凍 性 と 発 芽 を 異 な っ た メ カ ニ ズ ム で 制 御 し て い る こ と を 示 し て い る ， ま た ，CBFシ グ ナ ル 経 路 はABAに 制 御 さ れ な い こ と か ら ，AtCSP2に よ る 耐 凍 性 制 御 機 構 に はABAは 関 与 し な い と 考 え ら れ る ． シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の 別 のCSDタ ン パ ク 質 で あ るAtCSP3は ， 核 お よ び 細 胞 質 内 のRNAプ ロ セ シ ン グ に 関 与 す る 様 々 な タ ン パ ク 質 と 相 互 作 用 す る ． し た が っ て ，AtCSP2も 同 様 な 複 合 体 を 形 成 し ，RNAプ ロ セ シ ン グ を 介 し た 遺 伝 子 発 現 制 御 を 行 う 多 機 能 な 調 節 因 子 で あ る と 推 定 さ れ る ． 今 後 ，AtCSP2 が 関 与 す る 様 々 な 生 理 的 プ ロ セ ス に お け る 相 互 作 用 タ ン パ ク 質 お よ び タ ー ゲ ッ トRNAを 同 定 す る こ と が 重 要 で あ る ．
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学 位 論 文 審 査 の 要 旨
主 査 客 員 教 授 今 井 亮 三 副査 教授 松井博和
副査 教授 内藤 哲（生命科学院）
副査 准教授 荒川圭太 副査 助教 佐分利 亘
学 位 論 文 題 名
シロ イヌ ナズ ナ の低 温シ ョックドメインタンノヾク 質 AtCSP2 の 生 理 機 能 に 関 す る 分 子 生 物 学 的 研 究
本 論文 は序 章・ 終章 を含 む5章 から なり ，図30， 表3を含む総頁数111の和文論 文で ある ，別 に8編 の参 考論 文が 添え られ てい る，
凍 結を含む低温ストレスは様々な植物種の生育あるいは生 存に影響を与え，地理 分布 を制限する環境要因の1っで ある．北海道のような寒冷地帯では冬期にー20℃以 下に 気温が低下するため，越冬性作物の生産性の向上には， 耐凍性の強化が必要で ある ．植物には，低温に応答して耐凍性を高める低温馴化と いうメカニズムが存在 する ．このメカニズムの解明は，植物の耐凍性向上の鍵であ ると考えられる．大腸 菌 で は ， 低 温に 曝 され ると 低温 ショ ック タン パク 質(CSP)を 高蓄 積す る，CSPは 大 腸菌 が 低温 下で 生育 する ため に必 須のタンパク質であり，低温下で形成される RNAの 二 本 鎖 構 造 を 解 消 す るRNAシ ャ ペ ロン で ある ．CSPは 低温 下に おい て ，転 写 およ び 翻訳の維持または活性化に働くと考えられている．CSPと構造が類似した タ ンパ ク 質(CSDタ ンパ ク質 ）が 高等 植物にも見出されたが，それらの機能に関す る 知見 は 乏し い， そこ で， 本研 究で はシロイヌナズナのCSDタン パク質の1っであ るAtCSP2に着目し，その機能解析を行った．
第2章では，AtCSP2の生イ匕学 的機能および発現様式の解析を行った．生化学的解 析 から ，AtCSP2は核酸に結合し，二本鎖構造を解離すること等か ら，大腸菌CSPと 同 様 にRNAシ ャ ペ ロ ン で あ る こ と が 示 さ れた ．ま た，AtCSP2のmRNAおよ び タン パク 質が低温により蓄積することから，低温馴化への関与が 示唆された．組織特異 的発 現解析から，AtCSP2は茎頂や根端，胚などの組織で特異 的に発現しており，発 生や 生長への関与も示唆された．さらに，AtCSP2の細胞内局 在性は核と細胞質であ る こと か ら，AtCSP2は 核内 にお けるRNAの プロ セシ ング ある いは細胞質における mRNAの機能発現制御に働く可能性が示唆された．
第3章ではAtCS'P2の発現が低下したatc・叩2‐3変異株およびイfC即2過剰発現体を 用いて，それらの耐凍性の評価を行った．ロ蝋田‐3変異株の耐凍性は低温馴化前およ び馴 化後において，野生型株と同程度であった，そこで，イfC研りと最も相同性が高 いイfのPゲとの二重変異株（田呷2‐コロf卿4．´）を作出し，その低温馴化後の耐凍性 が顕 著に向上することを明らかにした．一方，イfG卵2過剰発現体におぃては，馴化
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後 の 耐 凍 性 が 低 下 し て い る こ と が 判 明 し た ． し た が っ て ，AtCSP2は 低 温 馴 化 に 依 存 し た 耐 凍 性 の 負 の 制 御 因 子 で あ り ， そ の 機 能 はAtCSP4と 重 複 す る と 結 論 さ れ た ． 低 温 馴 化 の 正 の 制 御 因 子 で あ るCBFの 発 現 を 二 重 変 異 株 お よ び 過 剰 発 現 体 を 用 い て 解 析 し た 結 果 ，CBFの 発 現 がAtCSP2に よ り 負 に 制 御 さ れ る こ と が 判 明 し た ． 興 味 深 い こ と に ，CBFの 負 の 制 御 因 子 で あ るMYB15（ 転 写 因 子 ） の 発 現 が イ だ 甜 り 過 剰 発 現 体 で 著 し く 上 昇 し て お り ， 逆 に 二 重 変 異 株 で は 低 下 し て い た ． こ れ ら の 結 果 か ら ， AtCSP2はMYB15の 発 現 を 上 昇 さ せ る こ と で ， 耐 凍 性 を 負 に 制 御 し て い る 可 能 性 が 示 さ れ た ．
第4章 で は ， 発 生 お よ び 生 長 過 程 に お け るAtCSP2の 機 能 解 析 を 行 っ た ，AtCSP2 過 剰 発 現 体 で 観 察 さ れ た 長 角 果 の 縮 小 化 の 原 因 を 解 明 す る た め ， 長 角 果 の 長 さ ， 長 角 果 あ た り の 種 子 数 等 を 解 析 し た 結 果 ，AtCSP2は 種 子 間 隔 の 負 の 制 御 因 子 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た ． 次 に ，AtCSP2過 剰 発 現 体 の 発 芽 遅 延 の 原 因 を 調 べ る た め ， 発 芽 の 制 御 に 働 く 主 要 な 植 物 ホ ル モ ン で あ る ア ブ シ シ ン 酸(ABA)お よ ぴ ジ ベ レ リ ン(GA) 含 量 の 測 定 ，ABAあ る い はGA代 謝 遺 伝 子 の 発 現 解 析 を 行 っ た ． そ の 結 果 ，AtCS'P2 過 剰 発 現 体 のABA含 量 は 野 生 株 の2倍 程 度 に 上 昇 し て お り ，ABA生 合 成 遺 伝 子 の 発 現 上 昇 お よ び 分 解 酵 素 遺 伝 子 の 発 現 低 下 が 確 認 さ れ た ． ま た ，GA生 合 成 遺 伝 子 の 発 現 は 過 剰 発 現 体 で 低 下 し て い た ． し た が っ て ，AtCSP2はABAお よ びGAの 代 謝 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る こ と に よ り ， 発 芽 を 負 に 制 御 す る と 結 論 さ れ た ， 以 上 の 結 果 か ら ，AtCSP2は 低 温 馴 化 に 加 え ， 植 物 の 様 々 な 生 理 的 プ ロ セ ス を 制 御 す る こ と が 明 ら か と な っ た ． そ の 多 面 的 効 果 は ， 別 のCSDタ ン パ ク 質 で あ る AtCSP3と 同 様 に ， 核 お よ ぴ 細 胞 質 内 に お い てRNAプ ロ セ シ ン グ に 関 与 す る 様 々 な タ ン パ ク 質 と 複 合 体 を 形 成 し ，RNAプ ロ セ シ ン グ を 介 し た 遺 伝 子 発 現 制 御 を 行 う こ と に よ り も た ら さ れ る と 考 察 し て い る ．
こ の よ う に ， 本 論 文 は ， シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の 低 温 シ ョ ッ ク ド メ イ ン タ ン パ ク 質 AtCSP2の 生 理 的 機 能 を 明 ら か に し ， 植 物 の 低 温 馴 化 を 制 御 す る 新 た な 因 子 を 同 定 し た 点 で 高 く 評 価 さ れ る ． よ っ て ， 審 査 員 一 同 は ， 佐 々 木 健 太 郎 氏 が 博 士 （ 農 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 十 分 な 資 格 を 有 す る も の と 認 め た ．
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