肺移植へのブリッジとしての腸管によるLiquidVentilationの実用化

課題番号: 12557110

平成12年度∼平成14年度科学研究費補助金(基盤研究(B)(2))

研究成果報告書

平成15年5月

研究代表者:近藤 丘

(東北大学加齢医学研究所教授)

1 肺移植へのブリッジとしての腸管によるLiquidVentilationの実用化 課題番号: 12557110

平成12年度∼平成14年度科学研究費補助金(基盤研究B(2))研究成果報告書

平成15年5月

代表研究者:近藤 丘

(東北大学加齢医学研究所教授)

はしがき

研究組織

研究代表者:近藤 丘 (東北大学加齢医学研究所教授)

研究分担者:松村輔二 (東北大学医学附属病院助手)

研究分担者:岡田克典 (東北大学加齢医学研究所教授)

研究分担者:遠藤千顕 (東北大学医学附属病院助手)

研究分担者:星川 康 (東北大学医学附属病院助手)

交付決定額(配分額)       (金額単位:千円) 直接経費 亊I ｨﾆ N 合計 平成12年度 ﾃS 0 ﾃS 平成13年度 ﾃS 0 ﾃS 平成14年度 ﾃs 0 ﾃs 総計 途ﾃs 0 途ﾃs

3

研究発表

ア 学会試等

(1) Inoue K et al. Effects of rewarming on nuclear factor-TCBand interleukin-8

expression in cold-preservedalveolar epithelialcells. TTanSPlantation. In press

2003.

(2) Tsubochi H, etal. Early Changes inAlveolar Fluid Clearance by Nitric

Oxide Following Endotoxin Instillation in Rats.AmJ Respir Crit Care Med 167:

205-210, 2003.

(3) Noda M, etal. Single dexamethasone injection increases alveolar瓜uid

clearance in adultrats. Crit Care Med 31: 1183-1189, 2003.

(4) Ishida I, et al. Hypoxia diminishes Toll-like receptor 4 expression through

reactive oxygen species generated bymitochondoria in endothelial cells. Jlmmuno1

169: 2069-2075, 2002

(4) Okada Y etal. Transient cold preservation alone stimulates tumor necrosis

factor-alpha gene expression in a cold rat syneTglC rat transplantation. Transplant Proc

34: 1111-1113, 2002

transplantation･ Transplant Proc 34: 2585-2586, 2002 イ 口頭発表

(1) 山中澄隆､ほか.甲状腺機能先進症を合併し術後循環管理に難渋した

原発性肺高血圧症(PPH)に対する両側生体部分肺移植の一例.第7回東北肺循

環研究会. 2003年3月.仙台 (2) Hao Bing､ほか.冷却再加温が肺血管内皮細胞の透過性におよぼす影響.

第7回東北肺循環研究会. 2003年3月.仙台

(3) 松田安史､星川康､鈴木聡､久保裕司､岡田克典､田畑俊治､遠藤千

顕､松村輔二､佐藤雅美､近藤丘.モノクロタリン肺高血圧､右心肥大へのPPAR

ligmdの効果.第43回日本呼吸器学会総会. 2003年3月.福岡

(4) 田畑俊治､ほか.両側下葉切除を付加した脳死両肺移植の経験.第20

回日本呼吸器外科学会総会. 2003年5月.東京

ウ 出版物

(1) 星川康､ほか.プロスタサイクリンの多様性と今後の展望.メディカ

ルレビュー社. 2002

研究成果

はじめに

肺移植では移植希望患者が長期の待機期間を乗り切ることが出来るような､透

析や人工心臓のようなデバイスが実用化されていない｡本研究の目的は､酸素

溶解能が高い不活性溶液用いたliquid ventilationが腸管を用いて可能かどうかを 検討し､その臨床応用を目指すことであった｡ただし､ perfuluorocarboneを用 いたlumg ventilationが実際にUSAで臨床試験を受けており(1)､この溶液は現

在では入手不可能となったため､本研究では現在入手可能なその類似構造物で

あるフロリナ-トを用いた｡フロリナ-トには物性の異なる数種類の製品があ

るが､そのなかでFC-77は酸素溶解量が水の3.2 ml/100mlに比較して56 ml/100ml と極めて大きく､また､炭酸ガス溶解量も水の80.5 ml/100mlに比して214 ml/100mlと優れ､さらに､沸点が97℃と他のフロリナ-トよりも低揮発性で扱

いに簡便であるという利点がある｡最近の動物実験でもFCl77の使用報告があ

り(2, 3)､その急性毒性には問題がない｡本研究でFC-77を用いて得られたデー タは､ perfuluorocarboneを含む酸素溶解能が高い不活性溶液一般に敷術できる

ものと考えている｡

本研究報告書は3つのセクションから構成されている｡すなわち､ 1)静脈血

混和実験､ 2)培養細胞層透過実験､ 3)ラットを用いた動物実験である｡動

物実験において､我々はFC-77を腸管内に投与した場合と腹腔内に投与した場

合を比較することになった｡その結果､ FC-77を介して肺以外の臓器から酸素

をデリバリーすることは今の技術でも実現可能であり､さらにFC-77に移行し

7

た炭酸ガスを体外に放散するデバイスが開発されれば､腸管あるいは腹膜を利

用したliquid ventilationが実現化されるだろうとの結論を得た｡ただし､本研究

で目標とした腸管の利用が最適であるかどうかについては､なを検討の余地が

あると考えられた｡我々は､むしろ腹腔を利用したliquid ventilationが臨床応用

の実現に近いのではないかと考えるに至った｡

1.血液混和実験

対象と方法

成人男性ボランティア(A - 1)から末梢静脈血をへ/toリン採血し37℃で保温し た｡静脈血(0.5 ml)を100%酸素､または室内気で飽和したFC-77 (0.5 ml)と エツペンドルフチューブ内で用事的に緩やかに混和したのち12,000 rpmで遠心

分離して血液とFC-77を個別に採取して自動ガス分析装置(ABL550,

Radiometer)を用いてガス分析を行った｡

成績

100%酸素で飽和されたFC-77と混和すると､末梢静脈血は速やかに酸素化され､

p02は混和開始から1分でほぼ最大となった(Figure lA)｡一方､末梢静脈血の pc02はFC-77と混和することにより軽度低下した(Figure lA)｡ FC-77のガス 分析では､ p02の減少とpc02の上昇が認められた(Figure lB)｡ 末梢静脈血を室内気で飽和されたFC-77と混和しても同様にpO之の上昇とpc02

の低下が認められたが､その混和開始から1分の時点でのP02は100%酸素の

約2/3にとどまった(Figure 2)｡

小括

FC-77と血液を直接接触させることにより､ FC-77に溶解している酸素を速や

かに血液に移行させることができた｡また､血液に溶解している炭酸ガスを

FC-77に除去することも可能だった｡

9

2.培養細胞層透過実験

対象と方法

In vitro実験ではヒト肺血管内皮細胞(human pulmonary arterial endothelial cells,

HPAEC; Kurabo BiodlemiCalS)､およびヒト肺胞上皮細胞由来細胞株A549

(Ameri拙l Type Culture Collection)を用いた｡ tH'AECの培養には専用の HuMedia-EG2にfetal bovine serum (2%), humanrecombinant epidemal growth factor

(EGF, 10 ng/ml), humanrecombinant basic fibroblast growth factor (bFGF, 5 ng/ml),

heparin (10 tAg/ml)およびhydrocortisone (1 pg/ml)を添加したものを用いた｡ A549

の培養には10% fetal bovine serumを添加したDulbecco's modified Eagle's

Medium (DMEM, GibcoIBML)を用いた｡細胞層を介した酸素と炭酸ガスの拡散

を測定するために､細胞はトランスウェウルフィルターインサート(直径12

mm)上に培養した｡細胞層が実験に適したコンフルエント状態に到達してい

ることを確認するために､電気抵抗測定装置 仲VOM, World Precision

Instruments)と フィルター電極チャンバー 仲ndolm-12, World Precision

Instruments)を用いて､細胞層を介した電気抵抗(transendothelial/epithelial

electric resistance, TER)を測定し､ 10 0lm.cm2以上を示したトランスウェウル

フィルターインサートを実験に用いた｡培養､および次の実験はすべて5%CO2

インキュベーター内で37℃で行った｡肺血管内皮細胞を用いた実験では細胞の

基底膜側にFC-77を投与した(Figure 3A)｡はじめに､ 100%酸素で飽和したFC-77 (2 ml)をインサートの外側(outer chamber)に注入した｡ついで､インサート の内側(hner chamber)に37℃に保温した培養液(DMEM)を注入し､それを経

時的にサンプリングしてガス分析を行った｡肺胞上皮細胞を用いた実験では､

血管内皮細胞とは逆に､細胞のapical側(lmer chamber)にFC-77を投与し､37℃ に保温した培養液(DMEM)はインサートの外側(outer chamber)に注入した

(Figure 3B).

成績

HPAECを用いてlmer dlamberに培養液を､ outer chamberに100%酸素で飽和

されたFC-77を注入した実験では､実験開始から10分でに培養液のP02が最

大となった(Figure 4A)｡一方､ pc02は緩やかに時間依存性に低下した(Figure

4B)｡実験開始から30分の時点におけるp02は有意に上昇し､ pc02は有意に低 下した(Figure 5)｡

A549細胞を用いて､ Inner chamberに100%酸素で飽和されたFC-77を､ outer

chamberに培養液を注入した実験では､ HPAECと同様に､ P02の上昇とpc02 の低下が認められた｡ A549細胞でも実験開始から30分の時点におけるP02は 有意に上昇し､ pc02は有意に低下した｡ただし､ HPAECとA549細胞でP02 とpc02の変化量を比較すると､両者ともA549で有意に大きかった(Figure 6)｡

小括

血管内皮細胞あるいは上皮細胞を介した間接的なコンタクトでも､ FC-77の酸

素を培養液に移行させることができた｡また､炭酸ガスをFC-77に除去するこ

ともできた｡ただし､その時間経過､ FC-77との直接接触に比較して長い傾向

があった｡また､ HPAECよりもA549細胞の方がガス交換が速やかに行われ､

ll

3.ラットを用いた動物実験

対象と方法

FC-77の腸管内または腹腔内投与が動脈血酸素分圧に及ぼす影響をin vivoで検 討するために､ Specific pathogen free (SPF)の雄性spTague-Dawley (SD)ラット

(400-450g)を用いた実験を行った｡実験動物は東北大学の動物実験指針に

則り愛護的に扱われた｡ラットをベントパルピタール(50 mgnCg､腹腔内投与)

で麻酔したのち､気管切開を施し小動物用レスピレーターに接続した｡換気に

は室内気を用い､換気条件は一回換気量vT= 5m仙g､換気回数f= 30回/min

とした｡この肺胞低換気モデルを適用した理由は､重度の呼吸不全患者の血液

ガスに似た環境を作成するためである｡この換気条件は通常の動物実験に比較

して著しい低換気をもたらすが､動物が死亡するには至らないことを予備実験

で確認した｡次いで､動脈血サンプリングのために頚動脈にラインを留置した｡

30分のbaseline測定の後､ 100%酸素で飽和したFC-77 (20 mlnCg)を旺門から注 入し､ head-downpositionを15分維持したのち､ 4時間にわたり動脈血ガス分析

を行った｡また､別のラットを用いて､同様の肺胞低換気環境下で､ 100%酸素

で飽和したFCl77 (20 mlnlg)を腹腔内に注入する実験を行った｡麻酔維持のた めに､ 1時間ごとにベントパルビタール(25 mgnCg)を皮下投与した｡実験終

了後に､腸管内､または腹腔内に残留しているFC-77を回収してガス分析を行

った｡また､ FC-77に接触した腸管､または腹壁組織を掃出し､ 10%ホルマリ

ンで固定後､パラフィンワックスに包埋薄切し､へマトキシリン･エオジン染

色を施して組織学的変化の有無を観察した｡

13

成績

100%酸素で飽和されたFCl77を旺門から腸管内に注入すると､ pa02は時間依 存性に上昇した(Figure 7)｡一方､ pac02には変動がなかった(Figure 7)｡腸管 内投与するFC-77の容量を2倍にしてもpa02の上昇に差がなかった｡一方､100%

酸素で飽和されたFC-77を腹腔内に投与しても､同様にPa02は時間依存性に

上昇したが､ pac02は軽微ながら低下する傾向が認められた(Figure 8)｡ FC･77 投与後､ 4時間の時点でPa02とpac02の変化を比較すると､腸管内投与に比較 して､腹腔内投与でPa02が高値で､ PaC02が低値だった(Figure 9)｡ FC-77に接触した腸管粘膜や腹膜に組織学的な変化は認められなかった｡

小括

腸管内に投与したFC-77から酸素を移行させ､ pa02を上昇させることができた｡

しかも､このPa02のレベルは80Torr以上を達成しており､肺胞低換気に対す

る補助的な酸素デリバリーとなり得た｡しかし､ FC-77を腸管内ではなく､腹

腔に投与すると､さらに良好な酸素化が得られただけでなく､ paC02を低下さ

せることもできた｡

考察

本研究は､肺移植へのブリッジとして､腸管を用いた1iquid ventilationを目指す

ものである｡ここで得られた成績は､腸管や腹腔を用いた肺以外のliquid

ventilationは可能であることを示している｡しかし､それは必ずしも腸管の利 用を積極的に支持するものではなかった｡むしろ､腹腔を用いたIiquidventilation

の方が良好なpa02の改善とpac02の排滑という観点から､臨床応用に近いと

結論せざるを得ない｡

腸管粘膜を介した酸素の移行は､腸管粘膜の面積と血流量によって大きく規定

されると考えられる(4)｡本研究の動物実験で､ FC-77を腸管内に投与するより

も､腹腔内に投与したほうがpa02の改善が良く､さらにpaC02を減少させる

ことができた理由は､こうした理由から説明可能であろう｡腹腔内に投与する

と､その比重によってFCは腸管膜の間にも広く分布し､腸管内に投与するよ

りも接触面積が広いと考えられる｡また､腸管膜の血流に加え､腹壁を遼流す

る血液も酸素化の対象となり､より速やかなpa02の改善がもたらされたと言え

る｡

腸管内投与でも大量のFCを用いることができれば､十分な酸素化と炭酸ガス

の排池が可能かも知れない｡本研究では､ FC-77の容量を倍増させた実験も行

ったが､必ずしも良好な酸素化には至らず､むしろ拡張した腸管による胸部圧

迫で肺胞低換気が増悪した(data not shown)｡したがって､大量のFCを用いる

15

-マに作成した上で､間欠的また持続的に注腸する方法もあり得る｡事実､最

近､腸管内を大量のFCで潅流して良好な酸素化が得られたとの研究報告がな

されている(3)｡しかし､これを臨床の場において呼吸不全患者に適用すること

を考えると､ストーマ作成のための手術が負荷されることになり､手術侵峯と

コスメティックな面の双方からためらいがある｡さらに､持続潅流装置を患者

に装着することは､真のQOLを高めることにはなり得ないであろう｡我々は､

liquid ventilationが真の肺移植へのブリッジとして活用されるには､他のルート

を探求すべきではないだろうかと考えた｡

一方､腹腔はより現実的なliquid ventilationの場と言える｡腹膜潅流程度の小手 術が負荷されるだけで腸管内投与よりも有効なliquid ventilationが実現でき､

mvityが広いので､大量のFCを留置させておくことも可能であろう｡このこと

で､持続腹膜潅流装置は必ずしも必須ではなく､もし臨床応用できれば患者の

QOL保持にも有益と考えられる｡腹腔を用いた1iquid ventilatiomは､以前には

潅流装置を用いて試みられていた(4)｡今回､我々は潅流ではなく､一回投与

でも肺胞低換気による低酸素血症からの離脱に十分な酸素化が得られることを

兄いだした｡このことは､現在の人工透析と同様の管理で､外来通院あるいは

在宅でも使用可能なルートとなり得ることを示している｡

ただし､腹腔を用いたliquid ventilationでも十分に解決されない問題は炭酸ガス の除去であった｡腹腔を用いたliquid ventilationでは腸管を利用した場合に比較

してPC02の低下は大きかったが､依然として高炭酸ガス血症の状態を離脱す

ることは出来なかった｡肺以外の臓器を用いたliquid ventilationの実現の鍵は炭

酸ガスを大気に排滑する効果的なディバイスにあると考えられる｡

perfuluorocarboneを肺に用いることで､効果的な酸素化が得られること､また perfu1uoro租rboncは肺胞マクロファージから放出される種々のサイトカインを シールすることで肺の炎症を防御することから､ liquid ventilationは主にCritical careの分野で注目されてきた｡現在､急性呼吸不全患者に対するperfu1uorocarboTle を用いた肺のliquid ventilationに関するUSAでの多施設共同研究は未だその有

用性を証明していない(1)｡しかし､本研究を通じて､急性肺傷害の治療のツー

ルとしてだけではなく､慢性呼吸不全患者が肺移植を受けるまでのブリッジと

してliquid ventilationを用いるというオプションはさらに検討されるべき課題で ある｡ただし､ liquidventilationに用いる不活性溶液は種々の細胞に取り込まれ､ その機能を修飾する可能性がある(5)｡したがって､ liquid ventilationを長期に使

用することを想定し､今後は免疫担当細胞機能におよぼす影響なども検討して

いく必要があろう｡

17

椿静

酸素溶解能が高い不活性溶液用いた1iquid ventilationが､肺ではなく､腸管を用

いて可能かどうかを検討するために､ FC-77を用いた基礎的実験を行った｡そ

の結果､腸管を用いたliquid ventilationは実現可能であるとの確信を得た｡しか

し､酸素化と炭酸ガス除去の効率を考慮すると､腸管を用いるよりも腹腔を用

いた方がより効果的との結論が得られた｡そして､これを臨床応用するにあた

り2つの重要な課題､すなわちFC-77から炭酸ガスを大気に排滑する効果的な

ディバイスの開発､種々の細胞機能におよぼすFC-77の長期的な影響､を提起

することができた｡

文献

1. Hirschl RB, Crocc M, Gore D, Wiedemann ll, Davis K, ZwischenbeTger J, Bartlett RH･ Prospective, randomized, controlled pilot study of partialliquid ventilation in

adult acute respiratory distress syndrome.AnJ Respir Crit Care Med 165;

781-787, 2002.

2. Yon der llardt K, Schoof E, Kandler MS, D6tsch J, Rascher W. Aerosolized perfuluorocarbone suppress carly pulmoJlary inflammatory response in a

surfactant-depleted piglet model. Pediatr Res 51; 177-182, 2002.

3.宮口直之､末永格､中西英博､青江基､佐野由文､伊達洋至､安藤陽夫､

清水信義. perfu1uorocarbone:FC-77の消化管内潅流による呼吸補助の実験的

検討.日本呼吸器外科学会雑誌103;A435, 2002.

4･ Klein J, Faithfull NS, Salt PJ, Trowborst A. Transperitonealoxygenation with

fluorocaTboJleS.AnethAnalg 65; 734-738, 1986.

5. R屯diger M, Wissel H, Ochs M, Burkhardt W, Proquitti H, Wauer RR, Stevens P,

R丘stow B. Perfuluoro租rbones are taken up by isolated type II pneumocytes and

19

図の説明

Figure lA. ガス分圧の推移｡ (A)末梢静脈｡ 100%酸素で飽和されたFC-77

と混和すると､末梢静脈血は速やかに酸素化され､ p02は混和開始から1分で

ほぼ最大となった｡一方､末梢静脈血のPCO之はFC-77と混和することにより 軽度低下した｡ (B) FC-77｡ 100%酸素で飽和されたFC-77では､血液との混和 によりp02は急速に低下し､ pc02が上昇した｡ Figure2.  室内気と100%酸素の比較｡室内気で飽和されたFC-77と混和

しても末梢静脈血のP02の上昇とpc02の低下が認められた｡ただし､そのP02

は100%酸素を用いた場合の約2/3にとどまった｡

Figure 3.  培養細胞層透過実験装置｡ (A) HPjuC｡ (B)A549細胞｡

Figure 4.  HPAEC培養液のガス分圧の推移｡ (A) P02｡lmer chamberに培

養液を､ outer dlamberに100%酸素で飽和されたFC-77を注入した実験では､ 実験開始から10分でに培養液のP02が最大となった｡ (B) PC02｡ PC02は緩や

かに時間依存性に低下した｡

Figure 5.  HPAEC培養液のガス分圧｡実験開始から30分の時点における P02は有意に上昇し､ pc02は有意に低下した｡ N=3｡ *:p<0.05byANOVA｡ Figure 6.  培養液のガス分圧の変化の比較｡ HPAECとA549細胞で実験開

始から30分の時点におけるP02の上昇とpc02の低下を比較すると､両者とも

A549で有意に大きかった｡ N=3｡ *:pく0.05byANOVA｡ Figure 7.  FC-77腸管内投与後の肺胞低換気ラットの動脈血ガス分圧の推 移｡ 100%酸素で飽和されたFC-77を肛門から腸管内に注入すると､ pa02は時 間依存性に上昇した一方､ pac02には変動がなかった｡ Figure 8.  FC-77腹腔内投与後の肺胞低換気ラットの動脈血ガス分圧の推 移｡ 100%酸素で飽和されたFC-77を腹腔内に投与すると､ pa02は時間依存性 に上昇し､ pac02は軽微ながら低下する傾向が認められた｡ Figure 9.  FC-77投与経路の違いによる肺胞低換気ラットの動脈血ガス分 圧の差｡ FC-77投与後､ 4時間の時点でPaO之とpac02の変化を比較すると､腸 管内投与に比較して､腹腔内投与でPa02が高値で､ PaC02が低値だった｡ N= 3｡ *: pく0.05 byANOVA｡

2      4      6

lncubation time (min)

Figure lA

ーPO2

8 PCO2

( J J o ト ) u O ! S u O I S t 2 6 p o o l 血 0 0

0      2      4      6 lncubation time (m叫

Figure lB

ーFC-77 PO2

8 FC-77 PCO2

  0       0   0       0 3 2 ! S u a l S t 2 9

aiトFC oxygen-FC

Figure 2

I po2

EZ] PCO2

( ヒ o t ) u O ! S u a t S t 2 9

Figure 3

FC-77

FC-77 A549 ce‖s

0    10     20    30

Incubation time (min)

10     20     30

lncubation time (…in)

Figure 4B

  0 2 o D d 0 0

30 m舌n

Figure 5

( ヒ o t ) N o d O r . 山 引 ■ ( ヒ o t ) N o o °

A549

Figure 6

O ! S u O I S t 2 6 u ! O D u G u の ⊆ 凸

60     1 20    1 80    240 Time (min)

Figure 7

-●･ PaO2

--0- PaCO2

( ヒ O 卜 ) u O ! S u a l S t 2 6 p o o l q ] ? ! J a 亡 V

60     1 20    1 80     240 Time (min)

Figure 8

■ト PaO2 1} PaCO2 ! S u a t S t 2 6 p o o ] q 一 t 2 ! ) 0 亡 V   8 0 7 0   6 0   5 0

colon peritoneum

Figure 9

( ヒ O 卜 ) u O ! S u G I t S t 2 6 u ! e o u a J 選 ! Q