Microsoft PowerPoint - 抗体同定_基礎_高知_配布.pptx

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不規則抗体検査

オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社イムノヘマトロジー事業部古杉光明

赤血球輸血検査における最終の目的



患者体内において抗原抗体反応を起こさせないこと

– ABOオモテ／ウラ検査 – 不規則抗体スクリーニング – 交差適合試験 

患者に新たなる免疫をさせないこと

– RhD検査 – 自己免疫性溶血性貧血患者への同型抗原血の供給 2

(2)

検体の採取と管理



血球浮遊液の性状と血球濃度



血清：血球の比率



反応増強液の種類と使用法



加温の時間と温度



遠心強度と時間



試験管の内容物のその取り扱い



結果の転記



検査者の精神状態

偽陽性・偽陰性発生の主な要因

採血管の種類・検体の状態・保管場所など 3% or 4%？生食のpHは？ 1滴は50μL 1：80↑ 注意点・禁忌事項は？ 37℃？ 15分 or 10分？遠心力(ｇ)・時間は適切？ 3 52μL 58μL 68μL 120μL 144μL 168μL

血清は血球沈渣量の80倍以上

ピペットの形態と滴下量の変化

4

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抗体同定を行うにあたって

• 不規則抗体スクリーニングの反応性を考慮して実施何法で検出されていたか反応強度はどうか血球ごとに反応強度のばらつきはなかったか • 自己対照を実施し非特異的な反応を排除する自己血球は専用のアルセバー液で浮遊陽性となった場合には近々の輸血歴を確認する陽性且つ輸血歴ありの場合は解離試験の実施を考慮する 5

本日の内容

• 抗体同定を行う前に

不規則抗体の産生と特徴抗体同定検査進め方の基本

• 抗体同定を難しいものにしている原因と検査の進め方

微弱な抗体の存在複数の抗体の共存顕著な量的効果を示している場合抗原そのものの強さに著しい個体差がある場合抗体が一般的な血清学的性状を示していない場合 6

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同種免疫の機会

E＋ E-妊娠・出産 7

同種免疫の既往による同種抗体保有率

日本輸血学会雑誌第43巻 3号 1997より抜粋九州大学医学部附属病院（1984～1994）患者総数 8,931 男性輸血妊娠輸血輸血・妊娠 3534 1322 1416 1489 466 704 抗体保有1 197 35 4 48 50 22 38 0.99% 0.30% 3.39% 3.36% 4.72% 5.40% 抗体保有2 83 0 0 31 15 14 23 0% 0% 2.19% 1.01% 3.00% 3.27% 男性女性 0.80% 3.88% 0% 2.04% 保有率保有率 2.21% 0.93% 4,856 4,075 女性同種免疫既往なし同種免疫既往あり抗体保有2：抗Lea_{, -Le}b_{, -P} 1, -H, 自己抗体, 同定不能例を除く 8

(5)

遅延型溶血性輸血副作用報告

2007～2012年 UK SHOT報告より D C E c e Cw _f _K _k _Kpa _Fya _Fyb _Fy3 2007 2 4 1 0 1 0 0 1 0 1 4 0 0 2008 0 2 10 4 0 1 1 3 1 0 4 0 1 2009 2 4 7 5 0 1 0 7 0 0 2 1 2 2010 1 1 11 2 0 0 0 2 0 0 4 1 0 2011 2 3 4 3 0 2 0 4 0 0 4 0 0 2012 1 2 9 4 0 1 1 5 0 0 4 1 1 Jka _Jkb _M _N* _S _U _Lua _Lub _HTLA _A₁ Au t o -D 2007 6 5 1 0 2 0 1 1 1 0 0 2008 22 10 2 1 3 0 1 0 0 0 0 2009 12 6 1 0 4 0 1 0 0 1 1 2010 10 5 2 1 2 0 1 1 0 0 0 2011 6 5 0 0 1 1 0 0 0 0 1 2012 15 6 1 0 4 1 0 0 0 0 1 36 57 計 31 66 57 44 9

抗体産生

抗体検出感度抗体量時間抗原刺激（1回目）抗原刺激（2回目）０ RBC 感作血球 10

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重篤な副作用発症までの日数分布

UK SHOT報告より 2009年 2010年 2011年 2012年 11

不規則抗体の消長

Transfusion, Vol. 40, 2000より一部改編 1978～1998 Lyenburg Hosp. 抗体検出数全体頻度消失抗体数頻度抗K 166 28.0% 48 28.9% 抗E 136 22.9% 52 38.2% 抗D 118 19.9% 15 12.7% 抗Fya ₅₅ _9.3% ₇ _12.7% 抗C 49 8.3% 9 18.4% 抗c 28 4.7% 9 32.1% 抗Jka 17 2.9% 6 35.3% 抗S 10 1.7% 1 10.0% 抗Jkb 6 1.0% 4 66.7% 抗e 5 0.8% 1 20.0% 抗Fyb 2 0.3% 0 0.0% 抗s 1 0.2% 1 100.0% Total 593 - 153 -中央値平均値期間幅抗e 3 33% 39 39 1-76 抗D 17 47% 34 58 1-193 抗S 10 10% 23 45 1-182 抗c 22 32% 8 13 1-60 抗E 91 24% 7 20 1-182 抗K 108 34% 6 25 1-188 抗Fya 28 14% 6 24 1-162 抗C 16 25% 6 18 1-73 抗Jkb 5 6 0% 3 9 1-26 抗体消失期間（月）抗体検出数頻度 12

(7)

不規則抗体スクリーニング/抗体同定の基本事項

患者血清中に存在する可能性のある抗

体を否定していく作業

• 抗原陽性血球を用い適切な検査方法による

反応結果

陰性を以って証明

をすることを条件とする。

• 反応の陽性/陰性だけでなく、反応強度の差異を観察

することがより重要となる。

13

抗体同定の手順とルール

1. 反応パターンを優先し特異性を予想

① 溶血の有無の観察 ② 反応強度の差異/免疫血清学的反応態度の観察 ③ 自己コントロールの観察

2. 消去法の実施

3. 抗血清による患者抗原タイピング

4. 適切な追加パネルの選択（有効血球の選択）

14

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No. Rh-hr

Donor

Number D C E c e f Cw V K k Kpa Kpb Js a Jsb FyaFybJkaJkb Xga Lea Leb S s M N P1Lua Lub Dia

Cell No. 生食 I AT 酵素 1 R1R1 115414 + + 0 0 + 0 0 0 + + 0 + 0 + + + 0 + 0 0 + 0 + + + + 0 + 0 1 1+ w+ 0 2 R2R2 312517 + 0 + + 0 0 0 0 0 + 0 + nt + 0 + + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 + 0 2 2+ 2+ 3+ 3 rr 311365 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + nt + + 0 0 + + + 0 + + + 0 + 0 + 0 3 2+ 1+ 0 DiaR2r DIA904 + 0 + + + + 0 0 + + 0 + nt + + 0 0 + + 0 + 0 + + + + 0 + + 4 1+ 2+ 2+ Cell No. Rh-hr Donor

Number D C E c e f Cw V K k Kpa Kpb Js a Jsb FyaFyb JkaJkb Xga Lea Leb S s M N P1Lua Lub Dia

Cell No. 生食 I AT 酵素 1 R1R1 115414 + + 0 0 + 0 0 0 + + 0 + 0 + + + 0 + 0 0 + 0 + + + + 0 + 0 1 0 0 0 2 R2R2 312517 + 0 + + 0 0 0 0 0 + 0 + nt + 0 + + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 + 0 2 0 3+ 4+ 3 rr 311365 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + nt + + 0 0 + + + 0 + + + 0 + 0 + 0 3 0 w+ 1+ DiaR2r DIA904 + 0 + + + + 0 0 + + 0 + nt + + 0 0 + + 0 + 0 + + + + 0 + + 4 0 3+ 4+ Cell No. Rh-hr Donor

Number D C E c e f Cw V K k Kpa Kpb Js a Jsb FyaFyb JkaJkb Xga Lea Leb S s M N P1Lua Lub Dia

Cell No. 生食 I AT 酵素 1 R1R1 115414 + + 0 0 + 0 0 0 + + 0 + 0 + + + 0 + 0 0 + 0 + + + + 0 + 0 1 0 1+ 0 2 R2R2 312517 + 0 + + 0 0 0 0 0 + 0 + nt + 0 + + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 + 0 2 0 2+ 0 3 rr 311365 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + nt + + 0 0 + + + 0 + + + 0 + 0 + 0 3 0 0 0 DiaR2r DIA904 + 0 + + + + 0 0 + + 0 + nt + + 0 0 + + 0 + 0 + + + + 0 + + 4 0 0 0

抗体同定の手順とルール（Step 1）

反応パターンを優先し特異性を予想

「可能性の高い抗体」とは、陽性反応を呈した赤血球において ⅰ)反応パターンが、抗原表のいずれか１つの特異性と完全に一致する抗体（単一抗体） ⅱ)異なる検査法で得られた反応パターンが、抗原表の特異性とそれぞれ完全に一致する抗体（複数抗体）とする。 15

抗体同定の手順とルール（Step 2）

消去法の実施

量的効果を考慮しつつ、反応が陰性の血球における陽性の抗原を消去「否定される抗体」の特定と「否定できない抗体」の推測 検査結果のプロセスを正しく残す(なぜ消去したかを明確にする) 全検査結果陰性ドナーにおけるホモ接合血球は×でマークする全検査結果陰性ドナーにおけるヘテロ接合血球は / でマークする ×のマークされた抗原表記欄のみを×マークする Cell

No. Rh-hr S s M N IAT Fic

1 R1R1 0 + + + 1+ 0 2 R2R2 + 0 + 0 3+ 0 3 rr + + 0 + 0 0 0 NT • 可能性の高い抗体：抗M • 否定できない抗体：抗S, 抗s 16

(9)

量的効果とは（Jk

b

_{抗原と抗Jk}

b

_の例）

抗Jkb 抗グロブリン試薬不規則抗体ｽｸﾘｰﾆﾝｸﾞ・交差適合試験ﾎﾓ接合血球ﾍﾃﾛ接合血球抗Jkb_{保有患者1} 3+ 1+ 抗Jkb_{保有患者2} 2+ 0 例ヘテロ接合遺伝子型：JKA/JKB 表現型： Jk (a+ b+) 抗原Jkb ホモ接合遺伝子型：JKB/JKB 表現型： Jk (a- b+) 抗原Jｋa 対立抗原 17

抗体の希釈に伴う反応性の変化

Reverberi R, et al. Blood Transfusion Vo. 7, 2007より引用 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 ×1 ×2 ×3 ×4 抗K 抗D 抗c 陰性 Ig G /c e lls 希釈率 2+ 1+ 18

(10)

抗原発現頻度

Kell Lutheran Diego

K+k- 0.2% Kp(a+b-) <0.1% Lu(a-b+) 92.35% Di(a+) 0%

Caucasian

K+k+ 9% Kp(a+b+) <2% Lu(a+b+) 7.5% Di(a+) 36%

America Indian

K-k+ 91% Js(a+) 0%

Caucasian Lu(a+b-) 0.15% Di(a+b-) 0.15% Japanese

K-k- 0% Js(a+) 18% _Black Lu(a-b-) 0% Di(a+b+) 8.26%_Japanese

不規則抗体スクリーニング用試薬としての供給限界

特殊仕様として供給  スクリーニング赤血球： Di(a+)：日本, Kp(a+)：東欧, Cw(+)：北欧, Mi(a+)：東南アジア  パネル赤血球： Cw(+)（リゾルブパネルA/C), K+k-, DCCEe (リゾルブパネルB) 19

抗体同定結果解釈の基本事項



反応パターンを最優先に特異性を決定



反応強度の違いより複数の抗体や量的効果の考察



量的効果を考慮した共存抗体の消去

メイン13抗原に実施(D, C, E, c, e, Fya, Fyb, Jka, Jkb, M, N, S, s) その他における量的効果は原則反映しない (K, k, Jsa_{, Js}b_{, Kp}a_{, Kp}b_{, Lu}a_{, Lu}b_{, Di}a_{, Di}b₎ 

免疫血清学的反応態度からの

推測

（何法で反応したか）



抗原性(個体差)を考慮した考察の実施

Fyb_{, Xg}a_{, Le}a_{, Le}b_{, P} 1, (Jra, Ch, Rg) 

Silent geneの可能性を考慮

Duffy, Kidd, MNS 20

(11)

特異性の決定と血液供給

赤血球型検査ガイドラインより（一部省略） 6.1.不規則抗体スクリーニングで陽性の場合、不規則抗体同定用のパネル赤血球を用いて不規則抗体の特異性を決定し、臨床的意義について考慮する。 6.1.2. 消去法による‘否定できない抗体’の推定は、輸血を前提とした場合、原則として間接抗グロブリン試験の結果を用いて行う。ただし、オモテ・ウラ不一致の原因を検索する場合や、低温反応性抗体が間接抗グロブリン試験の反応に影響する。場合においては、生理食塩液法での消去法が有益な場合がある。 6.2. 6.1.1.および6.1.2.で推定した抗体特異性をもとに追加試験を実施し、その結果および患者情報などから総合的に評価して不規則抗体を同定する。 6.3. 不規則抗体がすでに同定されている患者については、新たに産生される可能性のある不規則抗体の有無について検査する。 6.9.酵素法や室温相(18～25℃)での生理食塩液法は、不規則抗体同定に有効な場合がある。Rh 血液型に対する抗体などが間接抗グロブリン試験で弱く反応する場合や複数抗体の混在が疑われる場合では、とくに酵素法が有用である。 6.10. 低温反応性抗体によって、生理食塩液法のみならず反応増強剤を加えた間接抗グロブリン試験でも陽性になることがある。その場合は、反応増強剤無添加の間接抗グロブリン試験を試みる。 6.11.酵素法や生理食塩液法で検出された不規則抗体は、上記5.2.1の高感度な間接抗グロブリン試験で検出されず、かつ3カ月以内に輸血歴や妊娠歴がなければ、原則として抗原陰性血の適応とはならない。 Cell No. Rh-hr Donor

Number D C E c e f Cw V K k Kpa Kpb Jsa Jsb Fya Fyb Jka Jkb Xga Lea Leb S s M N P1 Lua Lub Dia Cell No. 生食 IAT CC 酵素

1 R1 w R1 302522+ + 0 0 + 0 + 0 0 + 0 + 0 + 0 + + + 0 0 + + + 0 + + 0 + 0 1 0 1+ NT 0 2 R1R1 117395+ + 0 0 + 0 0 0 + + 0 + 0 + + 0 + + + 0 0 + 0 + 0 + 0 + 0 2 0 1+ NT 0 3 R2R2 108419+ 0 + + 0 0 0 0 0 + 0 + 0 + 0 + + + + 0 + 0 + + + 0 0 + 0 3 0 w+ NT 0 4 Ror 301474+ 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + 0 + 0 0 0 + + 0 + 0 + + + +s 0 + 0 4 0 0 + 0 5 r'r 117054 0 + 0 + + + 0 0 0 + 0 + 0 + + + 0 + + 0 0 + + + + 0 0 + 0 5 0 0 + 0 6 r"r 71310 0 0 + + + + 0 0 0 + 0 + 0 + + + 0 + + 0 + 0 + + + + 0 + 0 6 0 0 + 0 7 rr 116910 0 0 0 + + + 0 0 + + 0 + 0 + 0 + + 0 + 0 + + + + 0 + 0 + 0 7 0 1+ NT 0 8 rr 302186 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + 0 + 0 + + 0 + + 0 0 + 0 + + + + 0 8 0 1+ NT 0 9 rr 105482 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + 0 + + 0 0 + 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 9 0 0 + 0 10 rr 114888 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + 0 + 0 + + + + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 10 0 w+ NT 0 11 R1R1 303524+ + 0 0 + 0 0 0 0 + 0 + 0 + 0 + + + + + 0 + 0 + 0 + 0 + 0 11 0 w+ NT 0 AC 0 0 + 0

消去法実施

22

(12)

Fisher & Race Wiener 発現イメージ f抗原

Dce R₀ あり DCe R₁ なし DcE R₂ なし DCE R_z なし dce r あり dCe r’ なし dcE r” なし dCE r_y なし

f (ce) 抗原について(イメージ)

E C e c f抗原は、c抗原とe抗原が同一ハプロタイプ（cis)として保有している場合に発現する複合抗原である。抗fは、抗cや抗eとともに検出されることがあり、顕著な量的効果を示すことが知られている。 D D D D c c c e e e C C C E E E e c

4. R

₀

r = D

ce

/d

ce

5. ｒ’ｒ = dCe/d

ce

6. r”r = dcE/d

ce

7. rr = d

ce

/d

ce

(～10) 23

抗体同定の手順とルール（Step 3）

抗血清による患者抗原タイピング

自身が持つ抗原に対する抗体は原則産生されない → 抗原陽性なら抗体否定が可能例）患者血球がE抗原を持っているならば、抗Eは持たないので否定患者自己抗原性の検証においては4ヶ月以内の輸血歴の確認が必須（時期・輸血量）→誤判定の回避抗原日本人における陰性血頻度抗原日本人における陰性血頻度 C 約12% Jka _約30% E 約50% Lea _約90% Cw _ほぼ100% _S _約90% K ほぼ100% N 約20% Fyb _約80% _Dia _約90% 24

(13)

Cell No. Rh-hr

Donor

Number D C E c e f Cw V K k Kpa Kpb Jsa Jsb Fya Fyb Jka Jkb Xga Lea Leb S s M NP1 Lua Lub Dia Cell No. 生食 IAT CC 酵素

1 R1wR1 302522+ + 0 0 + 0 + 0 0 + 0 + 0 + 0 + + + 0 0 + + + 0 + + 0 + 0 1 0 1+ NT 0 2 R1R1 117395+ + 0 0 + 0 0 0 + + 0 + 0 + + 0 + + + 0 0 + 0 + 0 + 0 + 0 2 0 1+ NT 0 3 R2R2 108419+ 0 + + 0 0 0 0 0 + 0 + 0 + 0 + + + + 0 + 0 + + + 0 0 + 0 3 0 w+ NT 0 4 Ror 301474+ 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + 0 + 0 0 0 + + 0 + 0 + + + +s 0 + 0 4 0 0 + 0 5 r'r 117054 0 + 0 + + + 0 0 0 + 0 + 0 + + + 0 + + 0 0 + + + + 0 0 + 0 5 0 0 + 0 6 r"r 71310 0 0 + + + + 0 0 0 + 0 + 0 + + + 0 + + 0 + 0 + + + + 0 + 0 6 0 0 + 0 7 rr 116910 0 0 0 + + + 0 0 + + 0 + 0 + 0 + + 0 + 0 + + + + 0 + 0 + 0 7 0 1+ NT 0 8 rr 302186 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + 0 + 0 + + 0 + + 0 0 + 0 + + + + 0 8 0 1+ NT 0 9 rr 105482 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + 0 + + 0 0 + 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 9 0 0 + 0 10 rr 114888 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + 0 + 0 + + + + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 10 0 w+ NT 0 11 R1R1 303524+ + 0 0 + 0 0 0 0 + 0 + 0 + 0 + + + + + 0 + 0 + 0 + 0 + 0 11 0 w+ NT 0 + + + + + 0 + 0 0 + 0 + 0 + + + 0 AC 0 0 + 0

患者抗原のタイピング

⇒患者は抗D, -C, -E, -Lea_{, -Nは産生しない} 25 • 可能性の高い抗体 • 否定できない抗体抗Jka

抗Cw_{, -V,}_-K,_-Kpa_{, -Js}a_-Fyb_{, -S,}_-Lua_,_-Dia

抗体同定の手順とルール（Step 4）

適切な追加パネルの選択（有効血球の選択）

 共存する可能性が否定できない抗体に対応する抗原陽性血球および全陰性血球を指す  複数の抗体が残った場合、対応抗原が1種のみ陽性のものが理想  血球の選択には可能な限りホモ接合を選択する A B C D E + 0 0 0 0 0 + 0 0 0 0 0 + 0 0 0 0 0 + 0 0 0 0 0 + 0 0 0 0 0 K Jka Jkb Fya Fyb S s Dia

+

0 +

+

0

0 +

0

0 +

0

0 +

0

0 +

0

0 +

+

0 +

0

0 +

+

0

0 +

+

0

0 +

+

0

0 +

0

26

(14)

追加パネル（有効血球の選択）

共存する可能性が否定できない抗体について優先順位をつける（反応強度/免疫血清学的反応態度） 可能性の低い抗原を複数種陽性なものと組み合わせて選択 A B C D E + 0 0 0 0 0 + 0 0 0 0 0 + + 0 0 0 0 + 0 0 0 + 0 + K Jka Jkb Fya Fyb S s Dia

+

0 +

+

0 +

0

0 +

0

0 +

0

0 +

+

0

0 +

+

0

0 +

+

0

0 +

0

全ての血球をランダムにあてるものではない •貴重な患者血清の浪費 •検査コストの上昇 27

追加パネル結果

Cell No. Rh-hr Donor

Number D C E c e f Cw V K k Kpa Kpb Jsa Jsb Fya Fyb Jka Jkb Xga Lea Leb S s M N P1 Lua Lub Dia Cell No. 生食 IAT CC酵素

1 R1wR1 316230 + + 0 0 + 0 + 0 0 + 0 + 0 + 0 + 0 + + 0 + 0 + + 0 + + + 0 1 0 0 + 0 2 R1R1 93121 + + 0 0 + 0 0 0 + + 0 + 0 + + 0 0 + 0 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 2 0 0 + 0 3 R2R2 318636 + 0 + + 0 0 0 0 0 + 0 + 0 + 0 + 0 + + 0 + + + + 0 + 0 + + 3 0 0 + 0 4 Ror 304619 + 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + 0 + 0 0 + 0 + 0 0 0 + 0 + + 0 + 0 4 0 1+ NT 0 AC Cell No. Rh-hr Donor

Number D C E c e f Cw V K k Kpa Kpb Jsa Jsb Fya Fyb Jka Jkb Xga Lea Leb S s M N P1 Lua Lub Dia Cell No. 生食 IAT CC酵素

1 R1wR1 316230 + + 0 0 + 0 + 0 0 + 0 + 0 + 0 + 0 + + 0 + 0 + + 0 + + + 0 1 0 0 + 0 2 R1R1 93121 + + 0 0 + 0 0 0 + + 0 + 0 + + 0 0 + 0 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 2 0 0 + 0 3 R2R2 318636 + 0 + + 0 0 0 0 0 + 0 + 0 + 0 + 0 + + 0 + + + + 0 + 0 + + 3 0 0 + 0 4 Ror 304619 + 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + 0 + 0 0 + 0 + 0 0 0 + 0 + + 0 + 0 4 0 1+ NT 0 AC • 可能性の高い抗体 • 否定できない抗体抗Jka 抗Kpa_{, -Js}a

(15)

同定結果の確認（Fisherの計算式）

総血球数=N 反応結果陽性反応結果陰性抗原陽性血球 A B 抗原陰性血球 C D

(A+B)! ×(C+D)! ×(A+C)! ×(B+D)!

N! ×A! ×B! ×C! ×D!

×100

1 -⇒統計学的手法で自身の行った検査の確からしさを求めておく！

適切な精度管理が行われているケースでは Harris & Hochman法やKanter法を用いるケースもある

29

抗体同定の手順（考え方）

不規則抗体スクリーニング血球との反応性反応パターンの優先と適切な消去法実施免疫血清学的反応態度による推測免疫血清学的反応態度による推測同定用パネル血球との反応性反応パターンの優先と適切な消去法実施患者抗原タイピングによる否定/肯定適切な追加パネルによる否定/肯定自己コントロール/DATの観察当該抗体あり如何に適切な反応を導けるか！ 30

(16)

© Ortho Clinical Diagnostics 2017 IHT‐1626  D抗原の反応性 R2R2> R1R2≧ R1R1≧ R1r etc.  c 抗原の反応性 rr > R2R2  複合抗原に対する抗体抗G (抗D, -C, -G) 抗ｆ (抗e, -f, 抗c, -f)  抗Lea, -Leb Le(a-b-)以外のTypeは一般的に不規則を保有しない保有した場合抗Lea_{, -Le}b_で存在  抗E, -c + α複合 R1R1+ R1R2で日本人の約80％を占める  特定の抗原保有者における制限事項抗D保有患者における抗C及び抗Eは、該当抗原保有者以外は否定されない抗ｃ保有患者における抗Eは、該当抗原保有者以外は否定されない

一般的な留意事項

31

同定が困難となる主な原因

 複数の抗体の共存

キーは「反応の単純化」

32

(17)

Donor

Number D C E c e K k Fya Fyb Jka Jkb Xga Lea Leb S s M N P1 Dia

Cell No. 生食 I AT CC 酵素 1 R1wR1 307281 + + 0 0 + 0 + 0 + + + 0 0 + + + + + +s 0 1 0 1+ NT 0 2 R1R1 312652 + + 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 0 + 0 + + 0 0 2 0 2+ NT 0 3 R2R2 312653 + 0 + + 0 0 + 0 + + 0 0 0 + + + + + +s 0 3 0 2+ NT 2+ 4 Ror 306360 + 0 0 + + 0 + 0 0 + + 0 0 0 0 + + 0 + 0 4 0 1+ NT 0 5 r'r 311432 0 + 0 + + 0 + 0 + + 0 0 0 + 0 + + + + 0 5 0 2+ NT 0 6 r"r 309636 0 0 + + + 0 + 0 + 0 + + 0 + + + + 0 +s 0 6 0 2+ NT 2+ 7 rr 304753 0 0 0 + + + + 0 + + + 0 0 + + + 0 + 0 0 7 0 1+ NT 0 8 rr 303519 0 0 0 + + 0 + + + + 0 0 + 0 0 + 0 + +s 0 8 0 2+ NT 0 9 rr 312630 0 0 0 + + 0 + + 0 + 0 + 0 + + 0 + 0 0 0 9 0 2+ NT 0 10 rr 306864 0 0 0 + + 0 + + + 0 + + 0 0 + + + + + 0 10 0 0 + 0 11 R1R1 312651 + + 0 0 + + + 0 + 0 + + + 0 + + + 0 + 0 11 0 0 + 0 AC 0 0 + 0

複数抗体の共存１

可能性の高い抗体：オーバーラップしているドナーの反応強度の注視抗E，（抗Jka_）抗体同定では免疫血清学的反応態度の違いの理解が有力な手段になる 33 Cell No. Rh-hr Donor

Number D C E c e K k Fya Fyb Jka Jkb Xga Lea Leb S s M N P1 Dia

Cell No. 生食 I AT CC 酵素 I AT 1 R1wR1 307281 + + 0 0 + 0 + 0 + + + 0 0 + + + + + +s 0 1 2+ 2+ NT 0 1+ 2 R1R1 312652 + + 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 0 + 0 + + 0 0 2 2+ 1+ NT 0 0 3 R2R2 312653 + 0 + + 0 0 + 0 + + 0 0 0 + + + + + +s 0 3 2+ 1+ NT 0 0 4 Ror 306360 + 0 0 + + 0 + 0 0 + + 0 0 0 0 + + 0 + 0 4 3+ 2+ NT 0 1+ 5 r'r 311432 0 + 0 + + 0 + 0 + + 0 0 0 + 0 + + + + 0 5 2+ 1+ NT 0 0 6 r"r 309636 0 0 + + + 0 + 0 + 0 + + 0 + + + + 0 +s 0 6 2+ 2+ NT 0 2+ 7 rr 304753 0 0 0 + + + + 0 + + + 0 0 + + + 0 + 0 0 7 0 1+ NT 0 1+ 8 rr 303519 0 0 0 + + 0 + + + + 0 0 + 0 0 + 0 + +s 0 8 0 0 + 0 0 9 rr 312630 0 0 0 + + 0 + + 0 + 0 + 0 + + 0 + 0 0 0 9 3+ 1+ NT 0 0 10 rr 306864 0 0 0 + + 0 + + + 0 + + 0 0 + + + + + 0 10 2+ 2+ NT 0 2+ 11 R1R1 312651 + + 0 0 + + + 0 + 0 + + + 0 + + + 0 + 0 11 3+ 2+ NT 0 2+ AC 0 0 + 0 0

複数抗体の共存2

可能性の高い抗体：生理食塩液法陽性抗体共存時にPEG-IATと無添加-IATの感度差を考慮抗M, （抗Jkb_）抗体同定では酵素やChemicalの作用を利用し複数抗体を鑑別 34

(18)

酵素処理とは

⊖

私は酵素ｫ～♪ そりゃぁ～！！大木がなくなることで・・・根元の抗原が露出 ⇒抗体の侵入が容易シアル酸が少なくなり血球同士の反発力↓ ⇒血球の直接架橋 35

一段法の問題点

患者血清中の阻害物質（プロテアーゼインヒビター）による影響インヒビターの多い検体 ⇒ 酵素が効かない（偽陰性）インヒビターの少ない検体 ⇒ 酵素が効きすぎる（偽陽性）血清希釈および酵素による抗体処理の影響で感度低下が生じる酵素活性はメーカーや開封後の時間経過で差がある一段法用市販酵素試薬は血清中の阻害物質の存在を前提として作られている（過剰活性の維持）一段法二段法阻害物質が存在しないため一定の処理が可能酵素血清血球浮遊液酵素処理血球浮遊液 _{37 ℃ 15～30分加温}酵素処理 36

(19)

一段法 vs 二段法の反応

AlbaQ-Chek®_{J Tube 2（弱い抗c）を検体として使用} ブロメリン（Ａ社・Ｂ社）は何れも使用期限内、開封後約1週間経過のもの使用抗グロブリン法フィシン二段法ブロメリン（Ａ社）一段法ブロメリン（Ｂ社）一段法 0 2+ 2+ 0 3+ 3+ 0 w+ 1+ 0 0 0 37

同定が困難となる主な原因

 顕著な量的効果/微弱な抗体の存在

キーは「反応増強剤特性」

38

(20)

不規則抗体検査の反応性が弱かったら！

インキュベーション時間の延長（15分，30分→60分）

血球に対する血清量の増加（4滴法、LISS系には不適）

反応増強剤の変更（Alb→LISS, PEG, LIP)

ダブルインキュベーション

酵素処理法での増強（Rh, Kidd, Lewis）

吸着解離法

インキュベーション温度の変化（室温→18℃冷式パネル）

血清の酸性化（pH6.5 抗M）

39

ダブルインキュベーション法

異なる反応増強剤等が準備できない場合に有効 1. 血球/血清/増強剤を適切な割合で添加する 3. 1200ｇで3分間遠心し上清 (血清/増強剤)を廃棄する 2. 混和後37℃で添付文書に従って加温を行う 4. 再度血清/増強剤を適切 5. 混和後37℃で添付文書に従って加温を行う 6. 生食3回洗浄・デカント 6. 抗グロブリン試薬添加７. 遠心/判定 40

(21)

Donor

Number D C E c e f Cw V K k Fya Fyb Jka Jkb Xga Lea Leb S s M N P1 Lua Lub Dia Cell No. 生食 IAT CC

1 R1R1 117091 + + 0 0 + 0 0 0 + + + 0 + 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 1 0 1+ NT 2 R2R2 303122 + 0 + + 0 0 0 0 0 + + + + 0 0 + 0 0 + 0 + + 0 + 0 2 0 1+ NT 3 rr 303897 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + 0 + + 0 + 0 + + + + 0 + 0 3 0 0 + DiaR1r DIA527 + + 0 + + + 0 0 0 + 0 + + + + + 0 + + + + +s 0 + + 4 0 0 + AC 0 0 +

反応増強法の活用（微弱な抗Jk

a

_）

Cell No. Rh-hr Donor

Number D C E c e f Cw V K k Fya Fyb Jka Jkb Xga Lea Leb S s M N P1 Lua Lub Dia Cell No. 生食 IAT CC

1 R1R1 117091 + + 0 0 + 0 0 0 + + + 0 + 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 1 0 2+ NT 2 R2R2 303122 + 0 + + 0 0 0 0 0 + + + + 0 0 + 0 0 + 0 + + 0 + 0 2 0 2+ NT 3 rr 303897 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + 0 + + 0 + 0 + + + + 0 + 0 3 0 0 + DiaR1r DIA527 + + 0 + + + 0 0 0 + 0 + + + + + 0 + + + + +s 0 + + 4 0 w+ NT AC 0 0 + ダブルインキュベーション法による再検査 41

同定が困難となる主な原因

 抗原の個体差（P1・Lewis・Xga・Duffy・Kidd・MNS）

キーは「+は必ずしも同一反応性ではない」

42

(22)

抗原性に差異の見られる血液型抗原

Lewis, Duffｙ, P₁, Xga ドナー血球間で抗原量に顕著な差 P₁型物質・Lewis型物質による中和で陰性化が確認されれば存在を肯定浜松医科大渡辺らの共同研究より 2009年 2000年に供給された70ロットのScr血球におけるP₁抗原の分布 43 ドナーの抗原性は対立抗原に対する抗血清でのみ検査が行われるため、見掛け上のホモ接合が存在し得る。遺伝子型：Fyb_/Fy →Fy(a-b+) 44

(23)

同定が困難となる主な原因

 一般的な血清学的性状を示さない 45

寒冷凝集/冷式抗体の存在

• 特徴

必ずしも生理食塩液法において反応が観察されるわけではない間接抗グロブリン法における反応パターンに再現性がない酵素処理法において比較的全体に反応や連銭様の反応が観察される 46

(24)

抗グロブリン法陽性抗体は皆37℃反応性？

反応増強剤の効果によるIgM型抗体による凝集が存在する

2-ME処理血清生理食塩液法 Alb-AHS PEG-IgG PEG-AHS PEG-Sal PEG-IAT

1 3+ 0 1+ 1+ 1+ 0 2 3+ 1+ 1+ 1+ 1+ 0 3 3+ 0 2+ 2+ 1+ 0 4 3+ 2+ 1+ 2+ 1+ 0 5 3+ 3+ 2+ 3+ 2+ 0 6 2+ 3+ 1+ 1+ w+ 0 7 0 4+ 3+ 3+ NT 3+ 8 0 3+ 2+ 2+ NT 1+ 9 0 3+ 2+ 2+ NT 1+ 10 0 4+ 3+ 3+ NT 2+ 1 1+ w+ 0 NT NT NT 2 1+ w+ 0 NT NT NT 3 1+ 0 0 NT NT NT 1 2+ 3+ 1+ 1+ 1+ 0 2 3+ 4+ 1+ 1+ 1+ 0 3 3+ 3+ 1+ 1+ 1+ 0 4 1+ 2+ 0 0 NT 0 5 3+ 4+ 4+ 4+ NT 2+ 6 4+ 4+ 4+ 4+ NT 3+ 2-ME未処理血清抗Lea 抗Leb 抗M 抗体 No. 関西医科大学報告・1995より抜粋 47 抗体の特異性臨床的意義輸血用血液製剤（赤血球製剤)の選択 Rh あり抗原陰性 Duffy あり抗原陰性 Kidd あり抗原陰性 Diego あり抗原陰性 S，s あり抗原陰性 Kell あり抗原陰性 M（間接抗グロブリン試験＊_陽性） _まれ _抗原陰性 M（間接抗グロブリン試験＊_陰性） _なし _{選択の必要なし} Lea_{（間接抗グロブリン試験}＊_陽性） _まれ _抗原陰性 Lea_{（間接抗グロブリン試験}＊_陰性） _なし _{選択の必要なし} P1，N，Leb なし選択の必要なし Xga _なし _{選択の必要なし} 高頻度抗原に対する抗体 JMH，Knops，Cost，Chido/Rodgers なし選択の必要なし Jra _まれ _{抗原陰性が望ましい} その他高頻度または低頻度抗原に対する抗体特異性、症例により異なる輸血認定医、輸血認定技師または専門機関に相談

患者への血液供給

日本輸血・細胞治療学会赤血球型検査のガイドラインより 48

(25)

生理食塩液法反応性抗体保有時の対応

抗M，抗Lea 反応増強剤添加間接抗グロブリン試験(ルチン法) 抗原陰性血の選択なし抗原陰性血液凝集あり凝集なし 37℃，60分反応増強剤無添加間接抗グロブリン試験凝集あり凝集なし 49

生理食塩液法反応性抗体保有時の対応

抗M，抗Lea 反応増強剤添加間接抗グロブリン試験(ルチン法) 抗原陰性血の選択なし抗原陰性血液凝集あり凝集なし DTT処理後剤間接抗グロブリン試験凝集あり凝集なし 50

(26)

生理食塩液法判定の意味

一部の低温反応性抗体は反応増強剤使用による間接抗グロブリン試験で偽陽性を呈することがあります。そのため、生理食塩液法（迅速法）で予めその有無を確認しておくことは、引き続き実施する間接抗グロブリン試験の結果解釈に有用です。したがって、生理食塩液法の判定で冷式抗体などの影響を事前に検知した後、再検時に生理食塩液法を省略するのは同意できますが、すべてに生理食塩液法での判定を省略し加温することは、冷式抗体により間接抗グロブリン試験が陽性になった時、その対応のため輸血の準備遅延や手術日延期などが懸念されることから推奨できません。輸血のための検査マニュアル疑義解釈Q&A Ver.1.2より抜粋

反応が観察された場合

そのまま抗グロブリン法へ進まない！

並行して対策を実施！

51 1. 十分量の患者血清を試験管にとり、試験管立てに立てる。 2. 患者及び被検血球浮遊液（スクリーニング cellなど）1滴を別の試験管に滴下する。 3. 1及び2の試験管を試験管立てごと37℃10分間加温する。必要に応じ（寒冷が極端に強い場合）洗浄用生理食塩液を洗浄ビンに入れ37℃に加温しておく。 4. 血球浮遊液の入った試験管にPre-warmingした患者血清を2滴加えよく混和する。この際、試験管は恒温槽から出さずに行なう。 5. 60-90分加温する。 6. 加温終了後の遠心判定は行なわず、生理食塩液（必要に応じて加温生理食塩液）で3回洗浄_する。 7. 抗グロブリン試薬（検体が血清の場合には抗IgG血清）を2滴加え遠心判定する。

Pre-Warming法

 本法における検出感度はPEG法やLISS法に劣ることがあることを理解し報告する。  血球浮遊液を必要以上に事前加温を行うことにより抗体検出感度が低下するので注意する 52

(27)

抗体同定の1例

• 寒冷凝集素の存在 • 高頻度抗原に対する抗体の存在 Cell No. Rh-hr Donor

Number D C E c e f Cw V K k Fya Fyb Jka Jkb Xga Lea Leb S s M N P1 Lua Lub Dia Cell No.

生食 RT 生食 1 4 C 生食 3 7 C 60m IAT CC 1 R1 w R1 302522 + + 0 0 + 0 + 0 0 + 0 + + + 0 0 + + + 0 + + 0 + 0 1 2+ 2+ 0 1+ NT 2 R1R1 117395 + + 0 0 + 0 0 0 + + + 0 + + + 0 0 + 0 + 0 + 0 + 0 2 2+ 2+ 0 1+ NT 3 R2R2 108419 + 0 + + 0 0 0 0 0 + 0 + + + + 0 + 0 + + + 0 0 + 0 3 2+ 2+ 0 1+ NT 4 Ror 301474 + 0 0 + + + 0 0 0 + 0 0 0 + + 0 + 0 + + + +s ₀ ₊ ₀ ₄ ₂₊ ₂₊ ₀ _{1+ NT} 5 r'r 117054 0 + 0 + + + 0 0 0 + + + 0 + + 0 0 + + + + 0 0 + 0 5 2+ 2+ 0 1+ NT 6 r"r 71310 0 0 + + + + 0 0 0 + + + 0 + + 0 + 0 + + + + 0 + 0 6 2+ 2+ 0 1+ NT 7 rr 116910 0 0 0 + + + 0 0 + + 0 + + 0 + 0 + + + + 0 + 0 + 0 7 1+ 2+ 0 1+ NT 8 rr 302186 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + + 0 + + 0 0 + 0 + + + + 0 8 1+ 2+ 0 1+ NT 9 rr 105482 0 0 0 + + + 0 0 0 + + 0 0 + 0 0 + 0 + + 0 + 0 + 0 9 2+ 2+ 0 1+ NT 10 rr 114888 0 0 0 + + + 0 0 0 + 0 + + + + 0 + + 0 + 0 + 0 + 0 10 2+ 2+ 0 1+ NT 11 R1R1 33225 + + 0 0 + 0 0 0 0 + 0 + + + + + 0 + 0 + 0 + 0 + + 11 2+ 2+ 0 1+ NT AC 0 2+ 0 w+ NT

×血清検体・共通試験管・多特異抗グロブリン試薬の使用

寒冷凝集/冷式抗体が疑われる場合の対応

Pre-Warming法

還元剤によるIgMの不活化

寒冷凝集素の吸収操作

寒冷自己吸収（酵素法陽性の場合）市販寒冷凝集吸収剤の使用ウサギ赤血球ストローマにより抗I・抗HI（抗P1・抗Leb含む）吸収 O型ヒト唾液等の使用

型物質による吸収操作

54

(28)

その他

HLA ClassⅠ抗原に対する抗体を代表とする低頻度抗原に対する抗体の存在（経産婦・頻回輸血患者） →いずれの試験を行っても反応パターンに一致するものなし（交差による血液選択）自然抗体（交差反応）

抗K（E. coli, Haematophilus influenza への感染）抗Cw 抗Dia 55

抗体同定の手順（考え方）

不規則抗体スクリーニング血球との反応性反応パターンの優先と適切な消去法実施免疫血清学的反応態度による推測免疫血清学的反応態度による推測同定用パネル血球との反応性反応パターンの優先と適切な消去法実施患者抗原タイピングによる否定/肯定適切な追加パネルによる否定/肯定自己コントロール/DATの観察当該抗体あり -抗原量のばらつきの可能性 →Xga_{, Lewis, P}₁_{, (Jra, JMH, Ch, Rg)} -Silentの可能性 →Duffy, Kidd, MN -生理食塩液反応性抗体の影響 →Lewis, MN, P1 -低頻度抗原に対する抗体の可能性→Class I, Mia_, （数本の不一致が観察される） -赤血球輸血後1か月以内 →同種抗体産生 -自己免疫性疾患 →自己抗体 -新生児 →HDNF -上記以外 →薬剤起因性抗体 →移行性抗体陽性ありなし 56

(29)

© Ortho Clinical Diagnostics 2017 IHT‐1626 反応強度の違いにより複数の抗体や量的効果を考察各反応相より血清学的性状の推測反応陰性血球による他の抗体の共存を否定（量的効果考慮）抗血清によるABO以外の_{血液型判定（陽性抗原に} 対する抗体を保有する可能性の否定型物質による中和 Ⅱ パネル血球との反応パターンを最重要に考え特異性の暫定的同定 Ⅳ 患者血清中に存在する抗体の掌握（別の抗体の共存を否定）抗体スクリーニングの検査結果の正しい解釈患者血清中に存在する可能性のある抗体の把握 Ⅰ 抗体同定用パネル血球との反応結果の解釈 Ⅲ 別の共存する可能性の確認・否定自己コントロールの観察選択した血球による追加パネルの実施吸着試験による共存抗体の証明吸着・解離試験による弱反応性抗体の増強反応強度観察溶血の有無観察 57

ご清聴ありがとうございました

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オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社

お客様サポートセンター

：0120-03-6527

58

Microsoft PowerPoint - 抗体同定_基礎_高知_配布.pptx

不規則抗体検査

赤血球輸血検査における最終の目的

患者体内において抗原抗体反応を起こさせないこと

患者に新たなる免疫をさせないこと

検体の採取と管理

血球浮遊液の性状と血球濃度

血清：血球の比率

反応増強液の種類と使用法

加温の時間と温度

遠心強度と時間

試験管の内容物のその取り扱い

結果の転記

検査者の精神状態

偽陽性・偽陰性発生の主な要因

血清は血球沈渣量の80倍以上

ピペットの形態と滴下量の変化

抗体同定を行うにあたって

本日の内容

• 抗体同定を行う前に

• 抗体同定を難しいものにしている原因と検査の進め方

同種免疫の機会

同種免疫の既往による同種抗体保有率

遅延型溶血性輸血副作用報告

抗体産生

重篤な副作用発症までの日数分布

不規則抗体の消長

不規則抗体スクリーニング/抗体同定の基本事項

患者血清中に存在する可能性のある抗

体を否定していく作業

• 抗原陽性血球を用い適切な検査方法による

反応結果

陰性を以って証明

をすることを条件とする。

• 反応の陽性/陰性だけでなく、反応強度の差異を観察

することがより重要となる。

抗体同定の手順とルール

1. 反応パターンを優先し特異性を予想

2. 消去法の実施

3. 抗血清による患者抗原タイピング

4. 適切な追加パネルの選択（有効血球の選択）

抗体同定の手順とルール（Step 1）

反応パターンを優先し特異性を予想

抗体同定の手順とルール（Step 2）

消去法の実施

量的効果とは（Jk

抗原 と 抗Jk

の例）

抗体の希釈に伴う反応性の変化

抗原発現頻度

不規則抗体スクリーニング用試薬としての供給限界

抗体同定結果解釈の基本事項

反応パターンを最優先に特異性を決定

反応強度の違いより複数の抗体や量的効果の考察

量的効果を考慮した共存抗体の消去

免疫血清学的反応態度からの

推測

（何法で反応したか）

抗原性(個体差)を考慮した考察の実施

Silent geneの可能性を考慮

特異性の決定と血液供給

消去法実施

f (ce) 抗原について(イメージ)

4. R

r = D

ce

/d

ce

5. ｒ’ｒ = dCe/d

ce

6. r”r = dcE/d

ce

7. rr = d

ce

/d

ce

抗体同定の手順とルール（Step 3）

抗血清による患者抗原タイピング

患者抗原のタイピング

抗体同定の手順とルール（Step 4）

_{抗原と抗Jk}

_の例）