香川大学戯学部学術報告 第29巻第61弓77∼82，（1977） 77
二次元電気泳動法によるエンバク葉の可て容性蛋白質の分離
山 本 弘 幸，広 部 健 一・
SEPARATION OF SOLUBLE PROTEINS OF OAT LEAVES BY
TWONDIMENSIONAL GEL ELECTROPHORESIS
HiroyukiYAMAMOTO，KenNichiHIROBE
Separation ofsoluble proteinsofoatleaveswas examined by two−−dimensionalacrylamide
gelelectrophoresisofO，Far・re11withaslightmodification．The supernatantof oatleaf ho・
mOgenate obtainedbythe centrifugationatlO，000×gfor15min wasusedas asoluble pro・teinfraction・The first dimensionalelectrophoresis was conducted byisoelectric focusing
methodbyadding9・2MurIeaand2％NonidetP−40toprotein samples and gels．ThebestSeparationofproteinsforthetwo−dimensionalelectrophoresiswasachievedbytheelectropho
resis of500FLg prOteins with apH4．2N8．8gradientat25V／gelfor18hours．Thegelwas
thenleXtrudedintq50miof62．5mMTris−HClbuffer（pH6．8）containing2．3％sodiumdodecyl−Sulphate（SDS），10％glycer・ine and5％β−merCaptOethanoland shakenat25。C for6hours．
Theseconddimensionalelectrophoresiswascarriedouton discontinuous SDS−aCrylamidegel
plates，glVlngCurrentOf20mAfor6．5hours．Thisprocedur・e prOVidedthe resolution of143
SPOtSOfproteins on thegelplate withhighreliability．
0’FARRELLの二次元電気泳動法に・より，・エソバク（月〃の鋸Zぶαわ玖α」L）子苗葉の可溶性蛋白質の分離を試みた．
（1）可溶性蛋白質には磨砕液を10，000×g，15分速心分画した上澄液を用いた．・等電点分画法による一次元電気泳
動は試料およびゲルに9・2M尿素および2％ノニデットP−・40を加え，蛋白質意を500〝g添加して，25V，18時間通電 すると，明瞭なバンドが検出されたや泳動後のゲル申のpH勾配は4．2−8．8であった． （2）上記のゲルを2”3％SDS，10％グリセリン，5％β−メルカプトエタノ−ル含有の62・5mMトリス一塩酸緩衝披 （pH6・8）50mlに・25OC，6時間浸潰した後，不連続SDS−アクリルアミドグル法により二次元電気泳動を20mA，6時 間30分行うと，高い再現性で143コのスポットが検出された 緒 言 アク〃レアミドグルカラムを用いたDAVIS（1）のディスク電気泳動法の開発により，蛋白質の分離とその再現性が高 められた．しかし，細胞中に含まれる多数の蛋白質を山次元電気泳動法で分離するに．は物理的に限界がある．そのた め，分離面硫の拡大が可能な平板グルを用いる二次元竃気泳動法の開発が望まれてせた．XALrSCHMIDTand WITT− MANN（6・7）ほ一・次元と二次元泳動時のpHおよびアクリルアミドの濃度を変え，大腸菌のリボゾームの蛋白質の分離を 行った・この方法は大腸菌のはか動物（16），植物（3・5，11）の各材料に応用されたが，いずれもリボゾーーム中の蛋白質の検 出にとどまり，可溶性蛋白質の検出を行うまでにはいたらなかった．ところが，最近0，FARRE工L（14）が等電点分画法 と不連続SDS−アクリルアミ．ドゲル竃気泳動法を組合せた二次元竃気泳動法を開発した．．それによると，蛋白質の分離 スポット数は約1，000種紅及び，大腸菌の可溶性蛋白質の検出が可能である・・この方法は他の材料にも応用できると報山 本 弘 串，広＋部 健 一 香川大学農学部学術報雀 78 告（14）されたとおり，遍ちにPETERSONandMcCoNKEY（15）ぉよびYABLONXAandYAFFE（20）によって有尉性が立証 された．ただし，既報（14・15・20） のものはいずれも，微生物あるいは動物を材料としており，枝物材料紅よる検討ほ昇あ たらないよう紅思われる． すでに，筆者ら（18・21〉ほ ，・エソバク冠さび病の抵抗性発現時にdβ〝〃ぴ0紅合成される蛋白質の存在を強く示唆する 結果を得ているが，未だ蛋白質を．スポットとして認めるまでにほいたっていない．・そこで，今回はまず0，FARRELL法 によって，・エソバク薬申に．おける可溶性蛋白質の分離の可能性紅ついて／検討を加えた．−・応再現性の高い分離が可能に なったので，その概要に．ついて報告したい． 本実験の遂行およびまとめに．あたってほ，本学助教授谷 利一博士の御指導と御校閲を賜わった．心より感謝の意を 表する． 実験材料および方法
1．供試材料：エソバクほ既報（12）のとおり，勝冠1号の種子をバ−・ミキュライト紅播種し，毎日定量の春日井氏水
耕液を施しながら250C，螢光灯連続照射（6，000−8，000ルックス）下で育苗した． 2．可溶性賓白鷺の調製：可溶性蛋白質ほ液体堂素で凍結した播種7−8日後の子領葉から以下の方法で調製した． すなわち，・エンバグ葉2gを2mlの1mMβ−ノルカプトユタノ」−ル，ユmMMgClgを含む50mMトリス・−・塩酸緩衝液 （pH7．6）で水冷しながら乳鉢で磨砕し，二遥好一ゼでろ過後，10，000×g，15分，00Cで遠心分離した．上澄液は透 析膜に封入後，300倍盈の1mMβ・−・メルカプトヱ・タノ」−リレ，1mMMgC12を含む1mMトリス一塩竣緩衝液（pH7．6）申 で6時間透析を行った．つぎ紅，透析後の可溶性蟹自費の溶液1mlに射し，最終濃度がそれぞれ9．2Mおよび2％とな るように尿素1．45g，10％ノニデットP−400．．53mlを加え電気泳動用の試料とした． 3．蛋白質の測定：透析後の溶液の蛋白質慶はLowRYetaL（9）の方法に準じて走塁した．標準物質には牛血清アル ブミンを用い，測定は750nm波長下で行った． 4．電気泳動：（1）一次元電気泳動（等零点分画法）：a）分離用ゲルの作成：0，FARRELL（14）の方法把準じ，ア ンホライン，尿素，ノエデットP−40およびアクリルアミドの最終淡度はそれぞれ2％，9．2M，2％，4％となるよう に．調製した．すなわち，pH3−10の40％アンホライン0・1ml，p壬‡5【7の40％アンホライン0・4ml，10％ ノニデットP−402ml，30％アクリルアミド（28・4％アクリルアミ・ドおよび1・6％ビスアクリルアミド）1小33ml，水1・97mlの混合
液常．尿素5．5gを溶解後，10％過硫酸アンモエクム10〟、iを加え，真空デレケ−ダー中で2分間脱気を行った．脱気後N，N，N，，Nしテトラメチルエチレンジアミン（TEMED）7折1を速やかに加え，5×130mmのカラムに注射器で液面下
105mmとなるように．ゆっくり入れた小表面は8Mの尿素で番い，200C下で6時間静瀞してゲルの重合を行った． b）操作：ディスク電気泳動用の泳動槽に・カラムを取付けた後，蛋白質溶液をゲル上に添加した・つぎに，1％アン ホライン（pH3−10；0．2％，pH5・鵬7；0・8％）を含む9Mの尿素で試料の上部を覆った後，陽極液の0．5％塩酸を ゆっくり入れた・陰極液紅は1・3％エチレン汐アミ．ンを用い，泳動は200C下でカラム当り25Vの定電圧を与え，18時 間行った・ （2）ニ次元電気泳動（不連続S！）S一アクリルアミドゲル電気泳動）：0，FARR軋L（14）が準用したLAEMMLI（8）の 方法によった〃a）分離用ゲルの作成：ゲル中のドデレル硫酸ナ■トリウム（SDS）およびアクリルアミドの最終泌皮はそれぞれ0ひ1
％および10％となるように調製したlすなわち，0・4％SDS含有の1・5Mトリス一塩酸緩衝液（pH8・8）7．5ml，30％アク リルアミドゲル（29巾2％アクリルアミドおよび0・8％ビスアクリルアミド）10ml，水12・5mlに・10％過硫酸アンモニタム100〃1を加え，真空デレケ一夕】−・中で3分間脱気後，TEMED15／ん1を加えた．混合液は三方を密封した170×150×1
mmのスラブゲル泳動用のガラス仮に高さ150mmまでゆっくり注入後，表面を水で覆って1夜放置し重合を行った．b）濃縮用グルの作成：ゲル中のSDSおよびアクリルアミドの最終濃度ほそれぞれ0・1％および3％となるよう紅調
製した．すなわち，0．4％SDS含有の0．5Mトリス．塩酸緩衝液（pH6・8）2り5ml，30％アクリルアミド（29．2％アクリル アミドおよぴ0“8％ビスアクリルアミド）1．5ml，水6m肱10％過硫酸アンモニクム30Jムlを加え，真空ヂシケ」一夕ー中 で2分間脱気後，TEMEDlO／ムlを加えた．この混合液は余分の水を完全に・除去した分離用ゲルの止に．高さ25mmとな るよう吃ゆっくり注入し，商ちに表面を水で覆い4一牒時間放置して蛋合を行った，第29巻算61号（1977） ヱ・ンバク薬蛋白質の二次元電気泳動 79 C）操作：厚さ1mmのスラブゲル上紅ほ直径5mmの等電点分画後のゲルは固定できないため，既成のスラブ泳動用 のガラス校紀第1図に示したように2枚のガラス片を張り，ゲルが脱落しないように改良した．ガラス板はスラブ電気 泳動槽にI取付けた後，張り合せたガラスの溝紅ゲルを横たえ，2％SDS含葡の6．25mMトリスー塩酸緩衝液（pH6．8） 紅溶かした1％アガロ−スで固定した・泳動は，上下電極槽紅0．1％SDS含有の25mMトリス・−192mMグリシン緩衝液 と，上槽に・マー・カ−の0・1％プロムフェノ−ルブルー・（BPB）を数滴々下した後，20mAの定電流を与え，BPBがゲル 下端紅達するまで行った．泳動紅は約6時間30分を要した． 上部泳動槽面の ガラス面（正面） 第1図 二次元電気泳動装置および改良したガラス板の模式医王 a；トリスーグリシン緩衝液 b；等電点分画後のゲル C；添付ガラス片 d；ゲル固定用のアガロ−ス e；濃縮用ゲル f；分離用ゲル g；ゴム板 （3）ゲル中のpH勾配の測定：等電点分画後のゲル中のpHはグルを10mm間隔で切った後，2mlのイオン交換水に． 6時間浸漬してからpHメータ−で測定した．． （4）ゲルのSDS処理：等電点分画後のゲルはSDS−スラプ電気泳動用の蛋白質試料とするため，2．．3％SI）S，10％グ リセリン，5％β一メルカプトニタノ−ル含有の6・25mMトリス一億酸緩衝液（pH6．8）50ml紅浸潰し，250C，6時間挽 絆した． （5）固定，染色および脱色：S6DERHOLM etal．（17）の方法に準じた．すなわち，泳動後のゲルを11％トリクロル 酢酸，25％メタノ−・ル，2％スルホサリチル酸液で500C，30分固定し，さら紅8．5％酢酸，27％エチ・ルアルコ・−ルを含 む0・1％コマ汐ブリリアントブルー・Rで500C，30分染色した・脱色は8・5％酢酸，27％エチルアルコール混液中で渡拝し ながら1夜行った． 結果および考察 1．一次元電気泳動 二次元電気泳動に先だち，等電点分画法紅よる泳動条件紅ついて検討した． まず，0，FARRELL（14）の方法に準じ，試料およびゲル申紅可溶化剤の尿素とノニデットPr40を加え，2．5×130mmの カラムを用い蛋白質畳4伽gで泳動を行ったところ，バンドは薄く，正確な判定は困難であった．そこで，カラム当りの 必要蛋白質意匿ついて調べてみた・ただし，0，FARRELLが用いた口径2．5mmのカラムによると，二次元泳動用のガラス 坂にゲルを固定しやすい利点はあるが，蛋白質溶液の添加容量は制約され，含量の少ない抽出液を直接使用することが 困難となる・また，泳動後のゲルは染色等の操作中紅破損しやすい・と．れらの欠点を補う目的で，以下の実験では口径 5mmのカラムを用いた・その結果，250〝gの蛋白質を添力口すると比較的明瞭な21本のバンドが検甘できた・さら紅糞町
香川大学農学部学術報告 山 本 弘 婁，広 部 健 一 80 質慮を375，500およぴ750噌に増加してバンドの出現状態を調べてみると，375およぴ500〝gの両区とも250〝gの添加 区では確認できなかったバンドが，ゲルの先端部に7本出現したが，他のバンドは本質的な変化ほなかった（第2図）・ ﹂泳動方向 250 375 500 750 添加蛋白置（山g） 寛2図 等電点分画法による・エソバク葉の可魔性蛋白貿の叫次元 泳動図と添加患の関係 25V，18時間通竃 また，750〝g添加区では新しいバンドの出現ほなく，バンドほ相互に屈なり合って数ほ減少した・なお，カラムに対 し30V以上の定電圧を与えると，泳動中ゲルが離脱しやすいため，本実験では25Vの定電圧で通電した・この条件下で は空自質の移動が見られなく最低泳動時間は，250および375〃gでほ12時間，500および750〝gでほ18時間であった・ 18時間泳動後のゲル内にはpH4り2−81・8の勾配ができた（第3医l）・蛋白質のバンドは・おもに・郎4・5−5・8の間に分布 した． 9 さ 7 ⊥ ユ6 5 4
＝ L川
1 2 3 4 5 6 7 8 9】0
−フ 泳動距離（cm） ○ 第3図 等竃点分画後のゲル中におけるpH勾配 25V，18時間通竃 以上のよう紅．等電点分画法によるエソバク葉の可溶性蛋白質の分離には可溶化剤を使用して，375−500〝g程度の蛋 白質を用いると再現性も高く，明瞭なバンドが検出できた・ 0，FARR軋1（14）ほ等電点分画法ではRNAがバンドの出現を妨害する場合もあるとしているが，本実験ではRNAの混在下でも明瞭なバンドの検出は可能であったいまた，植物材料を用いて等竃点分画法を行った報告（10・13）に・よると，
試料ほ抽出液を直接使用しているが，エソバク憩では，泳動中に原点付近で蛋白質が変性を生じ？安定したバンドの検
出ほ困難であった・第29巻第61号（1977） エソバク葉蛋白質の二次元竃気泳動 81 2．ニ次元電気泳動 安定した一次元電気泳動バンドの検出が可能となったから，つぎに二次元電気泳動の条件について検討を加えた． まず，スラブグルのアクリルアミドの適正濃度を知るため，ディスク電気泳劫用カラムを用い，7．．5，10および12．5％ のアクリルアミドゲル中におけるエソバク葉の可溶性蛋白質の挙動を調べたところ，7．5％のグルでほ先端部に．，12．．5％ のゲルでほ原点付近にそれぞれバンIFが集中した”十方，10％のグルでほバンドは全体的に分散した．そのため，スラ ブゲルのアクリルアミドは10％と定めて実験を行った． ニ次元電気泳動ほ一次元泳動後のゲルをそのまま蛋白質試料とするが，0，FARRELLの方法でほ二次元竃気泳動を SDS−アクリノL／アミドゲル法を用いるため，−・次元泳動後のゲルをSDSで処理することが必要となる。0’FARRELLは
SDS処理は室温下で2時間行うと十分であるとしているが，蛋白質溶液をSDS−アクリルアミドゲル竃気泳動した報
告〈2・4，8）によると，試料ほ加熱処理されて−いる・・そこで，本実験では1000C，500Cおよび250C（室温）の条件下でそ れぞれSDS処理を行ってみたところ，1000C区でほ1，2分処理とも明瞭なスポットは検出できなかった小また，500 C区では6時間処理のときスポット数は最も多く，70コを数えた・・これに対し，250C下で6時間の処理を行うと，ス ポット数はさらに増加し，143コが検出できた（欝4図）・そのう．え．，再現性およぴスポットの明瞭さも他の処理区より 優った．なお，ニ次元電気泳動に・ほ蛋白質恩は37帥gよりも500／ムgのはうがスポットが明瞭となった・ ーーーゝ・一次元泳動方向 ﹂二次元泳動方向 ー ● ＿ −■− ○ ● ■− 一 0 − − ■ くJ ∴T＿ニナ ー■ −■ ー − ●t■ く＞ t＝I ■■ く， てフ 一＝− −す♂＿ 08− −
● ⊂，tタlコ く＝〉 くつ 一 ロくフ く＞ く■ 0⊂フ○ゥ ・・ ゥ9 三㌣℡●丁 ▼ t＝＞ く＞く7 （＝＞ O C〉 t＝＞ o0
98。
第4図 不連続SDS−アクリルアミド電気泳動法によるエソバク葉の可溶性蛋白質 の二次元泳動図 20mA，6時間30分通電，黒は汲染されたスポット また，染色を0，FARREl，1が準用したLAEMMl．Ⅰ（8）の方法で行うと，結果の判定までに」巨冊5日を要したが，本実験 で用いたSODERHOLM etal．（17）の方法で行うと1日で可能となった． 以上のとおり0，FARRElL法は動物（15・20）と同様に．植物の可溶性蛋白質の検出紅も十分活用でき，従来の一次元泳動 法の5−6倍の蛋白質を検出することは容易である．．ただし，抽出液の蛋白質含意が少ない試料紅ついては，試料の汲 縮あるいは本実験で行ったような大口カラムの使用およびガラス片の添付が必要となる．なお，現在のところエソノくク 葉の検出スポット数は大腸菌あるいはHeLa細胞などに比して劣るが，ニ次元泳動時のアクリルアミドの濃度勾配の使82 山 本 弘 幸，広 部 健 一 香川大学農学部学術報債
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