ホ．薬理
頁 1. 効力を裏付ける薬理試験 --- 174 総括--- 174 1)効力を裏付ける薬理試験 --- 185 (1)エラスターゼ阻害作用 --- 185 ①in vitro におけるエラスターゼ阻害作用 --- 185 i）合成基質を用いた阻害作用 --- 185 ii）天然基質を用いた阻害作用--- 186 ②全血系におけるエラスターゼ阻害作用（in vitro） --- 187 ③ex vivo 系におけるエラスターゼ阻害作用--- 189 (2)好中球による肺血管内皮細胞傷害に対する効果--- 191 (3)急性肺傷害モデルにおける効果 --- 192 ①ET 吸入惹起ハムスター急性肺傷害に対する作用 --- 192 i）BALF 中肺傷害指標に対する作用 --- 192 ii）病理組織所見に対する作用--- 195 ②CVF 静脈内投与惹起ハムスター急性肺傷害モデル --- 197 i）肺血管透過性亢進に対する作用 --- 197 ii）BALF 中肺傷害指標に対する作用--- 199 ③塩酸気管内投与惹起ハムスター誤嚥性肺傷害モデル --- 200 i）呼吸不全死に対する作用 --- 200 ii）呼吸機能に対する作用 --- 201 iii）BALF 中肺傷害指標に対する作用 --- 202 ④小腸虚血再灌流惹起イヌ急性肺傷害に対する作用 --- 203 i）肺水分平衡に対する作用 --- 203 ii）呼吸機能に対する作用 --- 205 ⑤ET 静脈内投与惹起モルモット急性肺傷害モデル --- 206 2)作用機序--- 207 (1)酵素阻害活性の特異性（in vitro）--- 207 (2)活性酸素種に対する安定性（in vitro） --- 208 (3)エラスターゼ惹起モデルに対する効果--- 210 ①in vitro 肺血管透過性亢進に対する作用--- 210 ②急性肺傷害に対する作用 --- 212 (4)急性肺傷害モデルにおけるエラスターゼ活性上昇に対する効果 --- 213①ET 吸入惹起ハムスター急性肺傷害モデル ---213 ②CVF 静脈内投与惹起ハムスター急性肺傷害モデル ---214 ③塩酸気管内投与惹起ハムスター誤嚥性肺傷害モデル ---216 (5)作用機序の考察 ---217 (6)有効投与量に関する考察 ---219 3)代謝物および不純物について---221 (1)in vitro におけるエラスターゼ阻害作用 ---221 2. 一般薬理試験 ---222 総括 ---222 1)ONO-5046･Na の一般薬理作用 ---223 (1)一般症状，中枢神経系に及ぼす影響 ---223 (2)自律神経系および平滑筋に対する作用 ---223 (3)体性神経系に対する作用 ---223 (4)呼吸・循環器系に対する作用 ---223 (5)消化器系および泌尿器系に対する作用 ---224 (6)その他の作用 ---224 2)ONO-5046･Na 不純物（Ⅰ-4）の溶血作用 ---224 3. 好中球機能に対する作用 ---228 総括 ---228 1)貪食能に対する作用 ---228 2)活性酸素産生能に対する作用---230 3)殺菌能に対する作用 ---231
略号（略称） 化学名（一般名） 構造式 由来 ONO-5046･Na sodium N-[2-[4-(2,2-dimethylpropionyloxy) phenylsulfonylamino] benzoyl]aminoacetate tetrahydrate 原薬 M-1 I-1 体 N-[2-(4-hydroxyphenyl-sulfonylamino)benzoyl] aminoacetic acid 代謝物 I-2 体 副生成物 I-3 体 副生成物 I-4 体 合成中間体
略号一覧表 Ki ：阻害剤の阻害定数 IC50 ：阻害剤の50%阻害濃度 SIRS ：全身性炎症反応症候群 OZ ：opsonized zymosan（オプソナイズドザイモザン） ET ：endotoxin（エンドトキシン） CVF ：コブラ毒素 BALF ：気管支肺胞洗浄液
α1-PI ：α1-protease inhibitor
PaO2 ：動脈血酸素分圧
PaO2/FIO2 ：動脈血酸素分圧・吸入気酸素濃度比
pNA ：p-nitroaniline
fMLP ：N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine
PMA ：phorbol myristate acetate
MPO ：myeloperoxidase（ミエロペルオキシダーゼ）
総括 表ホ−1 効力を裏付ける試験成績一覧表 1）効力を裏付ける薬理試験 試験項目（投与経路） 動 物 種 投与溶媒 および 投与量 試験成績 （１）エラスターゼ阻害作用 ①エラスターゼ阻害作用 i）合成基質を用いた阻 害作用 （in vitro） 試 投与溶媒 A ONO-5046･Na 10-300nM ヒトα1-PI ONO-5046･Na はヒトエラスターゼを拮抗阻害し， その阻害作用はヒト以外の動物種由来エラスター ゼに対してもほぼ同等であった．ヒトα1-PI もこれ らのエラスターゼを阻害したが，ウリナスタチン はヒトエラスターゼのみを阻害した． 験 0.25-10µg/mL エラスターゼ阻害作用（Ki 値） 管 ウリナスタチン 被験薬 ONO-5046･ Na (nM) α1-PI (µg/mL) ウリナスタチン (U/mL) 7.5-1000U/mL ヒト 46 2.6 7.8 内 イヌ 125 0.33 NI ハムスター 34 0.42 NI ii）天然基質を用いた阻 害作用（in vitro） 投与溶媒 B ONO-5046･Na 0.5-5µM ONO-5046･Na はヒトエラスターゼによる天然基質 エラスチンの分解を抑制し，その IC50値は 1.7±0.2 µM であった． ②全血系におけるエラスタ ーゼ阻害作用（in vitro） 各 種 動 物 投与溶媒 B ONO-5046･Na 1-300µM ウリナスタチン ONO-5046･Na は各種動物の血液の OZ 刺激による血 漿中エラスターゼ活性の上昇を阻害したが，ウリ ナスタチンはこれを抑制しなかった．また，ONO-5046･Na はエラスターゼとα1-PI の複合体量に影響 しなかった． 由 来 30-2,500U/mL 血漿中エラスターゼ阻害作用 （IC50値） 血 被験薬 ONO-5046･Na (µM) ウリナスタチン 液 ヒト 23 NI イヌ 39 -ハムスター 15 -NI:阻害せず，-:実施せず 投与溶媒 A:蒸留水（Na2CO3含有），投与溶媒 B:生理食塩液（Na2CO3含有）
表ホ−1 効力を裏付ける試験成績一覧表（つづき） ③ex vivo 系における エラスターゼ 阻害作用（iv infusion） ハ 投与溶媒 B ONO-5046･Na は 0.1mg/kg/hr 以上の用量の静脈 内持続投与で，OZ による血漿中エラスターゼ活 性の上昇を抑制した． ム ONO-5046･Na ス 血漿中エラスターゼ活性抑制率（%） タ 0.03mg/kg/hr 23 ｜ 0.1 50* 0.3 56** 1 75** （２）好中球による肺血管 内皮細胞傷害に対す る効果（in vitro） ヒ ト 投与溶媒 C ONO-5046･Na 0.5µM SOD ONO-5046･Na は 0.5µM の濃度で，活性化好中球 によるin vitro 内皮細胞傷害を抑制した．O2 -の消去剤である，SOD も内皮細胞傷害を抑制し， 両者の共存下ではさらに強く内皮細胞傷害を抑 制した． 細 10µg/mL 内皮細胞傷害抑制率（%）
ONO-5046•Na SOD ONO+SOD
胞 無刺激 67* 39* 86* fMLP 刺激 67* 44* 87* PMA 刺激 71* 47* 90* （３）急性肺傷害モデルに おける効果 ①ET 吸入惹起ハムスター 急性肺傷害モデル （iv infusion） ハ ム ス 投与溶媒 B ET 吸入終了 2 時間後からの ONO-5046•Na の後投 与は，0.3mg/kg/hr 以上の投与量で ET 吸入に よる BALF 中の白血球浸潤，蛋白濃度増加およ び出血を抑制した．一方，本モデルにおいて， デキサメサゾンの後投与およびインドメサシン の前投与は，いずれのパラメータも抑制しな かった． i）BALF 中肺傷害指標に タ ONO-5046･Na 対する作用 BALF 中肺傷害指標抑制率（%） ｜ 後投与 白血球浸潤 蛋白濃度 出血 0.03mg/kg/hr 47** 34 22 0.3 73** 55** 62* 3 84** 76** 84** *:p < 0.05，**:p < 0.01；それぞれの対照群（溶媒投与群）の反応値に比して有意差あり(Dunnett の多重 比較あるいは Student t 検定)
i）BALF 中肺傷害指標に BALF 中肺傷害指標抑制率（%） 対する作用 白血球浸潤 蛋白濃度 出血 （つづき） ハ 後投与 ONO-5046･Na iv infusion 3mg/kg/hr 90*** 81*** 76*** ム 前投与 デキサメサゾン iv 3mg/kg 72** 71*** 76*** ス 後投与 デキサメサゾン iv 3mg/kg 47 3 25 タ 前投与 インドメサシン iv 10mg/kg 45 11 25 ii）病理組織所見に対 ｜ ONO-5046･Na する作用 組織所見に対する作用 後投与 肺胞内好中 球浸潤 肺胞内 出血 浮腫 肺胞壁変 性･壊死 3mg/kg/hr 改善 改善 改善 改善 ②CVF 静脈内投与惹起ハム スター急性肺傷害モデル （iv infusion） i）肺血管透過性亢進に 対する作用 ハ ム ス 投与溶媒 B ONO-5046•Na は 0.3mg/kg/hr 以上の用量で CVF の静脈内投与による肺血管透過性亢進を抑制し た．本モデルにおいて，デキサメサゾンは肺血 管透過性亢進を抑制したが，カタラーゼはこれ を抑制しなかった． ONO-5046•Na タ 前投与 肺血管透過性亢進抑制率（%） 0.1mg/kg/hr 30 ｜ 0.3 45* 1 56** *:p < 0.05，**:p < 0.01，***:p < 0.001；それぞれの対照群（溶媒投与群）の反応値に比して有意差あり （Dunnett の多重比較あるいは Student t 検定） 投与溶媒 B:生理食塩液（Na2CO3含有）
表ホ−1 効力を裏付ける試験成績一覧表（つづき） i）肺血管透過性亢進に 肺血管透過性亢進抑制率（%） 対する作用（つづき） ONO-5046･Na デキサメサゾン カタラーゼ 前投与 iv infusion 62*** - -ハ 1mg/kg/hr ム 前投与 iv - 46* -3mg/kg ス 前投与 iv infusion - - 21 タ 2,500U/kg/hr ii）BALF 中肺傷害指標に 対する作用 ｜ ONO-5046•Na は 1mg/kg/hr で CVF の静脈内投与 による BALF 中蛋白濃度上昇を抑制したが，肺 組織好中球数は抑制しなかった． ONO-5046･Na 抑制率（%） 前投与 BALF 中蛋白濃度 肺組織好中球数 1mg/kg/hr 78* 28 ③塩酸気管内投与惹起ハム スター誤嚥性肺傷害モデ ル（iv infusion） 投与溶媒 B ONO-5046･Na は，0.1 および 1mg/kg/hr で塩酸 の気管内注入による生存率の低下を有意に改善 した． i）呼吸不全死に対する ハ ONO-5046･Na 作用 生存率（%） ム 同時投与 24 時間 48 時間 144 時間 塩酸対照群 33 25 25 ス 0.01mg/kg/hr 42 33 33 0.1 67* 50* 50* タ 1 83** 67** 58** ii）呼吸機能に対する 作用 ｜ ONO-5046･Na は 1mg/kg/hr で塩酸の気管内注入 による PaO2の低下を有意に抑制した． ONO-5046･Na 同時投与 PaO2低下の抑制率（%） 1mg/kg/hr 47** *:p < 0.05，**:p < 0.01，***:p < 0.001；それぞれの対照群（溶媒投与群）の反応値に比して有意差あり
iii）BALF 中傷害指標 に対する作用 ハ ム ONO-5046･Na は 1mg/kg/hr で塩酸の気管内注入 による BALF 中蛋白濃度増加および出血を有意 に抑制した． ス ONO-5046･Na タ 抑制率（%） ｜ 同時投与 白血球浸潤 蛋白濃度 出血 1mg/kg/hr 29 68*** 65** ④小腸虚血再灌流惹起イ ヌ急性肺傷害 （iv + iv infusion） 投与溶媒 B ONO-5046･Na は 10mg/kg/hr で再灌流 3 時間後に おける肺リンパ流量およびリンパ蛋白クリアラ ンスの上昇を抑制した． ONO-5046･Na 抑制率（%） i）肺水分平衡に対する 肺リンパ流量 リンパ蛋白クリアランス 作用 イ 10mg/kg + 10mg/kg/hr 71* 59* ii）呼吸機能に対する 作用 ヌ ONO-5046･Na は 10mg/kg/hr で再灌流 2 および 3 時間後における PaO2 / FIO2の低下を抑制した． ONO-5046･Na PaO2/FIO2低下の抑制率（%） 2 時間 3 時間 10mg/kg + 73* 67* 10mg/kg/hr ⑤ET 静脈内投与惹起 モルモット急性肺傷害 モデル モ ル 投与溶媒 E ET 対照群では肺重量が明らかに増加した．ONO-5046 トリス塩は 1mg/kg/hr 以上で ET の静脈内 投与による肺重量の増加を抑制した．
（iv infusion) モ ONO-5046 トリス塩
ッ 前投与 肺重量増加抑制率（%） ト 0.3mg/kg/hr 85 1 91* 3 100* *:p < 0.05，**:p < 0.01，***:p < 0.001；それぞれの対照群（溶媒投与群）の反応値に比して有意差あり （Dunnett の多重比較あるいは Student t 検定） 投与溶媒 B:生理食塩液（Na2CO3含有），投与溶媒 E:生理食塩液
表ホ−1 効力を裏付ける試験成績一覧表（つづき） 2）作用機序 試験項目（投与経路） 動 物 種 投与溶媒 および 投与量 試験成績 （１）酵素阻害活性の特異 性（in vitro） 試 投与溶媒 A ONO-5046･Na 1-500µM ONO-5046･Na はブタ膵臓由来エラスターゼを阻害 したが，その酵素阻害活性はヒトを含む他の動物 由来のエラスターゼ阻害活性に比べ，約 30 から 450 倍低く，さらに他のプロテアーゼに対しては 500µM でも明らかな阻害作用を示さなかた． 験 ONO-5046･Na 酵素 酵素阻害作用（Ki 値） 管 ブタ膵エラスターゼ 3,800nM プラスミン NI 内 トロンビン NI 膵カリクレイン NI 血漿カリクレイン NI カテプシン B NI 緑膿菌エラスターゼ NI I 型コラゲナーゼ NI （２）活性酸素種に対する 安定性（in vitro） 試 験 投与溶媒 D ONO-5046･Na 30-300nM ウリナスタチン HOCl 処理により，ONO-5046･Na のヒトエラスター ゼ阻害作用はほとんど変化しなかったが，ウリナ スタチンのヒトエラスターゼ阻害作用は IC50値で 比較すると約 2 倍上昇し，α1-PI のヒトエラスター ゼ阻害活性は完全に消失した． 管 3-30U/mL IC50値 ONO-5046･Na α1-PI ウリナスタチン
内 α1-PI HOCl(-) 94nM 0.45µg/mL 4.8U/mL
0.1-1µg/mL HOCl(+) 83nM NI 8.7U/mL
NI:阻害せず
（３）エラスターゼ惹起 モデルに対する効果 ①肺血管透過性亢進に対 投与溶媒 C 血管内皮細胞の透過性は添加したヒトエラスター ゼ濃度に依存して上昇し，ONO-5046･Na は 1µM で これを抑制した． する作用（in vitro） ウ エラスターゼ エラスターゼの血管透過性亢進作用（増加率%） 0.1µg/mL -10 シ 1 32* 5 100** 細 10 147** 30 205** 胞 ONO-5046･Na エラスターゼによる血管透過性亢進に対する 抑制率（%） エラスターゼ 1µg/mL エラスターゼ 10µg/mL 1µM 105** 98** ②急性肺傷害に対する作 用（iv infusion） ハ ム 投与溶媒 B エラスターゼ 300U/kg （気管内投与） ONO-5046･Na は，10 および 30mg/kg/hr でヒトエラ スターゼによる肺出血を有意に抑制したが，ウリ ナスタチンは 50,000 U/kg/3hr の静脈内持続投与 でもこれを抑制しなかった． エラスターゼによる肺出血抑制率（%） ス ONO-5046･Na ウリナスタチン 1mg/kg/hr 27 -タ 3 35 -10 50* -｜ 30 58** -50,000U/kg/3hr - 4 *:p < 0.05，**:p < 0.01；それぞれの対照群（溶媒投与群）の反応値に比して有意差あり（Dunnett の多重比較あるい は Student t 検定） -:実施せず 投与溶媒 B:生理食塩液（Na2CO3含有），投与溶媒 C:DMSO
表ホ−1 効力を裏付ける試験成績一覧表（つづき） （４）急性肺傷害モデルに おけるエラスターゼ 活性上昇に対する効果 ハ ム 投与溶媒 B ET 吸入対照群では BALF 中のエラスターゼ活性が明 らかに上昇していた．ONO-5046•Na は 3mg/kg/hr の後投与でエラスターゼ活性を抑制した． ①ET 吸入惹起ハムスター急 性肺傷害モデル ス ET 対照群（24hr 後）のエラスターゼ活性上昇率（%） (iv infusion) 3,298*** タ 後投与 ONO-5046･Na のエラスターゼ活性抑制率（%） 0.03mg/kg/hr 23 ｜ 0.3 36 3 81* ②CVF 静脈内投与惹起ハム スター急性肺傷害モデル (iv infusion) ハ 投与溶媒 B CVF 対照群では CVF の静脈内投与 30 分後に血漿中 エラスターゼ活性が明らかに上昇した．ONO-5046•Na は 0.1mg/kg/hr 以上で血漿中エラスター ゼ活性上昇を抑制した．一方，本モデルにおいて， デキサメサゾンおよびカタラーゼはこれを抑制し なかった． ム CVF 対照群のエラスターゼ活性上昇率（%） 449*** 前投与 ONO-5046･Na のエラスターゼ活性抑制率（%） ス 0.1mg/kg/hr 37** 0.3 67** 1 104** タ CVF 対照群のエラスターゼ活性上昇率（%） 274*** エラスターゼ活性抑制率（%） ｜ ONO-5046･Na デキサメサゾン カタラーゼ 1mg/kg/hr 93** - -3mg/kg - 32 -2,500U/kg/hr - - 32 *:p < 0.05，**:p < 0.01，***:p < 0.001；それぞれの対照群（溶媒投与群）の反応値に比して有意差あり （Dunnett の多重比較あるいは Student t 検定） -:実施せず 投与溶媒 B:生理食塩液（Na2CO3含有）
③塩酸気管内投与惹起 ハムスター誤嚥性肺傷害 モデル （iv infusion） ハ ム ス 投与溶媒 B 塩酸対照群では BALF 中エラスターゼ活性が明らか に上昇した．ONO-5046•Na は 1mg/kg/hr で塩酸の 気管内注入による BALF 中エラスターゼ活性上昇を 有意に抑制した． タ 塩酸対照群のエラスターゼ活性上昇率（%） ｜ ONO-5046･Na 24,285*** 同時投与 ONO-5046･Na のエラスターゼ活性の抑制率（%） 1mg/kg/hr 86*** ***:p < 0.001；対照群（溶媒投与群）の反応値に比して有意差あり（Student t 検定） 投与溶媒 B:生理食塩液（Na2CO3含有）
効力を裏付ける薬理試験 生体が臓器虚血や熱傷等の侵襲をうけると，明らかな感染が認められないにも関わらず感染時と同様の 全身性炎症反応が誘発されることが知られている．感染の有無に関わらず発症する，これら一群の炎症症 状は全身性炎症反応症候群（SIRS）と呼ばれている．SIRS では二次的に急性呼吸促迫症候群の急性肺障 害を併発することが多く，このことが SIRS 患者の予後を制限する一因となっている．近年，この様な急 性肺障害の発症には炎症反応により活性化された好中球由来の因子が重要な役割を果たしていることが明 らかになってきた．そのなかでもプロテアーゼである好中球エラスターゼ（以下，エラスターゼと略す） は，エラスチン，IV 型コラーゲンやプロテオグリカン等の細胞外マトリックスの主要構成成分を分解する ことから，肺障害に対する関与が注目されており，エラスターゼ阻害剤は SIRS に伴う肺障害に対して新 規治療薬として有用であることが期待される． エラスターゼ阻害剤として開発されたONO-5046･Na は， 1）in vitro において，各種動物由来のエラスターゼ活性を阻害し，そのヒト，イヌ，ウサギ，ラット，マ ウスおよびハムスター酵素に対する阻害定数（Ki 値）はそれぞれ，46，125，8，32，29 および 34nM で あり，ヒトエラスターゼによる天然基質エラスチンの分解に対するIC50値は1.7µM であった．2）全血系 において，末梢血をオプソナイズドザイモザンで刺激した際の血漿中エラスターゼ活性の上昇を抑制し， そのヒト，イヌおよびハムスターにおけるIC50値はそれぞれ，23µM（約 10µg/mL），39µM（約 17µg/mL） および15µM（約 7µg/mL）であった．3）ex vivo において，0.1mg/kg/hr 以上の静脈内持続投与で，オプ ソナイズドザイモザン刺激によるハムスター血漿中エラスターゼ活性の上昇を抑制した．4）in vivo にお いて，10mg/kg/hr 以上の静脈内持続投与は，ハムスターにエラスターゼを気管内投与して惹起される肺出
血を抑制した．このようにONO-5046･Na はin vitro，ex vivo および in vivo において，エラスターゼの
活性を阻害した． 培養ヒト肺動脈血管内皮細胞と好中球を用いた実験系において，ONO-5046･Na の試験管内添加は活性 化好中球による肺血管内皮細胞傷害を抑制した． 各種実験的急性肺傷害モデルに対する作用の検討において，ONO-5046･Na の静脈内持続投与は， 1）0.3mg/kg/hr 以上の用量の後投与でエンドトキシン（ET）吸入惹起ハムスター肺傷害モデルにおける， 気管支肺胞洗浄液（BALF）中の出血，蛋白漏出および白血球浸潤を抑制し，3mg/kg/hr では肺胞内好中 球浸潤，出血，血管周囲の浮腫および肺胞壁の変性/壊死等の病理組織所見を改善した．2）0.3mg/kg/hr 以上の前投与で，コブラ毒素（CVF）静脈内投与惹起ハムスター急性肺傷害モデルにおける肺血管透過性 亢進を抑制した．3）0.1mg/kg/hr 以上の用量の同時投与で塩酸気管内投与惹起ハムスター誤嚥性肺傷害モ デルにおける呼吸不全死を抑制し，1mg/kg/hr では肺胞内出血および蛋白漏出を抑制すると共に動脈血酸 素分圧（PaO2）の低下を抑制した．4）10mg/kg/hr の前投与で小腸虚血再灌流惹起イヌ急性肺傷害モデル における肺リンパ蛋白クリアランスの上昇（肺水腫の指標）を抑制すると共に，動脈血酸素分圧-吸入気酸 素濃度比（PaO2/FIO2）の低下を抑制した．このようにONO-5046･Na は，各種急性肺傷害モデルにおい てBALF 中肺傷害指標（炎症細胞浸潤，蛋白濃度および出血），肺血管透過性亢進（肺組織-血液中蛋白 クリアランス，肺リンパ流量およびリンパ蛋白クリアランス），PaO2低下等の急性肺傷害に特徴的な病態 を改善し，呼吸不全死の発現を抑制した．
ONO-5046･Na の代謝物かつ不純物である，M-1（I-1）は 100µM まで明らかなヒトエラスターゼ阻害
作用を示さなかった．また不純物であるI-2，I-3 および I-4 のヒトエラスターゼ阻害作用（IC50）はそれ
ぞれ，ONO-5046･Na の約 1/1，1/1，および 2/1 であった．一方，ONO-5046･Na の臨床投与時（PhaseI，
単回静脈内持続投与試験）におけるM-1（I-1）の血中濃度は未変化体の約 1/40 であり，他の不純物の含 有量はいずれも %以下と極めて低いことを考慮すると，これらの代謝物や不純物が ONO-5046･Na の 薬効に寄与する可能性は低いと考えられる． 作用メカニズム 作用メカニズムの検討において， 1) ONO-5046･Na は，ブタ膵エラスターゼ活性を阻害したが，その阻害活性は他の動物由来のエラスター ゼ阻害活性に比べ約 30-450 倍低く，その他のセリンプロテアーゼ（プラスミン，トロンビン，膵カリク レイン，血漿カリクレイン）やカテプシン B 等のシステインプロテアーゼおよび緑膿菌エラスターゼやコ ラゲナーゼ等のメタロプロテアーゼを 500µM においても阻害しなかった．従って，ONO-5046･Na はエ ラスターゼ選択的阻害剤であると考えられた．2）活性酸素種に対する安定性の検討において，内因性エ
ラスターゼ阻害物質であるα1-protease inhibitor（α1-PI）やウリナスタチンのエラスターゼ阻害活性は，
活性酸素種であるHOCl により消失あるいは低下したが，ONO-5046･Na のエラスターゼ阻害活性は HOCl
により変化しなかった．3）培養ウシ肺動脈血管内皮細胞を用いた実験系において，ヒトエラスターゼは 添加濃度に依存して血管内皮細胞傷害を惹起し，この傷害は培養液中に ONO-5046･Na を添加することで 抑制された．4）in vivo において，エラスターゼの気管内投与は明らかな肺傷害を惹起した．この傷害は ONO-5046･Na の静脈内持続投与によって抑制されたが，ウリナスタチンでは抑制されなかった．5） ONO-5046･Na が有効性を示した肺傷害モデルでは，BALF 中又は血漿中でエラスターゼ活性が上昇した． ONO-5046･Na は，これらの傷害を抑制する用量で BALF 中又は血漿中エラスターゼ活性の上昇を抑制し た．以上より，エラスターゼはその広範な蛋白分解活性を介して血管内皮細胞や肺組織を傷害し，急性肺 傷害の特徴的な病態の形成に関与しており，ONO-5046･Na はエラスターゼを選択的に阻害することによ り肺傷害を抑制すると考えられる．一方，生体にα1-PI 等の多量の内因性エラスターゼ阻害物質が存在す るにも関らず，ONO-5046･Na がエラスターゼによる組織傷害を抑制した理由として，1）これらの内因 性エラスターゼ阻害物質が炎症局所では好中球の産生する活性酸素種により阻害作用が失活あるいは低下 するのに対して，ONO-5046･Na の阻害作用は活性酸素種の影響を受けないために，炎症局所で効果的に エラスターゼを阻害した 2）これらの内因性エラスターゼ阻害物質は分子量が大きいために立体的制約を 受け，炎症局所に到達できない可能性等が推察される． 本剤と他剤の比較 本剤と同じ薬理作用を有する薬剤は上市されていないため，ONO-5046･Na の有効性をステロイド性お よび非ステロイド性抗炎症薬と比較した．デキサメサゾンは前投与で ET 吸入惹起ハムスター肺傷害モデ ルに明らかな有効性を示したが，後投与では本モデルに有効性を示さなかった．また，非ステロイド性抗 炎症薬であるインドメサシンは前投与においても本モデルに無効であった．一方，ONO-5046･Na は後投 与においても本モデルにおいてデキサメサゾンの前投与における場合と同等の有効性を示した．
1）効力を裏付ける薬理試験 （1）エラスターゼ阻害作用
ONO-5046･Na のヒトおよびその他の動物のin vitro におけるエラスターゼ阻害作用について検討した．
また，ONO-5046･Na のin vitro および ex vivo 血漿中エラスターゼ阻害作用について検討するために，
各種動物由来の血液をオプソナイズドザイモザン（OZ）で刺激し，上昇した血漿中エラスターゼ活性に対 する本剤の作用について検討した． ①in vitro におけるエラスターゼ阻害作用 i）合成基質を用いた阻害作用 イ）方法 合成基質 Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA を用いた吸光光度法により被験薬の阻害活性を測定した． すなわち，基質，0.5 M 塩化ナトリウムおよび 0.1% ポリエチレングリコール 6000 を含む 0.1M HEPES 緩衝液 (pH 8.0)を反応液として，エラスターゼおよび被験薬を 37℃でインキュベーション した．反応液中に遊離した p-nitroaniline（pNA）による 405nm における吸光度変化を経時的に測 定し，Dixon プロット法により Ki 値を算出した． ロ）成績 ONO-5046･Na はヒトエラスターゼを阻害し，その Ki 値は 46±2nM，阻害様式は拮抗型であった（図 ホ−2）．また，ONO-5046･Na はヒトエラスターゼと同様に各種動物由来エラスターゼを阻害し， 小動物種間におけるエラスターゼ阻害作用において種特異性は低いと考えられた．ヒトα1-PI もこれ らのエラスターゼ活性を阻害したがウリナスタチンは 1,000U/mL においてもこれらを阻害しなかっ た（表ホ−2）．
ONO-5046･Na の存在下（10 nM：●；30 nM：▲；100 nM：■；300 nM：◆）に ヒトエラスターゼ活性を測定し，Lineweaver-Burk プロットを行った．
縦軸は反応速度の逆数，横軸は基質濃度の逆数を示す．
表ホ−2 ONO-5046･Na，α1-PI およびウリナスタチンの各種動物由来エラスターゼに対する阻害作用
Ki 値
酵素源 ONO-5046･Na(nM) α1-PI(µg/mL) ウリナスタチン(U/mL)
ヒト好中球 46±2 2.6±0.6 7.8±2.3 マウス好中球 29±3 0.14(n=2) NI ハムスター好中球 34±6 0.42±0.07 NI ラット好中球 32±1 0.22±0.05 NI モルモット好中球 12±1 0.19±0.06 NI ウサギ好中球 8±2 0.77±0.13 NI イヌ好中球 125±13 0.33±0.04 NI 結果は2 あるいは 3 実験の平均値±標準誤差で表す．NI：1,000U/mL で阻害作用なし． ii）天然基質を用いた阻害作用 イ）方法 0.5M 塩化ナトリウムおよび 0.1% ポリエチレングリコール 6000 を含む 0.1M HEPES 緩衝液（pH 8.0）に，エラスターゼの天然基質としてエラスチンコンゴレッド（終濃度 1mg/mL），ヒトエラ 0.5∼5.0µM）を加え，37℃で 60 分間インキュベーションした．イ
ンキュベーション後，反応液中に遊離したコンゴレッドによる吸光度の変化を490nm で測定した． ロ）成績 ONO-5046･Na はヒトエラスターゼによる天然基質エラスチンの分解を抑制し，その IC50値は 1.7 ±0.2 µM であった． ②全血系におけるエラスターゼ阻害作用（in vitro） i）方法 ハムスター，イヌあるいはヒト（健常成人男子ボランティア）よりクエン酸採血して得た血液にOZ および被験薬を添加し，37℃で一定時間（ハムスター，イヌおよびヒトにおいてそれぞれ 30，30 および15 分間）インキュベーションした．インキュベーション終了後，血液を遠心分離し，回収 した血漿をエラスターゼ活性の測定に供した．すなわち，ハムスターあるいはヒト血漿と合成基質 Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA を Tris 緩衝液下に 37℃で 24 時間インキュベーションし，緩衝液 中に遊離したpNA 量を吸光度 405 nm で測定した．一方，イヌ血漿と合成基質 Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC をトリエタノールアミン緩衝液下に 37℃で 24 時間インキュベーションし，緩衝液 中に遊離したAMC による蛍光強度の増加量を測定した．いずれの動物においても，血漿 1mL あ
たりのpNA または AMC 遊離量を血漿中エラスターゼ活性とした．なお，ヒト血漿については ELISA
法を用いてエラスターゼとα1-PI の複合体量を測定した． ii）成績 ハムスター，イヌおよびヒトの血液に OZ を添加すると血漿中エラスターゼ活性がそれぞれ明らか に上昇した．ONO-5046･Na は 30 M 以上の濃度でエラスターゼ- α1-PI 複合体量に影響を与えず に，ヒト血漿中エラスターゼ活性の上昇を抑制し，IC50値は23±3µM（約 10µg/mL）であった． ウリナスタチンは2,500U/mL の濃度においてもこれを阻害しなかった（図ホ−3）．同様に ONO-5046･Na はハムスターおよびイヌ血漿中エラスターゼ活性の上昇を抑制し，IC50値はそれぞれ，15 ±1µM（約 7µg/mL）および 39±8µM（約 17µg/mL）であった．
影響
結果は 4 実験の平均値±標準誤差を示す． ∗∗p < 0.01：OZ 刺激群に対する Dunnett の多重比較；
③ex vivo 系におけるエラスターゼ阻害作用 i）方法 麻酔下，ハムスターの大腿静脈よりONO-5046･Na を 2 時間持続投与した．投与終了後，腹部大動 脈より血液をクエン酸採血し，前述の方法（資料 P.187，②-i））に従い血液を OZ 刺激後，血漿中 エラスターゼ活性を測定した．なお，ONO-5046･Na の投与時間は予備試験の結果より設定した．す なわち，ハムスターに上述した方法でONO-5046･Na を 2 時間持続投与した結果，血漿中エラスター ゼ活性（×10 nmole pNA/mL，平均値±標準誤差）は，本剤の投与前，投与開始 0.5，1，1.5 およ び2 時間後において，それぞれ 23±3，13±2，10±1，10±1 および 9±2 であり，投与開始 2 時間 後には本剤の血漿中エラスターゼ阻害活性はほぼ一定に達していると判断した． ii）成績 ハムスター血液にOZ を添加すると血漿中エラスターゼ活性が明らかに上昇した．ONO-5046･Na は 0.1，0.3 および 1.0mg/kg/hr の静脈内持続投与で OZ による血漿中エラスターゼ活性の上昇を抑制し た（図ホ−4）． 図ホ−4 OZ 刺激により上昇するハムスター血漿中のエラスターゼ活性に及ぼす ONO-5046･Na の ex vivo 阻害作用 結果は各群7-8 例の動物の平均値±標準誤差を示す．∗p < 0.05， ∗∗p < 0.01：OZ 刺激群に対す るDunnett の多重比較；###p < 0.001：無刺激群に対する Student t 検定．
以上のように，ONO-5046･Na はin vitro において，ヒトエラスターゼを拮抗阻害し，その阻害作用はヒ
ト以外の動物種由来のエラスターゼに対しても認められ，種特異性は低いと考えられた．さらに，ONO-5046･Na はin vitro および ex vivo において，各種動物の血液の OZ 刺激による血漿中エラスターゼの上
昇を阻害した．ONO-5046•Na はエラスターゼとα1-PI の複合体量に影響しないことから，そのエラスター
ゼ阻害作用は好中球からのエラスターゼ遊離抑制を介した二次的な抑制作用ではなく，酵素阻害作用によ るものであることが示唆された．
（2）好中球による肺血管内皮細胞傷害に対する効果 急性肺傷害の発症および進展に，好中球による肺血管内皮細胞傷害が関与することが報告されている． そこでin vitro において，活性化好中球による内皮細胞傷害に対する ONO-5046･Na の作用について検討 した． ①方法 ヒト肺動脈内皮細胞を培養ディスク上でコンフルエントになるまで培養した．コンフルエントになっ た内皮細胞（5x105）に正常ヒト好中球（4x106）とfMLP（1µM）あるいは PMA（10ng/mL）を添加 し，被験薬の存在あるいは非存在下に37℃で 120 分間インキュベーションした．内皮細胞より遊離し た培養上清中の乳酸脱水素酵素（LDH）活性を測定し，これを内皮細胞傷害の指標とした． ②成績 内皮細胞傷害は無刺激の好中球によっても惹起されたが，fMLP あるいは PMA で刺激した好中球では 内皮細胞傷害がより顕著であった．ONO-5046･Na は 0.5µM の濃度で，無刺激あるいは刺激下の好中 球による内皮細胞傷害を有意に抑制した．一方活性酸素種 O2-の消去酵素であるスーパーオキサイド ディスムターゼ（SOD，10µg/mL）もこれらの内皮細胞傷害を抑制し，ONO-5046･Na および SOD の共存ではさらに強く内皮細胞傷害を抑制した（図ホ−5）． 図ホ−5 活性化好中球による内皮細胞傷害に対する作用 LDH 活性は内皮細胞中の全 LDH 活性に対する培養液中 LDH 活性の比率を示す．結果は３試験 の平均値±標準偏差を示す． *p < 0.05：対照群に対する Student t 検定．
急性肺傷害の特徴として，肺間質や肺胞に高度の好中球浸潤を伴う肺間質性および肺胞性肺水腫があげ られる．患者の肺胞内には出血や蛋白性滲出液の漏出を認め，肺胞における蛋白性滲出液の漏出が高度に なると，ガス交換能障害により呼吸機能が低下し，ひいては呼吸不全死を招くと考えられる．そこで，急 性肺傷害モデルにおける指標として，BALF 中肺傷害指標（炎症細胞数，蛋白濃度および出血），肺血管 透過性（肺組織-血液中蛋白クリアランス，肺リンパ流量およびリンパ蛋白クリアランス），動脈血酸素分 圧（PaO2），肺重量，病理組織所見および生存率に注目し，これらの指標に対する ONO-5046･Na（肺重 量についてはONO-5046 トリス塩）の作用について検討した． ①ET 吸入惹起ハムスター急性肺傷害モデル i）BALF 中肺傷害指標に対する作用 イ）方法 超音波式ネブライザーを用いて，ハムスターにエンドトキシン（ET）溶液（300µg/mL）を 30 分 間吸入させた．ET 吸入終了 24 時間後，麻酔下に動物を放血致死させ，0.38%クエン酸ナトリウム 含有生理食塩液を用いて気管支肺胞洗浄液（BALF）を回収した．回収した BALF を遠心分離後， BALF 上清および沈渣を用いてそれぞれ出血，蛋白濃度および浸潤白血球数を測定した．すなわち， BALF 中血液成分を蒸留水にて溶血させ，その程度を吸光光度法にて，BALF 上清中の蛋白濃度を Lowry 法にて，BALF 沈渣の浸潤白血球数を自動血球測定器にて，それぞれ測定した．ONO-5046•Na
はET 吸入終了 2 時間後より 24 時間後まで大腿静脈内に持続投与した．デキサメサゾンは ET の吸 入の3 時間前あるいは ET の吸入終了 2 時間後に，インドメサシンは ET の吸入直前および吸入終 了 8 時間後に，それぞれ静脈内投与した．なお正常対照群，ET 対照群，デキサメサゾンおよびイ ンドメサシン処置群ではいずれにおいても生理食塩液を静脈内に持続投与した． ロ）成績 ONO-5046･Na の後投与は，0.3mg/kg/hr 以上の投与量で ET 吸入による BALF 中の白血球浸潤， 蛋白濃度増加および出血を抑制し，3mg/kg/hr の投与量では BALF 中の白血球数，蛋白濃度増加お よび出血を投与開始時対照群（ET 吸入終了 2 時間後）と同程度まで抑制した（図ホ−6）．一方， 本モデルにおいて，デキサメサゾン（3mg/kg iv，ET 吸入 3 時間前）の前投与は ET 吸入終了 24 時間後の BALF 中白血球浸潤，蛋白濃度増加および出血を顕著に抑制したが，後投与（ET 吸入終 了2 時間後）ではいずれのパラメータも抑制しなかった．またインドメサシン（10mg/kg iv）の前 投与（ET 吸入直前および 8 時間後）もいずれのパラメータも抑制しなかった．（図ホ−7）．
図ホ−6 ET 吸入惹起ハムスター肺傷害における BALF 中肺傷害指標に対する ONO-5046•Na 後投与の作用
結果は各群 11-12 例の動物の平均値±標準誤差を示す．###p < 0.001：正常対照群に対する Student
びインドメサシンの作用
結果は各群12 例の動物の平均値±標準誤差を示す．†：ONO-5046･Na(3mg/kg/hr)，###p < 0.001：
正常対照群に対するStudent t 検定；**p < 0.01，***p < 0.001：ET（24hr 後）対照群に対する
ii）病理組織所見に対する作用 イ）方法 前述の方法（資料 P.192，①-i)-イ））に従い，ハムスターにエンドトキシン（ET）溶液を 30 分間 吸入させた．ET 吸入終了 24 時間後に麻酔下に動物を放血致死させ，右肺に 10%中性緩衝ホルマリ ン液を注入して，肺を拡張固定した．右後葉および右中葉を切り出し，パラフィン包埋および薄切 後，ヘマトキシリン-エオジン染色を行い光学顕微鏡下に病理組織所見を検討した．ONO-5046•Na はET 吸入終了 2 時間後より 24 時間後まで大腿静脈内に持続投与した．なお正常対照群および ET 対照群ではいずれにおいても生理食塩液を静脈内に持続投与した． ロ）成績 ET 吸入 2 時間後では既に肺胞内好中球浸潤，出血，血管周囲の浮腫および肺胞壁の変性/壊死等の 変化が認められたが，これらの変化は ET 吸入 24 時間後でより高度であった．ONO-5046•Na （3mg/kg/hr）の後投与群におけるこれらの変化は軽度もしくは投与開始時対照群と同程度であり， 血管周囲の浮腫の程度はむしろ投与開始時対照群より軽度であった（図ホ−8）．
図ホ−8 ET 吸入惹起ハムスターの病理組織学的所見に対する ONO-5046•Na 後投与の作用
写真は正常対照群（A），ET 対照群（2hr 後）（B），ET 対照群（24hr 後）（C），および ONO-5046•Na 投与群（24hr 後）（D）における各 5-6 例の検討において，各群の動物の肺血管 周囲および肺胞の代表的写真撮影像を示す．
②CVF 静脈内投与惹起ハムスター急性肺傷害モデル i）肺血管透過性亢進に対する作用 イ）方法 麻酔下に，ハムスターの頸背部から皮下を介して大腿静脈にカテーテルを装着した．頸背部より導 出したカテーテルの他端はインフュージョンポンプに連結した．動物が麻酔から覚醒後，インフュー ジョンポンプを用いて生理食塩液を静脈内に持続投与した．持続投与を開始してから 90 分後に， 装着したカテーテルより CVF(10 U/kg)および 125I-BSA を静脈内投与し，その 30 分後に肺血管透 過性を評価した．すなわち，麻酔下にヘパリンを腹腔内投与し，腹部大動脈より動脈血 1mL をク エン酸採血した．放血致死により動物を屠殺後，生理食塩液で肺を灌流した．採血した動脈血およ び灌流肺中の放射活性を測定し，血液 1mL の放射活性に対する肺組織の放射活性の割合を肺血管 透過性の指標とした．ONO-5046•Na およびカタラーゼは，CVF 投与の 90 分前から屠殺時まで静 脈内に持続投与した．デキサメサゾンはCVF を静脈内投与する 3 時間前に前肢静脈内へ投与した． なお，正常対照群，CVF 対照群およびデキサメサゾン投与群には生理食塩液を静脈内に持続投与し た． ロ）成績 CVF の静脈内投与により，肺血管透過性が約 4.9 倍亢進した．ONO-5046•Na（0.1，0.3 および 1mg/kg/hr）は，用量依存的に CVF の静脈内投与による肺血管透過性亢進を抑制し，0.3mg/kg/hr 以上の用量で有意であった（図ホ−9）．一方，本モデルにおいて，デキサメサゾン（3mg/kg）は 肺血管透過性亢進を抑制したが，活性酸素消去酵素であるカタラーゼ（2,500 U/kg/hr）はこれを抑 制しなかった（図ホ−10）．
図ホ−9 CVF 静脈内投与惹起ハムスター急性肺傷害における肺血管透過性亢進に対する ONO-5046•Na の作用 結果は 5-9 例の動物の平均値±標準誤差を示す．###p < 0.001：正常対照群(生理食塩液静脈内投 与群）に対するStudent t 検定；*p < 0.05，**p < 0.01：CVF 対照群に対する Dunnett の多重 比較． 図ホ−10 CVF 静脈内投与惹起ハムスター急性肺傷害におけるカタラーゼおよびデキサメサゾンの作用 結果は 7-8 例の動物の平均値±標準誤差を示す．†：ONO-5046･Na（1mg/kg/hr），###p < 0.001： 正常対照群（生理食塩液静脈内投与群）に対する Student t 検定；*p < 0.05，***p < 0.001：CVF 対照群に対する Student t 検定．
ii）BALF 中肺傷害指標に対する作用 イ）方法 前述の方法（資料P.197，②-i)-イ））に従い，ハムスターに ONO-5046•Na および CVF を静脈内 投与した．CVF の静脈内投与 30 分後，麻酔下にヘパリンを腹腔内投与し動物を放血致死させた． 0.38%クエン酸ナトリウム含有生理食塩液を用いて動物より BALF を回収し，その遠心分離上清中 の蛋白濃度を測定した．また，BALF の回収を終了した肺組織はホモジネートの後遠心分離を行い， その遠心分離上清中のミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性を測定し，好中球数の指標とした．す なわち，上清をH2O2存在下に発色色素とインキュベーションし，酸化された発色色素の450nm に おける60 秒間の吸光度変化を MPO 活性とした． ロ）成績 CVF の静脈内投与により，BALF 中蛋白濃度および肺組織好中球数がそれぞれ約 2.3 倍および 2.8 倍増加した．ONO-5046•Na は 1mg/kg/hr の静脈内持続投与において，CVF の静脈内投与による BALF 中蛋白濃度上昇を著明に抑制したが，肺組織好中球数は抑制しなかった（図ホ−11）． 図ホ−11 CVF 静脈内投与惹起ハムスター急性肺傷害における BALF 中蛋白濃度および肺組織好中球数 に対する ONO-5046•Na の効果 結果は各群 11-12 例の動物の平均値±標準誤差を示す．##p < 0.01，###p < 0.001：正常対照群(生 理食塩液静脈内投与群）に対する Student t 検定；*p < 0.05：CVF 対照群に対する Student t 検定．
i）呼吸不全死に対する作用 イ）方法 麻酔下に，ハムスターの頸背部から皮下を介して大腿静脈にカテーテルを装着した．カテーテルを 頸背部より導出し，ONO-5046•Na の静脈内持続投与に供した．カテーテルを装着後，気管内に塩 酸(0.2N，200µL)を注入し，以後経時的に生存率を観察した．ONO-5046•Na は，塩酸の注入直後 より48 時間後まで静脈内に持続投与した．なお塩酸対照群には生理食塩液を静脈内持続投与した． ロ）成績 塩酸対照群の最終生存率は 25％であった．ONO-5046･Na（0.01，0.1 および 1mg/kg/hr）は，塩 酸の気管内注入による生存率の低下を用量依存的に抑制（最終生存率はそれぞれ 33，50，58％） し，その抑制作用は0.1 および 1mg/kg/hr で塩酸対照群に比べ有意であった（図ホ−12）． 図ホ−12 塩酸気管内投与惹起ハムスター誤嚥性肺傷害における ONO-5046･Na の延命効果 結果は各群12 例の動物の結果を示す．*p < 0.05，**p < 0.01：塩酸対照群に対する logrank 検定．
ii）呼吸機能に対する作用 イ）方法 前述の方法（資料 P.200，③-i)-イ））に従い，ハムスターの頸動脈および大腿静脈にカテーテルを 装着後，塩酸を気管内に注入した．塩酸注入終了 8 時間後に装着した頸動脈カテーテルより動脈血 をヘパリン採血し，動脈血酸素分圧（PaO2）の測定に供した．なお観察期間中に動物がギャスピン グ症状を示した場合，死亡直前とみなしその時点で動脈血を採血し PaO2を測定した．また，正常 対照群には燐酸緩衝液（PBS(-)）を気管内注入および生理食塩液を静脈内持続投与した． ロ）成績 観察期間中，塩酸対照群において 9 例中 5 例がギャスピング症状を示し，切迫屠殺を行った．なお 正常対照群および ONO-5046･Na 投与群はいずれの動物もギャスピング症状を示さなかった．塩酸 対照群における生存例および切迫屠殺例を含めた塩酸対照群の全例では，塩酸の気管内注入により PaO2が約64％低下した．塩酸対照群の全例に比べ，ONO-5046･Na の 1mg/kg/hr 静脈内持続投与 はPaO2の低下を有意に抑制した（図ホ−13）． 図ホ−13 塩酸気管内投与惹起ハムスター誤嚥性肺傷害における呼吸機能低下に対する ONO-5046･Na の効果 結果は4-9 例の動物の平均値±標準誤差を示す．###p < 0.001：正常対照群（PBS(-)気管内 注入群）に対する Student t 検定；*p < 0.05，**p < 0.01：塩酸対照群（全例，生存例
iii） BALF 中肺傷害指標に対する作用 イ）方法 前述した呼吸機能に対する作用の検討（資料P.201，ii)-イ））において，動脈血酸素分圧（PaO2） の測定を終了後，麻酔下に動物を放血致死させ，BALF を回収した．回収した BALF を遠心分離後， 得られた上清の蛋白量，出血および白血球数を，資料 P.173，①-i)-イ）に示す方法を用いて測定し た．なお，正常対照群には燐酸緩衝液（PBS(-)）を気管内注入および生理食塩液を静脈内持続投与 した． ロ）成績 塩酸の気管内注入後の生存例および切迫屠殺例を含めた塩酸対照群の全例では BALF 中蛋白濃度お よび白血球数がそれぞれ約24 および 4.5 倍増加し，出血も明らかであった．塩酸対照群の全例に比 べ，ONO-5046･Na は 1mg/kg/hr の静脈内持続投与で BALF 中蛋白濃度増加および出血を抑制し た．一方，ONO-5046･Na 投与群における BALF 中白血球数は，塩酸対照群の全例に比べると有意 ではなかったが塩酸対照群の生存例と比べると有意であった（図ホ−14）． 図ホ−14 塩酸気管内投与惹起ハムスター誤嚥性肺傷害における BALF 中蛋白濃度増加，出血および 白血球浸潤に対する ONO-5046･Na の効果 結果は 4-9 例の動物の平均値±標準誤差を示す．#p < 0.05，###p < 0.001：正常対照群（PBS(-) 気管内注入群）に対する Student t 検定；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001：塩酸対照群 （全例，生存例および切迫屠殺例）に対するStudent t 検定．
④小腸虚血再灌流惹起イヌ急性肺傷害に対する作用 i）肺水分平衡に対する作用 イ）方法 麻酔下のイヌを気管内挿管し， 陽圧換気（換気量：12mL/kg/回；換気回数：16 回/分）を行った． 右大腿動脈および右大腿静脈にカテーテルおよび Swan-Ganz カテーテルを，さらに開胸後左心耳 にカテーテル挿入し，肺血行動態の測定に供した．また左気管の気管支リンパ節にポリエチレン細 管を挿入し，肺リンパ瘻を作成した．右大腿動脈より挿入したバルーンカテーテルを用いて上腸間 膜動脈主幹部を 2.5 時間虚血後再灌流し，その後経時的に 3 時間肺動脈圧，肺毛細血管圧および肺 リンパ蛋白クリアランス比を測定した．肺リンパ蛋白クリアランス比はリンパ液および血漿中蛋白 濃度比より算出した．被験薬は再灌流 15 分前に 10mg/kg を単回静脈内投与した後，試験期間中 10mg/kg/hr にて右大腿静脈より持続投与した． ロ）成績 再灌流後，対照群では虚血前値に比べ，肺リンパ流量比および肺リンパ蛋白クリアランス比が上昇 した．一方，ONO-5046･Na の 10mg/kg/hr 投与は肺動脈圧および肺毛細血管圧に影響することな く，再灌流後の肺リンパ流量比および肺リンパ蛋白クリアランス比の上昇を抑制し，再灌流 3 時間 後における肺リンパ流量および肺リンパ蛋白クリアランスは，いずれにおいても再灌流群に比べ有 意に低かった（図ホ−15）．
蛋白クリアランス比に対する作用
結果は再灌流群（○）および ONO-5046･Na（●）投与群の動物（各 7 例）における平均値±
ii）呼吸機能に対する作用 イ）方法 同上（資料 P.203，④-i)-イ））のイヌにおいて，再灌流後経時的に動脈血を採血し，動脈血酸素分 圧/吸入気酸素濃度比（PaO2 / FIO2）を測定した． ロ）成績 再灌流後，対照群では閉塞前値に比べPaO2 / FIO2が低下した．一方，ONO-5046･Na の 10mg/kg/hr 投与は再灌流後のPaO2 / FIO2の低下を抑制し，再灌流2 および 3 時間後における PaO2 / FIO2は再 灌流群に比べ有意に高かった（図ホ−16）． 図ホ−16 イヌ小腸虚血再灌流惹起急性肺傷害における動脈血酸素分圧／吸入気酸素濃度比に 対する作用 結果は再灌流群（○）およびONO-5046･Na（●）投与群の動物（各7 例）における平均値± 標準誤差の経時変化を示す．*p < 0.05：虚血前値に対する Student t 検定． 以上のようにONO-5046･Na は各種急性肺傷害モデルにおいて，BALF 中肺傷害指標（炎症細胞浸潤，蛋 白濃度および出血）や肺血管透過性（肺組織-血液中蛋白クリアランス，肺リンパ流量およびリンパ蛋白ク リアランス）を抑制し，動脈血酸素分圧（PaO2）および生存率を改善した．
⑤ET 静脈内投与惹起モルモット急性肺傷害モデル i）方法 ウレタン麻酔下のモルモットに ET（2mg/kg）を静脈内投与した．ET 静脈内投与 4 時間後に，モル モットを放血致死させ，肺を摘出しその重量を測定した．ONO-5046 トリス塩は，ET 静脈内投与の 10 分前から 4 時間後まで頸静脈内に持続投与した．なお，正常対照群および ET 対照群ではそれぞれ 生理食塩液を頸静脈内に持続投与した． ii）結果 ET 対照群では ET 静脈内投与 4 時間後に肺重量が増加した．ONO-5046 トリス塩の静脈内持続投与 は，肺重量の増加を抑制し，その作用は 1 および 3mg/kg/hr で各々，ET 対照群に対して有意であっ た（図ホ−17）． 肺重量 比 (肺重量/体重量x1000) 正常対照 ET対照 0.3 1 3 ONO-5046トリス塩 (mg/kg/hr) 6 6.5 7 7.5 8
