動 脈 硬 化 29(3):69-75, 2002
酸 化Lp(a)測
定 の有 用性
高血 圧 患 者 血 清 中 の酸 化Lp(a)に
つ い て
山 田 晋 吾1森 下 竜 一2中 村 成 史3 荻 原 俊 夫3楠 美 嘉 晃4桜 井 勇4 久 保 信 彦5櫻 林 郁 之 介6 は じ め に 高Lp(a)血 症 は 冠 動 脈 疾 患1,2)や脳 梗 塞3)の 危 険 因 子 と 考 え ら れ て い る. 加 え て, 酸 化Lp(a)が 動 脈 硬 化 の 進 展 に 寄 与 す る可 能 性 が 指 摘 さ れ て い る. 例 え ば, 酸 化Lp(a)は, 酸 化LDL同 様 ス カ ベ ン ジ ャ レ セ プ タ ー を 介 し て マ ク ロ フ ァ ー ジ に 取 り込 ま れ 泡 沫 細 胞 を形 成 す る4). また, 内 皮 細 胞 に お け るplasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)の 産 生 能 はLp(a)よ り も高 い5,6). さ ら に, 酸 化Lp(a)は 内 皮 細 胞 依 存 性 の 血 管 拡 張 を 阻 害 す る が, そ の 阻 害 能 は 酸 化LDL よ り も 強 力 で あ る7). しか し, 実 際 の 生 体 内 で の 酸 化Lp(a) の 血 液 中 動 態 や 血 管 壁 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て は 全 く不 明 で あ る. 我 々 はLp(a)に 反 応 し プ ラ ス ミ ノ ー ゲ ン に 反 応 し な い モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 得 る 過 程 で, 偶 然 にLp(a)に は 反 応 せ ず 酸 化Lp(a)に 特 異 的 に 反 応 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体(161E2)を 得 た8). 161E2は, apo(a)の 酸 化 処 理 に よ り 新 た に 表 面 に 露 出 す る ペ プ チ ドエ ピ トー プ を 認 識 す る. 我 々 は, 本 抗 体 を使 用 し て 血 清 中 の 酸 化Lp(a)のELISA 法 に よ る測 定 系 を 開 発 し た. さ ら に, 血 管 壁 機 能 の 異 常 が 知 られ る 高 血 圧 症 の 患 者 の 酸 化Lp(a)を 測 定 した9). I. 対 象 と方 法 正 常 血 圧 者113名(男 子59名 女 子54名, 平 均 年 齢 59±2歳)と 未 治 療 の 本 態 性 高 血 圧 患 者223名(男 子117 名 女 子106名, 平 均 年 齢61±2歳)を 対 象 に 検 討 を 行 っ た. ま た 高 血 圧 患 者 をWHOの ガ イ ドラ イ ン10)に 従 い, 合 併 症 の な い 群(160名, WHO(I))と 合 併 症 の あ る 群(63 名, WHO(II)/(III))の3群 に 分 類 し た. 検 体 は 採 血 後 た だ ち に-80℃ に 凍 結 し, 測 定 す る ま で 保 存 し た. 1) 抗 酸 化Lp(a)モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体(161E2) apo(a)中 の ペ プ チ ド配 列11)の 抗 原 性 を い く つ か の 方 法12-14)に よ り評 価 し た 結 果, ク リ ン グ ル4タ イ プ2の9残 基(Arg-Asn-Pro-Asp-Ala-Val-Ala-Ala-Pro)を 抗 原 と し て 選 択 し た. こ の 合 成 ペ プ チ ド をKLH(Carbiochem)に 結 合 し た も の を抗 原 と し てBALB/cマ ウ ス に 免 疫 し て, Mil-stein15)ら の 方 法 に 従 い 抗 体 産 生 細 胞 を樹 立 し た. 2) プ ラ ス ミ ノ ー ゲ ン, LDL, Lp(a)の 精 製 新 鮮 血 清 か ら プ ラ ス ミ ノ ー ゲ ン, LDL, Lp(a)の 精 製 を 行 っ た. 血 清 か ら 超 遠 心 機 に て1.063<d<1.12分 画 (Lp(a)-rich fraction)と1.21>d分 画(serum protein-rich fraction)を 調 製 し た. Lp(a)は1.063<d<1.12分 画 か ら lysine-Sepharose6Bア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り精 製 し16,17), LDLは 同 粗 画 分 を, 抗Lp(a)ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体(International Enzyme)固 定 化 カ ラ ム に 通 過 さ せ て, Lp(a)を 除 去 し て 調 製 し た. ま た プ ラ ス ミ ノ ー ゲ ン は 1.21>d分 画 か らlysine-Sepharose6Bア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー に よ り精 製 し た18). 3) 酸 化Lp(a)の 調 製 酸 化Lp(a)はLp(a)を 銅 イ オ ン19)(CuCl2:0, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 10.0μg/ml, Wako Chemical)又 は lipoxygenase20)(0, 1.0, 3.0, 5.0, 20.0μg/ml, Sigma)で37℃, 12時 間 処 理 し て 調 製 し た. ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 上 の 易 動 度 の 増 加 と 過 酸 化 脂 質(TBARS:Wako Chemical)の 増 加 に よ り酸 化 を 確 認 し た. 1 (株)シ ノ テス ト 2 大 阪大 学 大 学 院 医学 系研 究科 遺 伝 子 治 療 学 3 大 阪大 学 第 四 内科 4 日本 大 学 医 学部 病 理 学 教 室 5 自治 医科 大 学 臨床 検 査 医 学教 室 6 自治 医科 大 学大 宮 医 療 セ ンタ ー総 合 医 学. 講 座 臨 床 病 理 部 キー ワ ー ド:酸 化lipoprotein(a), モ ノ ク ロー ナ ル抗 体, 酵 素 免疫 測 定 法, 動脈 硬 化, 高 血 圧症 原 稿受 取 日:2001年10月19日 採 用 決定 日:2002年2月4日70 動 脈 硬 化 Vol.29 No.3 2002
4) ELISA法 に よ る 酸 化Lp(a)お よ びLp(a)の 測 定 96ウ エ ル プ レ ー トに 抗 酸 化Lp(a)モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (161E2)を 固 相 化 し て 検 体 を 反 応 さ せ た の ち, パ ー オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 抗 体(161E2)に よ り検 出 し た. 検 体 は 希 釈 液 に て100倍 に 希 釈 し て 測 定 した. 酸 化Lp(a)値 は モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 作 製 に 使 用 し たBSA-ペ プ チ ド(16ペ プ チ ド/ BSAl分 子 に 結 合:ペ プ チ ド は ペ プ チ ド合 成 機 に て 合 成 し, HPLCに て98%以 上 ま で 精 製 を 行 い 用 い た.)を 標 準 物 質 に 用 い て エ ピ トー プ の 数 をnmol/Lで 表 示 し た. 検 量 線 は0.345nmol/Lの 濃 度 の エ ピ トー プ が あ るBSA-ペ プ チ ド を検 体 希 釈 液 に て3段 階 に 希 釈 後, 検 体 同 様100倍 に 希 釈 し て 作 製 し た. Lp(a)のELISA法 は 山 田 ら21)の 方 法 に よ り, Lp(a)標 準 血 清(第 一 化 学)を 使 用 し て 測 定 し た. 5) 免 疫 組 織 染 色 73歳 男 性 の 冠 動 脈 部 検 を ホ ル マ リ ン 固 定 し, 抗ApoBポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体(International Enzyme), 抗Lp(a)ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体(International Enzyme), 抗 酸 化Lp(a)モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体(161E2)を 使 用 して 免 疫 染 色 を 行 っ た.
6) そ の 他
National Center for Biotechnology Informationの デ ー タ ベ ー ス を 使 用 し てhomology analysisを 行 っ た. 測 定 値 は mean±SEで 表 し た. 血 圧 と他 の パ ラ メ ー タ ー と の 統 計 的 解 析 は 多 変 量 解 析 に よ り行 い, P<0.05を 有 意 と し た. II. 結 果 1) 抗 酸 化Lp(a)モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体(161E2)の 反 応 性 161E2は, 新 鮮 な 血 清 か ら精 製 したLDL, plasminogen, Lp(a)と は反 応 しな か っ た. し か し, Cuに よ り酸 化 さ れ た Lp(a)に 対 し て 反 応 し た(Fig. 1). ま たLp(a)を, 高 濃 度 の グ ル コ ー ス処 理, 凍 結 融 解 の 繰 り返 し, 短 期 間 保 存(室 温 あ る い は37℃ で6日 間)し て も, そ して 塩 化 第 二 銅 に て 酸 化 し た 酸 化LDLと も161E2は 反 応 を 示 さ な か っ た(data not shown). また, 9残 基(Arg-Asn-Pro-Asp-Ala-Val-Ala-Ala-Pro)の ペ プ チ ド抗 原 は, 抗Lp(a)ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体(International Enzyme)と 反 応 し な か っ た(data not shown), 2) 161E2の 酸 化Lp(a)に 対 す る 反 応 性 Cuに よ る 酸 化Lp(a)を 過 酸 化 脂 質 を 測 定 す る と と も に, ア ガ ロ ー ス 電 気 泳 動 し て161E2を 反 応 さ せ た と こ ろ, 電 気 泳 動 の 易 動 度 の 増 加 と 共 にLp(a)中 の 過 酸 化 脂 質 の 増 加, 酸 化Lp(a)量 を 示 す 吸 光 度 の 増 加 が 認 め ら れ た (Fig. 2). ま た, Lp(a)を リポ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ に よ り酵 素 酸 化 し て も同 様 の 結 果 が 得 ら れ た(Fig. 3). 3) 酸 化Lp(a)測 定 法 の 性 能 同 時 再 現 性 は2濃 度 の 酸 化Lp(a)含 有 血 清 で そ れ ぞ れ 4.5%と1.5%で し た. ま た 日 差 再 現 性 に 関 し て は 同 様 に2
Fig. 1 Immunoreactivity of monoclonal antibodies to plasminogen (PLG), LDL, Lp(a):typical example of Western blot after agarose gel electrophoresis. Lanes 1 to 3, Human purified plasminogen LDL, and Lp(a). Lanes 4 to 11, Native Lp(a) in serum (>83nmol/L). Lane
12, oxidized Lp(a). Lane 1, Reacted with anti-plasminogen polyclonal antibody. Lane 2, Reacted with anti-ApoB pol:antibody. Lane 3, Reacted with anti-Lp(a) polyclonal antibody. Lane 12, Reacted with anti-oxidized Lp(a) antibody (161E2).
濃 度 の酸 化Lp(a)含 有 血 清 で7.2%と5.0%で した. 添 加 回 収 試 験 は95%か ら108%の 範 囲 で した. 又 測 定 法 の 検 量 線 をFig. 4に 示 す. 4) ELISA法 に よ る高血 圧 患者 の 血 清 中 の酸 化Lp(a) 次 に正 常 血 圧 患 者 と未 治 療 の本 態 性 高 血 圧 患 者 の 血 清 中 のLp(a)値 と酸 化Lp(a)値 を測 定 し た. 血 圧 と血 清 Lp(a)値 との間 に関 連 性 を見 出せ なか った の に対 して, 酸 化Lp(a)と 血 圧 との 間 に有 意 な 相 関 性 を認 めた(P<0.05, 7=0.13). また, WHOの ガ イ ドライ ン10)に従 っ て高 血 圧 患 者 を 合 併 症 を 有 す る群 と な い 群WHO(I)とWHO
(II/III)と に分 けて, 血 清 のLp(a)値 と酸 化Lp(a)値 の比
較 を行 った. 正 常 血 圧 患 者 と高血 圧 患 者 の比較 で は, 合 併 症 が 有 無 に関 わ らず, 血 清Lp(a)値 に差 を認 め な か っ た. しか し, 合 併 症 を伴 う高血 圧 患 者(WHO(II/III))の 血 清 酸 化Lp(a)値 は合 併 症 を伴 わ な い高 血 圧 患 者(WHO(I)) に比 較 して 有意 に高 値 で あ った(P<0.01). また, 合 併 症 を伴 わ な い高 血 圧 患 者 の 血 清 酸 化Lp(a)濃 度 は正 常 血 圧 者 よ り有 意差 は な か った が 高値 傾 向 を示 した. (Fig. 5). 1. 酸化Lp(a)の 組 織 沈 着 Lp(a)は 容 易 に血 管 壁 を透 過 して, 動 脈 硬 化部 位 に蓄 積 す る と言 わ れ て い る22,23). そ こで 我 々 は血 管 壁 にお け る酸 化Lp(a)の 存 在 を検 討 した. ApoBとLp(a)は 隆起 した 初 期 病 変 の 浅 層部 と壊 死 中心 部 に同様 に分 布 して い た の に対 して, 酸 化Lp(a)は 浅 層 部 に高 度 に限局 して いた(Fig. 6). 2. homology analysis
National Center for Biotechnology Informationの デ ー タ ベ ー ス を 使 用 し て, 9残
基(Arg-Asn-Pro-Asp-Ala-Val-Ala-Ala-Pro)のhomology analysisを 行 っ た と こ ろ, ヒ ト α2A-adrenergic receptorの 細 胞 内 の 第3ル ー プ 部 分 と88%の ホ モ ロ ジ ー が 認 め ら れ た(Fig. 7).
Fig. 2 (a) Formation of TBARS as a parameter of degree of CuCl2-induced lipid peroxidation. (b) Reactivity of 161E2 monoclonal antibody in ELISA with CuCl2-induced oxidized Lp(a) as antigen. MDA indicates malondialdehyde. (c) Agarose gel electrophoresis of Lp(a) oxid-ized by CuCl2:staining with fat red 7B with agarose gel electrophoresis. Lane 1, Native Lp(a). Lane 2 to 9, Lp(a) treated with CuCl2 (0.1-10ug/ml). III. 考 察 酸 化Lp(a)は, nativeなLp(a)と は 異 な っ た メ カ ニ ズ ム で 動 脈 硬 化 に 関 わ る 可 能 性 が 指 摘 さ れ て い る も の の, これ ま で 酸 化Lp(a)の 測 定 は 容 易 で は な か っ た. 我 々 はLp(a) に は反 応 せ ず, 酸 化Lp(a)に 特 異 的 に 反 応 す る抗 体 に 注 目 し て, 酸 化Lp(a)を 特 異 的 に 調 べ る 新 し いELISA法 を 開 発 し た. この 酸 化Lp(a)測 定 法 は い くつ か 特 徴 を持 っ て い る. そ れ は 1) 現 在 言 わ れ て い る 酸 化LDL測 定 法 は 酸 化Lp(a)も 測 り こ む こ とが 推 測 さ れ る が, こ の 酸 化Lp(a)測 定 法 は
Fig. 3 Picture, Agarose gel electrophoresis of Lp(a) oxidized by lipoxygenase:staining fat red 7B with agarose gel electrophoresis:Lane 1, native Lp(a). Lanes 2 to 5, Lipoxygenase (1.0, 3.0, 5.0, 20.0ug/ml). Graph, ELISA of oxidized Lp(a) induced by lipoxygenase as antigen.
Fig. 4 Standard curve of enzyme linked immunoassay for oxidized Lp(a) Does-response line obtained with the BSA-peptide (sixteen peptides per one molecule of BSA) 抗 体 がLp(a)のapo(a)の 酸 化 変 性 を受 け た部 分 を認 識 す るた め酸 化LDLを 測 り込 む こ とな しに 特 異 的 に 酸 化Lp(a)の み を測 定 で き る. 2) 酸 化LDLは ス タ ンダ ー ドに大 きな課 題 が あ るの に対 して, この測 定 法 は抗 体 の認 識部 位 が 明確 なた め, 比 較
72 動 脈 硬 化 Vol.29 No.3 2002
Fig. 5 Serum oxidized Lp(a) concentrations according WHO stage to in normotensive subjects and hypertensive subjects.
Nor (n=113):normotensive patients;WHO I (n=223):hypertensive without complication on serum Lp(a);WHO II/III (n=63):hyper-tensive with complication on serum Lp(a). HT:hypertension
Fig. 6 Immunohistochemical staining of atheroscler-otic lesion of coronary artery.
Fig. 7 Sequence alignment of human apo(a), human plasminogen, human ƒ¿2A-adrenergic
receptor. The nine pepties of human apoprotein(a) contains 88% amino acid identity to human ƒ¿2A-adrenergic receptor peptide.
的 容 易 に しか も大 量 に ス タ ンダー ドを調製 で き る. な どで あ る. 次 に我 々 は この方 法 に よっ て酸 化Lp(a)の 臨 床 的意 義 に関 して検 討 を行 った. 高 血 圧 発 症 機 序 に お け る酸 化 ス トレス の 減 弱 の 関 わ り が 指摘 され てい る24,25). そ こで, 本 測定 法 を使 用 して, 正 常 血 圧者 と高 血 圧 患 者 血 清 中 の 酸 化Lp(a)濃 度 を測 定 した. その結 果, 血 清 中 酸化Lp(a)濃 度 は高血 圧 患 者 で 高 い傾 向 を示 し, 高 血 圧 患 者 の 中 で も合 併症 を伴 っ て い るケ ー ス で さ らに高 値 で あ った. 酸 化Lp(a)に よ る内皮 細 胞 由来 の血 管 の 拡 張 阻 害 作 用7,26), 血 管 内皮 細 胞 で のPAI-1の 産 生 増 加5,6)が, 高 血 圧 症 の 成 因 の 一 つ で あ る可 能 性 が 示 唆 さ れ る. 酸 化Lp(a)は, 内皮 細 胞 に対 す る単球 の接 着 の トリガ ー と な り動 脈 硬 化 を 進 展 さ せ る 可 能 性 が あ る27). そ こ で, 血 管 壁 に お け る 酸 化Lp(a)の 存 在 の 可 能 性 を調 べ る 目 的 で, 各 種 抗 体 を 用 い て 冠 動 脈 硬 化 部 位 を 免 疫 染 色 し た. apoBと Lp(a)の 分 布 が オ ー バ ー ラ ッ プ し た の に 対 し て, 酸 化 Lp(a)は 浅 層 部 に非 常 に 限 局 して 認 め ら れ た. こ の こ と は, 酸 化Lp(a)がin vivoで も存 在 し, 動 脈 硬 化 の 進 展 に 関 与 す る 可 能 性 を 示 唆 し て い る. ま た 酸 化Lp(a)が 存 在 す る部 分 は 抗ApoBポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 で の 染 色 が 認 め ら れ な い こ と が 多 か っ た. これ はLp(a)の 構 造 がLDLとapo(a) か ら な っ て い る こ と を 考 え る と 非 常 に 興 味 あ る 知 見 で あ る. こ の 解 釈 に は2通 り考 え ら れ る. ま ず 実 際 にapo(a)単 独 と し て 存 在 す る と い う こ と, も う ひ と つ はLDL部 分 が 構 造 変 化 を 起 こ し て 抗apoBポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 が 認 識 で
Fig. 8 Amino acide sequence and proposed membrane topography of human ƒ¿2A-adrenergic receptor (S.B. Liggett et al. 1992)
き な い 状 態 に な っ て い る. 後 者 の 場 合 に は 酸 化 と は 限 ら な い がLp(a)が 何 ら か の 構 造 変 化 を 起 こ し て い る 状 態 で 蓄 積 し て い る こ と を示 唆 し て い る証 拠 に な る と考 え る.
homology analysisで は161E2の 対 応 ペ プ チ ドが, α2A-adrenergic receptorの 細 胞 質 内domainの 一 部 と88%の 相 同 性 を も っ て い る こ と を 示 し た. ヒ ト α2A-adrenergic rece-ptorは α2受 容 体 の3種 類(α2A, α2B, α2C)の サ ブ タ イ プ の ひ と つ でG蛋 白 に 結 合 す る 受 容 体 に 共 通 す る 膜7回 貫 通 型 受 容 体 で あ る28). 各 サ ブ タ イ プ ご と に 存 在 す る 組 織, 機 能 に つ い て は ま だ 不 明 な 点 が 多 い が, α2受 容 体 と し て 血 管 平 滑 筋 の 収 縮, 血 小 板 の 凝 集, 血 管 内 皮 に お け る 血 管 拡 張 物 質(NO)の 遊 離, 腎 に お け る レ ニ ン遊 離 抑 制 に 関 連 す る と 言 わ れ て い る. 今 回 の ホ モ ロ ジ ー の 高 い 部 分 はFig. 8の 点 線 で 囲 つ た 部 分 で あ る が, 細 胞 内 の 第3ル ー プ に存 在 す る. 第3ル ー プ はG蛋 白 と の 結 合 に 関 連 が あ る と言 わ れ て お り, 今 回 の 部 分 がG蛋 白 の 結 合 に 関 連 が あ る か は 不 明 で あ る が 一 連 の シ グ ナ ル 伝 達 を 酸 化Lp(a)が 競 合 的 に 遮 断 す る こ と に よ り 内 皮 細 胞 か ら のNOの 遊 離 を 抑 制 す る の で は な い か と推 測 して い る28). 今 後 酸 化Lp(a)が ど の よ う な メ カ ニ ズ ム で 発 生 し, ど の よ うに血 管 壁 に蓄積 す るの か又 血 液 中か らの 異化 過 程 は ど の よ うに な って い るの かLp(a)ト ラ ン ス ジ ェニ ック マ ウ ス な どを使 用 して, さ ら に詳 細 に検 討 した い と考 え て い る. 文 献
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Summary
Evaluation of the presence of oxidized lipoprotein(a) in the serum of hypertensive patients
Shingo YAMADA1,
Ryuichi MORISHITA2,
Shigefumi NAKAMURA3,
Toshio OGIHARA3,
Yoshimitu KUSUMI4,
Isamu SAKURAI4,
Nobuhiko KUBO5,
and Ikunosuke SAKURABASHI6
1Central Institute, Shino-test Corporation, Japan
2Department of Geriatric Medicine
, Osaka University Medical School, Suita, Japan
3 Department of Osaka University Medical School, Suita, Japan
4Department of Pathology, Nihon University Medical School, Japan
5 Department of Clinical Laboratories, Jichi Medical School, Japan
6Department of Clinical Laboratories, Ohmiya Medical Center, Jichi Medical School, Japan
In an attempt to assay native Lp(a), the anti-Lp(a) monoclonal antibody (161E2) was produced against synthetic antigen (Arg-Asn-Pro-Asp-Val-Ala-Pro). Characteristic properties of this 161E2 monoclonal anti-body were identified to have reactivity to oxidative modification (treatment with CuCl2 and lipoxygenase), but to neither LDL, plasminogen nor native Lp(a). We developed a new ELISA method to measure Lp(a) modified by oxidative stress using this 161E2 monoclonal antibody as the capture and the labelled antibody, and conducted assay of the epitope in serum using BSA-peptide (16 BSA-peptides perl molecule of BSA) as the stan-dard. Interestingly, hypertensive patients with
compli-cations showed a significantly higher level of oxidized Lp(a) in serum than did normotensive subjects (p<0.01), whereas there was no significant difference in native Lp(a) between normotensive and hypertensive subjects. The in vivo presence of the epitope was also confirmed with use of 161E2 monoclonal antibody-based immuno-staining of arteriosclerotic tissue layer by positive response. Upon analyzing peptide homology of the epitope, it was shown to have high homology (88%) to the cytoplasmic domain of human ƒ¿2A-adrenergic rece-ptor.
Key words:Oxidized lipoprotein(a), Monoclonal antibody, Immunoassay, Atherosclerosis, Hypertension
