ステロイド性抗炎症薬によるMAPキナーゼ活性化抑
制とサイトカイン産生抑制について
著者
平澤 典保
ステロイド性抗炎症轟によるMAPキナーゼ活性化抑制と
サイトカイン産生抑制について
(09672211)
平成9年度∼平成1 0年度科学研究費補助金(基盤研究(C) (2))研究成果報告書
平成1 1年3月
研究代表寺 平葦典保
(東北大学薬学部 助教授)
【はしがき】
この研究報告書は､文部省科学研究費補助金(基盤研究(C)(2))の交付を受けて､平成
9年度から平成1 0年度まで2年間にわたって行われた｢ステロイド性抗炎症薬による
MAPキナーゼ活性化抑制とサイトカイン産生抑制について｣の研究成果について､本研
究を計画するに至った経緯を含めてまとめたものである｡
【研究組織】
研究代表者 平弄典保(東北大学薬学部 助教授)
研究分担者 大内和雄(東北大学薬学部 教授)
･【研究経費】
平成 9年度 2, 000千円
平成1 0年度 700千円
計 2, 700千円
【研究発表】
(1)原著論文
(1) Hirasawa, N. , Sato, Y., Fujita, Y., …ue, S. and Ohuchi, K･
Jnhibition by Dexamethasone of Antigen-induced c-Jun N-terminal
Kinase Activation in Rat BasophiJic Leukemia Cells
Journal of lmmunology 161: 493914943 (1998)
(2)総説
■(1)平幕典保､大内和雄
マスト細胞におけるMAP kinaseの制御機構
アレルギー科5: 356-362(1998)
(2)平幕典保､大内和雄
各種ステロイド薬の抗炎症･抗アレルギー作用
アレルギー･免疫 6:37-43(1998)
(3)口頭発表
(1)平薯典保､藤田優子､佐藤由佳子､無江幸次､大内和雄
第7 1回日本薬理学会年会(1998年3月)
(2)平葦典保､佐藤由佳子､大内和雄
第7 1回日本生化学会大会(1998年10月)
(3)平淳典保､大内和雄､影近弘之､首藤紘一
日本薬学会第1 1 9年会(1999年3月､発表予定)
(4)平幕典保､大内和並
第2 0回日本炎症学会(1999年7月､発表予定)
1-1.研究の背景
ステロイド性抗炎症薬は､種々の炎症性疾患において強力な抗炎症作用を発揮する
が､重篤な副作用を発現することもある｡そのためステロイド性抗炎症薬の抗炎症作用機
序の解明は薬学におけるひとつの重要課題であった｡ステロイド性抗炎症薬はグルココル
チコイド受容体(GR)に結合し､ある種の機能蛋白質の誘導作用あるいは誘導抑制作用を
示す｡その機序として､ステロイド性抗炎症薬とGRの複合体がDNAのg山co-corticoid responsive eJement (GRE)に結合して抗炎症性蛋白質を誘導すること､ま
た､ ne9ative GREに結合して､あるいは種々の転写因子と結合してその作用を抑制する
ことにより､炎症反応の誘発や進展に関与する機能蛋白質の発現を抑制することが示唆さ
れている｡このような機能蛋白質として､種々のサイトカイン､ケモカイン､接着分子､
シクロオキシゲナーゼ- 2､ホスホリパーゼA2や誘導型NO合成酵素などがあり､これ
らの機能蛋白質の誘導抑制がステロイド性抗炎症薬の抗炎症作用の中心的機序であると考
えられている(1)｡
一方､筆者らは､ステロイド性抗炎症薬は酵素誘導を介さない反応､すなわち刺激直後
のアラキドン酸遊離も抑制することに注目し､その様序について解析したところ､細胞質
型ホスホリ/i-ゼA 2の活性化に大きく関与しているp42/44 MAP kinase
(ExtraceHuar sjgnal-regulated kinase, ERK)の活性化を抑制することを明らかにし
た(2)｡一方､ステロイド性抗炎症薬とGRの複合体が相互作用しそのDNA結合を抑制
する転写因子としてAP-1が報告されている(3-5)が､ AP-1のDNA結合抑制作用だ
けではステロイド性抗炎症薬のサイトカイン産生抑制機序を説明できないことも指摘され
ている｡そこで本研究は､ MAPキナ-ゼフ7ミリーすなわちERK､ p38 MAPkinase
(p38 MAPK)､およびC-Jun N-terminal kinase (JNK)が種々の転写因子の活性化に
も関与していることに注目し､ステロイド性抗炎症薬のサイトカイン抑制機序として､
MAPキナ-ゼの活性化抑制作用があるかどうか解析した｡また､ MAPキナーゼの活性
化を抑制する薬物が真にサイトカインの産生を抑制するかどうかについて解析し.ステロ
イド性抗炎症薬の作用と比較した｡最後にステロイド性抗炎症薬のERK活性化抑制作用
2.実験方法
2-1材料
ラット肥満細胞株RBL-ZH3はDr. MjchaeJA. Beaven (NJH, U.S.A.)から､また､
Am80, Re80, HX600およびLE5J40は首藤教凄(東京大学大学院薬学研究科)から供
与された｡ Dexamethasone (Sigma Chemical Co., U.S.A.), wortmanninおよび
LY294002 (BiomoJ Research Laboratory, U.S.A.). PD98059 (New England
BJ'oJabs, U.S.A.) , SB203580 (CaJbiochem-Novabiochem Co., U.S.A.).
AntJ'-C-JuP.. anti-JNK､ antJ'-P38､およびanti-MEKKl (Santa Cruz Biotechnology,
U.S.A.)､ antトphospho-p38, anti-phospho-ATF-2およびantトphospho-C-Jun
(New England Biolabs, U.S.A.), GST-C-Jun (Stratagene, U.S.A.). GST-MEK-1
(Upstate BiotechnoJogy Jnc" U.S.A.), GJuthathione-Sepharose (Pharmacja
Biotech, Sweden)､ 32P-ATP (DuPont/MEN, U.S.A.)およびルー4 ELISA kit
(BioSource JnternationaJ, U.S.A.)はそれぞれ鹿入した｡
2-2 RBL-ZH3細胞の培養と刺激
RBL-2H3細胞5x l05 ceJIsを12weH-cJusterdishの各weJJに加え､ 10%
■FBS及びIgE (DNP特異的JgE産生ハイブリドーマ培養上清) 5LLr/mJ存在下で一晩培
養した｡ PJPES護衛液(25 mMPJPES, pH7.2, 119 mMNaCl, 5 mMKCI, 5.6mM
glucose, 0.4 mM MgCJ2, 1 mM CaCl2, 1%(W/V)
BSA)で2回洗浄後､抗原DNP-HSA 50 ng/mIを含むPJPES緩衝液中で一定時間培養した｡
2-3 キナーゼ活性の測定
JNK活性の測定はChenらの方法(6)に従って､ GST-C-Jun-conjugated
Sepharoseを用いたpulトdown法で測定した｡また､ MEKK-1活性は､ MEKK-1を免′
疫沈降し､ GST-MEK-1を基質としてキナーゼアツセイを行った｡ SDS-PAGEで分画
し､ GST-C-JunおよびGST-MEK-1のリン酸化をautoradjographyで検出した｡
ー3-2-4 イムノプロット
ー定時間 刺激した後･培養液上着を除き､氷冷したPBSで3回洗浄したのち､ Jysis
buffer (25 mM Tris, pH 7.5, 25 mM NaCt, 0.1 mM Na3VO4, 2 mM EGTA, 1
mM DIT, 1 mM p-nitrophenylノphosphate, 20 jig/mHeupeptin) 75FLLを各
wellに加えて細胞を回収した｡ 18,600xgで20分間遠心後､遠心上清をとり､
SDS-PAGEによりce= Jysate中の蛋白質を分画した｡ニトロセルロース膜にセミドライブ
ロッテイング法により蛋白質をトランスファーし､各種抗体を用いてイムノプロットを
行った｡
核内転写因子C-JunおよびATF-2をイムノプロットする場合には､ Iysis buffer 60
plを加えて細胞を回収し､さらに3xsampJe bufferを30 FLJ加えて核内蛋白質を含
むcell lysateを調製した｡
2-5 1L-4の測定
RBL-2日3細胞(5 x105 ce一一s)を上述のようにIgEで感作したのち､ 5%(V/V) FBS
を含むE'MEMで3回洗浄後､ 5%(V′V) FBSおよび抗原DNP-HSA (最終濃度50
ng′ml)を含むE'MEMを200山加え･ 4時間培養した｡嘩液上着を回収して､遠心
(220xg, 5min,4℃)し､その遠心上着0.1
mJをIL-4ELISAキット(sensi-tivity <15 pg/ml)の測定用ウェルに加え､ lL4量をプロトコールに従って測定し
た｡
2-6 RT-PCRによるmRNAの測定
RBL-ZH3細胞(Zx106 cefJs)を上述のように抗原で刺激し､ 2時間後にmRNAを
acid guanidinium-phenoI-chJoroforrn法によLJ抽出し､逆転写したのち､ PCRの
テンプレ-トとした｡ JL14については､プライマーとして､ (former) 5TIACCTTGCT
GTCACCCTGTTCTTGC-3 ■および(reverse) 5 --GTGTGAGCGTGGACTCATTC-3-香
用い､ 94oC l分間､ 58oC1分間､および72oC 2分間を25サイクルのPCRを行っ
(GAPDH)遺伝子についても同様にRT-PCRを行った(7)｡
2-7 細胞膜画分の調製
RBLZH3細胞(Zx106 ce‖S)を抗原で1分間刺激した後､氷冷したPBSで3回洗
浄し､ 200BlJのホモジナイズ用緩衝液(10mMTris, pH7･5, 5 mMMgCJ2, 1 mM
dithiothreitoI, l mM EGTA, 50 mM NaF, 2.5 mM p･nitrophenylphosphate, 1 mM
Na3VO4, 1 0 pg/m‖eupeptjn)を加えて細胞を回収した｡回収した細胞浮遊液は氷上に
1 0分国放置した後､ Dounce homogenizerでホモジナイズした(1 00 strokes)｡
600xgで5分間して未破砕細胞を除いた後､ 105,000xgで30分間遠心して､細
胞膜画分を分離した｡
2-8 薬物処理
Dexamethasoneは､エタノールに溶解し､ E-MEMで希釈し､刺激一定時間前に培養
液に添加した｡ Wortmannin､ LY294002､ SB203580およびPD98059はDMSOに
溶解し､ PIPES貨衝液で希釈し､刺激-定時間前に添加した｡各種レチノイドはエタ
ノールに溶解し､抗原を含むE-MEMに添加した｡それぞれ対照群には､エタノールある
▼いはDMSOを同量加え､最終濃度をいずれも0.1% (∨/V)とした｡
2-9 統計処理
実境結果は平均値±標準誤差値で表し､棄却検定はThompson■s ド-testにより､有
意差検定はStudentTs unpajred I-testにより解析した｡
-5-3.研究成果
3-1ステロイド性抗炎症薬のJNKの活性化抑制作用
3-1-1抗原刺激によるJNKの活性化とC-Junのリン酸化
IgEで感作したRBLZH3細胞を抗原で刺激し､経時的にJNK活性および細胞内
cIJunのリン薮化を解析した｡ Fig. 1に示すように､ JNK活性は抗原刺激後数分以内に
増加し始め､･
40分で最大となった｡また､細胞内C-Junのリン酸化をphospho-C-Jun抗体を用いて解析したところ､ C-Junのリン酸化もJNKの活性化に伴い経時的に
増加した｡
A
JNK Activity Phc6Phorybtion of c･Junら
6 5 4 3 クー1 0 0SeaJ3ulPl○山Fi9tLre 1. Tine course of
0 1 2 510204060 Incubation Tirne (rnin)
- GSTIC-.ILJn (1･79)
1 PhosphM･JLJn (Ser73)
JNKActivityPhos"tionof
C-JLn 0 10 20 40 601ncubation Time (min)
the antigen-induced JNR activation and
C-Jun phosphorylation ･
(A) ZgE-Sensiti2;ed cells were stimulated by the antigen DNP-ESA (50 ng/ml)
for the indicated period of tine. The cell lysates were prepared and JⅣK was
pulled down with GST-C-Jun1-79･ Detemination of JNR activity was carried out as
described in .一光aterials and Hethods". Zn a corresponding Set Of cultures, thephosphorylated c-Jun at Ser 73 in the cell lysate was detected by
iznnunoblotting. (a) The fold-increase in J打R activity and the content of
phosphorylated c-Jun in the cells were detemined by densitonetric analysis･
3-1-2 JNKの活性化とC-Junのリン酸化に対するdexamethasoneの効果
RBL-2日3細胞をステロイド性抗炎症薬dexamethasone (1 , 10および100 nM)で
あらかじめ18時間処理した後､抗原で刺激すると､抗原刺激40分後のJNK活性の上
昇は濃度依存的に抑制された(FigJ. ZA)｡このとき､ JNKの蛋白質童の部分的に低下が
認められた｡また､抗原刺激による細胞内のC-Junのリン酸化の増大も
dexamethasoneの濃度に依存して抑制され､ JNK活性の低下とよく一致した(Figs.
ZB and ZC)｡ また､ dexamethasoneのJNK活性化の抑制作用の発現にどの程度の
前処理時間を必要とするかについて解析した｡その結果､ dexamethasoneを抗原と同
時､あるいは3時間前に添加した場合には抑制作用が認められなかったが､ 6時間以上
の前処理により､前処理時間に依存して抑制作用を発現した(Fig. 3)｡
3-1-3 JNKキナ-ゼキナーゼMEKK-1の活性化に対するdexamethasoneの効果
DexamethasoneのJNK活性化抑制機構を明らかにするために､ JNKキナーゼキナーゼ
であるMEKK-1の活性化に対する効果を検討した｡抗原刺激後､ MEKK-1を免疫沈降
し､その手ナーゼ活性をGST-MEK-1を用いて解析したところ､ dexamethasoneは抗
■原刺激によるMEKK-1の活性増大を濃度依存的に抑制した(Fig. 4)｡
ー7-JNK Activity JNK =二二ヨE≡コ Ehthasme(nN) 0 0 1 10 100 DNトHSA (50 ng/ml) 御ticn of c-JIM c-JLm Ek治methaSOne(nN) 0 0 1 10 100
150
￡ 100 1= 0 U -0 50 -◆ 0 DNP-HSA (50 n9/ml)- JbK ActMty
JD Ry6Fhorybtim Of c-JLJl
EコJPK FheirI DexarTlethasone (nM) 0 0 1 10 100 DNP-HSA (50 n9/ml)- GST<･Jun (1-79)
'■■Fi9tLre 2 ･ Effects of various concentrations of dexa皿ethasone on the
anti9en-induced JⅣR activation and c-Jun phosphorylation.
RZIL-2E3 cells were incubated at 370C for 18 h in the presence of 工gE and
the indicated concentrations of dexamethasone. The cells were then stimulated by the antigen D肝-ESA (50 ng/ml) for 40 min. (A) JNR activity was detemined as described in the legend to Fig. 1. The content of JNR protein Was detemined
by iznnunoblotting. (a) The levels of phosphorylated c-Jun at Ser 73 and c-Jun
were deter7nined by iznnunoblotting･ (C) m activity and the content of the
phosphorylated cIJun and JⅣR protein were detemined by densitonetric analysis ･
o o 0 0 0 O 0 2 0 8 6 4 2 ｢lr lいLL (一〇JIuOU-〇%) ^)!^!)uvゞNr _.● ■■一■ 0 3 6 18
Preincubation Time (h)
Fi9tLre 3. Tine course of the inhibition of JNR activation by dexanethasone･ RBL-2E3 cells were incubated at 370C for 18 h in medium containing zgE. Dexa皿ethasone was added to the mediun 0, 12, or 15 h after the beginning of the incubation at a final concentration of 100 nX. The cells were then washed twice and st血Iated by the antigen DNP-ESA (50 ng/皿1) for 40 Ⅱ止n in the absence of
dexa皿ethasone. JyR activity was detemined as described in the legend to Fig･
1. The density of JNR activity in the antigen-stimulated cells without
pretreat皿ent With dexazbethasone is set to lOO %･ A Closed circle represents the level of JⅣR activity in the non-Stinulated cells. The results were confirmed
by the tⅥ) independent experiments･
A) 2 1 (oseaJuulP10j) Ftyt!13<L･nj三 暮 Dexamethasone(nM) 0 0 1 10 100 DNP-HSA (50 ∩9/ml) Dexamethasone (nM) 0 0 1 10 100
DNP-HSA (50 ng/mJ)
Fi9tLre 4. Effects of dexamethasone on the activation of HERR-1･
RZnl2E3 cells were incubated at 370C for le h in the presence of 工gE and the indicated concentrations of dexa皿ethasone. The cells were then stiJnulated
by the antigen vith DNP-ZISA (50 n9/ml) in the absence of dexamethasone. (A)
XERR-1 activity 20 凪in after the antigen stimulation was determined as described
in 什Haterials and Hethods一一. ℡he fold-increase in HERR-1 activity was detemined by densitonetric analysis. The vertical bars represent S.E.光. of 3 experizBentS. Statistical significance= *p<0.01 vs･ the antigen control･ (B) The content of
HERR-1 protein 20 nin after the antigen stimulation was detemined by
iznnunoblotting. The results were confined by the three independent
experiments.-9-3-2 MAP kinase活性化抑制薬のルー4産生抑制作用
3-211 RBL-ZH3細胞における抗原刺激によるfL-4産生先進
RBL-ZH3細胞が抗原刺激により産生するサイトカインのひとつとして､ JL4に注目
した｡ fgEで感作したRBL-ZH3細胞を抗原で刺激すると､培養液中のlL-4量はl時
間後から増加し､ 4時間で最大となった(Fig. 5B)｡またこのとき､ JL-4mRNAレベル
をRT-PCR革で解析したところ､抗原刺激2時間を最大として増加することが明らかに
なった(Fig. SA)｡なお､抗原で刺激しない場合には､培養液中にlL4はほとんど検出
されなかった｡
A) lL4mRNA-GAPDH mRNA
0 0 0 0 42(luJ6d)bql
0a
0 0.5 1 2 3 4 8Time (h)
0 1 2 4 8Tjme(h)
Figtlre 5･ Tine course of ZL-4 mRm levels and ZL14 production in the
antigen-stiAulated RBI.-2ZI3 ce11S.
ZgE-sensiti2;ed RBL-2ZI3 cells (1 Ⅹ 106 cells (A) or 2 Ⅹ 105 cells (B日were
stimulated with DNP-ESA (50 ng/ml) for the periods indicated. (A) Total RNA was
extracted and the levels of mRHA for工L-4 and GApDE were detected by RT-PCR as described in ''ぬterials and旗ethods". (a) The concentrations of rI.-4 in theconditioned zDedium were detemined by ELZSA･ Closed squares indicate ZI.-4
Concentrations in the conditioned nediun of unstinulated cells. Vertical bars represent S･E･祇･ from 4 wells･ The results were confirmed by two additionalindependent experiments.
3-2-2 PhosphatidyJinositoJ 3-kinase阻害薬wortmanninのMAP kinase活性
化に対する作用
AP-1など種々の転写園子を活性化するMAP kinaseの活性化に対する
phosphatidylinositoJ 3-kinase租害薬wortmanninの効果について解析した｡抗原
刺激によりERK､ p38MAPK およびJNKは､それぞれ､ 2分(Fi9･6A)､ 20分(Fig･
7A)および40分(Fig. 1)を最大として活性化する｡ Wortmanninで10分間前処理し
た後､抗原で刺激すると､ ERKの活性化はほとんど抑制されなかった(Fi9. 6B)が､
p38 MAPKのリン酎ヒおよび活性化(Figs. 7Bおよび7C) I.およびJNKの活性化
(Fig. 8)は濃度依存的に抑制された｡
A)
ERK
一一■ -`一一一i'l一品▲i-i-0 1 2 5 102040 60
Time (min)
B) UpperBand(%) (7) (54) (52) (50) (43) Wortmannin(nM) 0 0 10 30 100DNP-HSA (50 ng/ml)
=∠ &EERRKK -ど &EERRKKFi9tlre 6･ Antigen-induced activation of ERR and effects of wortnannin･
(A) ZgEーSenSiti2:ed RBLl2ZI3 cells (5 Ⅹ 105 cells) were stimulated with
DyP-zISA (50 ng/ml) for the periods indicated･ (a) The cells were preincubated for
10 nin in the presence of the indicated concentrations of wortnannin, then
stimulated with DNP-ESA (50 ng/nl) for 2 nin in the continued presence of
wortnannin. proteins in the cell 1ysate were separated by electrophoresis on an′
8% SDS-PAGE gel and ERR vas iznnunoblotted. Phosphorylated ERR ( P -ERR) and
unphosphorylated ERR (ERR) are indicated. The numbers in parentheses in panel B
indicate the proportion of the phosphorylated ERR as detemined by densitometric
analysis. The results were confirzned by two additional independent experiAentS･
-A)
C)
phospho-p38 MAPK
p38 MAPK
Fold lncreasephospho-p38 MAPK
p38 MAPK
Wortmannin (nM)
.0 1 八ast2OJOuLP一Oj) A)!^!IDVyldVVqBCd 0 2 10 20 40 601ncubation Time (min)
(1.0) (7.0) (3.2) (0･8)
0 0 10 100
DNP-HSA (50 ng/ml)
wortmannin(nM) 0 0 10 1010
DNP-HSA (50 ng/ml)
Figtlre 7 ･ Antigen-induced activation of p38比ApR and effects of wortmannin. (A) ZgE-sensiti2:ed RBL-2Ⅱ3 cells (5 Ⅹ 105 cells) were stimulated with DNPI ESA (50 ng/ml) for the periods indicated･ (a) ZgE-Sensiti2:ed RBI･-2ヱ3 cells (5 Ⅹ 105 cells) Were preincubated for 10 凪in in the presence of the indicated
concentrations of wortmannin, then stimulated vith DNp-ZISA (50 ng/ml) for 20 nin
in the continued presence of wortnannin･ proteins in the cell lysate were
separated by electrophoresis on an 8% SDSIPAGE gel and p38比APR and phospho-p38HAPR were iznnunoblotted･ The nu血bers in parentheses in panel a indicate the
increase in phospho-p38胞PR as detemined by densitonetric analysis･ The value of the unstinulated control is set to l･0･ (C)工gE-sensiti2:ed RBL-2Ⅱ3 cells (1 Ⅹ 106 cells) Were treated as described in (B), and the p3e HApR activity in the cell lysate was detemined as described in ''J4aterials and Xethods". The
Phosphorylation of ATF-2 was analyzed by autoradiography and a BioiAage
analy2:er･ The value of the unstinulated control is set to 1.0. The results vere
17 100 68 42 39 63
JNK Activity
0 0 10 30 100 100 一■ GST･C-Jun (1-79)･ wortrnannin (nM) LY294002 (llM)DNP-HSA (50 ng/ml)
Figtlre e･ Effects of PZ3-kinase inhibitors on the antigen-induced JⅣR
activation.
ZgE-sensiti2:ed RBL-2ZI3 cells were preincubated at 370C in the presence or
absence of the indicated concentrations of 帆)rtmannin for 10 nin, orエーY294002 for 30 凪in. The cells were then stimulated by the antigen DyP-ESA (50 ng/ml) for 40 Zbin in the presence or absence of the inhibitor畠･ JNR activity wasdeterAined as described in the legend to Fig. 1. The values at the top of each
lane indicate relative JⅣR activity. The JⅣR activity of the cells stimulatedby the antigen Without the inhibitor was expressed as lOO･ The results were
confirned by the two independent experinents･
3-2-3 WortmanninおよびLY294002のlL4産生抑制作用
wortmanninで10分間前処理した後､ wortmannin存在下で抗原で刺激し､ 4時間
後の培養液上着中および細胞内のJL-4豊を測定した｡ Wortmannjnは､培養液上着
中､および細胞内のJL-4をともに濃度依存的に低下させた(Figs. 9Aおよび9B)｡こ
のとき抗原刺激2時間後のIL-4 mRNAレベルの上昇も､同様に抑制された(Fig. 9C)｡
■また､他のPJ3-kjnase阻害薬であるLY294002もwortmanninと同様にlL-4の産
生およびIL-4 mRNAの増大を濃度依存的に抑制した(Fi9. 10)｡
3-2-4 MEK-1阻害薬PD98059､およびp38 MAPK阻害薬SB203580のIL-4産
生抑制作用
MAPキナーゼの活性化抑制が､ lL-4の産生抑制につながるかどうか明らかにするため
に､ ERKの活性化を抑制するPD98059およびp38 MAPKの阻害薬SB203580の効
果について検討した｡ PD98059はERKの活性化を抑制する濃度(Fig 1 lA)で)L-4
産生をむしろ増加させた(Fig. 1 1B) ｡一方､ SB203580はp38 MAPKの活性を抑制す
る濃度(Fig. 12A)で､ IL-4産生を濃度依存的に抑制した(Fig･ 12B)｡このとき､ IL-4
mRNA量も同様に低下した(Fig. 1 2C)｡
13-< 654320 (U 0 0 AU0 0 0 0 0 (lujJ6d)'･1] Wortmannin (nM) 0 0 10 30 100 DNP･HSA (50 ng/mI) (sJlOUsOtJBd)寸･1l 0 0 5 0 JL4 mRNA GAPDHmRNA ≒ 2 ∩) 8 6 4 2 0 1.1.0 0 0 0 0 (HOdV9]寸･1l) VNtJuJf･1) Wortmannin(nM) 0 0 10 30 100 Wortmannin(nM) DNP-HSA (50 ng/ml) ヾ0 0 30 1 00 DN P-H SA (50 ng/m))
Fi9ure 9･ Effects of wortnannin on the antigen-induced ZL-4 production･
=gEISenSitiZ:ed RBI･-2Z13 cells (2 Ⅹ 105 cells (A) and (B) or 1 x 106 cells
(C日 Were treated for 10 min in the presence of the indicated concentrations of wortmannin' then stimulated vith DNP-ELSA (50 ng/皿1) in the continued presence of
wortnannin･ The concentrations of rLl4 in the conditioned nediun (A) and in the
cells (B) at 4 h were detemined by ELZSA･ Vertical bars represent S.E.H. from
4 wells.Two hours after the antigen stiJnulation, total RNA was extracted and the
levels of EiRNA for ZL-4 and GAPDE were detected by RT-PCR as described in
"Materials and J4ethods-I (C)･ The ratio of工L-4 mRNA density to GAPDtl mRKA
density was detemined in three independent experiments and indicated in the
lower pane1･ The density ratio of the antigen-stimulated control is set to 1.0.
Statistical significancer･ *p<0･05r **P<0･01 and **'P<0･001 vs･ the
0 0 0 0 0 0 0 0 ■)43Z (IuJ6d)>･1l A LY294002 (pM) 0 0 1 3 10 30 DNP- HSA (50 n9/mI) (0.0) (1.0) (0.7) (0.6) B) lL-4
払Pm -LY294002 (JIM) 0 0 1 0 30 DNP-HSA (50 n9/mりFi9ure 10. Effects of IJY294002 0n the antigen-induced工L-4 production･
ZgE-Sensiti2:ed RBIJ-2E3 cells (2 Ⅹ 105 cells (A) or 1 x 106 cells (B)) Were
treated for 10 nin in the presence of the indicated concentrations of LY294002, then stimulated With DNP-ESA (50 ng/ml) in the continued presence of LY294002･
The concentrations of ZL-4 in the conditioned nediun at 4 h were detemined by
EI.IBA (A). Vertical bars represent S.E.A. from 4 wells･ Statistical
significance; *P<0.05 and ★★★P<0.001 vs･ the antigen-stimulated control･℡vo holユrS after the antigen stimulation, total RKA Was extracted and the levels of nRNA for ZL-4 and GAPDE were detected by RT-PCR as described in
"Materials and J4ethods" (Zl). ℡he nuzDbers in parentheses in panel a indicate the ratio of ZL-4血Rm density to GApDE血Rm density. The density ratio of the
antigen-stimulated control is set to l･0.
A) Upp'Band(%) (5) (32) (30) (12) m ERK _也.二筋_-三と篭RKK PD98059bM) 0 0 1 3 10 DNP･HSA (50 ng/mt) a) 800 三･ 600 長
S 4..
こi J 200 pD98059 0JM) 0 0 0 1 3 10 DNP-HSA(50ng/mI)Figure ll. Effects of PD98059 0n the antigen-induced ERR activation and 工IJ-4
production.
ZgE-sensitiZ:ed RBL-2ZI3 cells (5 Ⅹ 105 cells (A) or 2 Ⅹ 105 cells (a)) Were
preincubated for 10 Bin in the presence of PD98059 at the indicated
concentrations, then stiJnulated vith DNPIESA (50 ng/ml) for 2 nin (A) or 4 h (a)
in the continued presence of PD98059. (A) ERR activation was detemined as
described in the legend to Fig. 3. ℡he numbers in parentheses indicate theproportion of the phosphorylated ERE ( P -ERR) as detemined by densitometric
analysis. (zl) The concentrations of ZIJ14 in the conditioned nediun at 4 h was
detemined by EIJZSA. Vertical bars represent S.E.H. from 4 we11S. The results were confirmed by two additional independent experiments. Statistical
significance; **P<0.01 and ***P<0.001 vs. the antigen-stimulated control.
ー15-A)
a
.∵≠★ SB203580 UJM) 0 0 1 3DNP-HSA (50 ng/ml)
(luJ6d)fqt
0 0 0 0 8 6 0 0 0 0 4 2 j王と_ 弔｢ 弔｢｢ 弔｢｢ SB203580uJM) 0 0 0.1 0.3 1 3 DNP-HSA (50 ∩9/ml)C'.L-4m｡NA毒毒
GAPDH mRNA
2 0 8 6 4 11000 (H凸dV9[寸･1一) VNtj∈寸･1( 0.20.0
SB203580いM) 0 0 3DNP-HSA
(50 n9/ml)Fi9tLre 12･ Effects of SB203580 0n the antigen-induced activation of p38比ApR and ZIJ-4 production.
(A) ZgE-sensitized RBL-2E3 cells (1 Ⅹ 106 cells) were stimulated with
DNP-ESA (50 ng/ml) for 20 min･ Rinase activities in the anti-p38 HAPZ(
inunoprecipitates from the cell 1ysates were detemined in the presence of the
indicated concentrations of SB203580. (B) ZgE-sensitized cells (2 Ⅹ 105 cells)Were preincubated for 10 nin in the presence of the indicated concentrations of
SZ1203580. then stimulated for 4 h with DyP-ZISA (50 ng/ml) in the continuedpresence of SB203580. The concentrations of ZI.-4 in the conditioned mediun were detemined by EuSA･ Vertical bars represent s.王.H. from 4 wells. The results
were confir7Bed by two additional independent experinents. (C) Two hours after /
the addition of the antigen, total ZuA was extracted and levels of血m for ZL-4 and GAPDZI were detected by RT-PCR as described in ''九aterials and J4ethodsl'. The ratio of ZL-4血Rm density to GAPDE瓜A density was detemined in threeindependent experinentsr and the results are indicated in the lower panel in c･
The density ratio of the st血lated control is set to 1.0. Statisticalslgnificancer･ **p<0･01 and H*p<0･001 vs･ the antigen-stimulated control･ The
3-3 レチノイドのJL-4産生抑制作用
3-3-l Retinoic acid receptor (RAR)選択的レチノイドRe80およびAm80の
IL-4産生抑制作用
レチノイドはRARに結合し､坑AP-1作用を発現する｡そこで､ RAR選択的な合成
レチノイドRe80およびAm80を用いて､ AP-1の活性を抑制したときに抗原刺激によ
るlL4産生がどの程度抑制されるかについて解析した｡その結果､ Re80あるいは
Am80を抗原と同時に添加すると､抗原刺激後4時間後の培養液上着中のIL-4量は濃
度依存的に抑制された(Fig. 13)｡このとき､抗原刺激2時間後のIL4mRNAレベル
も低下していた(Fig. 14)｡
3-3-2 RAR括抗薬LE540の作用
Re80およびAm80の作用がRARを介していることを確認するために､ RAR括抗薬
LE540をこれらのレチノイドと併用した｡ LE540はRe80 100nMあるいはAm80
100 nMによるJL-4産生抑制作用を濃度依存的に抑制した(Fig. 1 5)｡
3-3-3 Retinoic acid X receptor選択的レチノイドの作用
▼
RARを介する反応は､ RXRを刺激することによLJ増強される｡そこT. RXR選択的レ
チノイドであるHX600との協同作用を検討した｡その結果､ 10nMのRe80あるいは
Am80によるIL-4産生抑制作用はHX600によLJ有意に増大した(Fig. 1 6)｡
3-3-4 免疫抑制薬cyclosporin Aの作用
CycJosporin AはcaJcineurinを阻害して､転写国子NF-ATの活性化を抑制する｡
そこで､抗原刺激によるIL-4産生におけるNF-ATの関与を明らかにするために､
cyclosporin A存在下で抗原刺激したところ､ルー4産生は濃度依存的に強く抑制された
(Fi9.17)｡
-
17-0 0 0 0 0 0 432 (luJ6d)'･1] ++ +++ ■■■■●■ ■■■=● ●■● ■●● 〟
duo.b10:ll'l'01do10loo
Concentration (nM)
く> Re80 ● Am80Fi9tlre 13･ Effects of Re80 and Am80 0m the antigen-induced工L-4 production by RBL-2Z13 ce11S.
=gEtSenSiti2;ed RBL-2Ⅱ3 cells (2 Ⅹ 105 cells) were stimulated with DNP-ESA
(50 mg/ml) in the presence or absence of Re80 or Am80･ The concentrations of
ZL_4 in the conditioned nediun at 4 h were detemined by EIJZSA. Vertical bars
represent s･E･H･ from 4 wells･ Statistical significance; *P<0･05, **P<0･01 and
**.p<0.ool vs. the antigen-stimulated control･ The results were confirmed by
tⅥ) additional independent experiments ･
lL-4 mRNA
GAPm1 mRNA
1 0 0 0 0 (HQdV9[寸･1l) <Z∝∈寸-｣一 0 8 6 4 2 (U ■■ ++++ 珪圭;韓 :;:=3;≡.:≡: 0 0 10 100 10 100(nM) Re80 Am80EN-HSA (50 ng/ml )
Figure 14･ Effects of Re80 and Am80 0n the antigen-induced increase in工L-4
mRNA.
ZgE-SenSitiZ:ed RBIJ-2tI3 cells (2 Ⅹ 106 cells) were stimulated With DNP-ESA
(50 ng/ml) in the presence or absence of Re80 or Am80･ Two hours after the
antigen stinulationr total RNA was extracted and the levels of血Rm for工L-4 and GAPDE were detected by RT-PCR as described in一一斑aterials and Hethodsn･ The ratio of =L-4血R封A density to GAPDE mRm density was detemined in three
independent experiments and indicated in the lower panel･ The density ratio of
the antigen-stimulated control is set to l･0･ Statistical significance;'*P<0･01
0 0 0 0 0 0 432 (luJ6d)+Ill ■ 俐緯淫 # ;喜;ぎ……… 8 2x ﾂ 〟 …… …… …… LE540(pM) 0 0 0 1 4 0 1 4 4 Re80 Am80
DNPIHSA (50 ng/ml)
Figure 15. Effects of combination of the EAR antagonist I･E540 vith Re80 and
An80 0n the antigen-induced ZIJ-4 production･
zgE-sensitized RBIJ-2ZI3 cells (2 Ⅹ 105 cells) were Stinulated With DNP-ZISA
(50 ng/ml) in the presence of Re80 or Am80 With or Without LE540･ The
concentrations of rI.-4 in the conditioned medium at 4 h were detemined by
EI.IBA. Vertical bars represent S.E.光. from 4 wells. Statistical signif
icance;***P<0.001 vs. the
antigen-stimulated control. #p<0.05 vs. Re80 or Am80 alone･ N･D･ indicates ''not
detectedp. The results were confined by two additional independentexperiznents.
(luJ6d)>･1l N.D. 2 ﾈ ﾈ ﾂ + 調ｲ # ■● Re80 Am80(10nM) (10nM)
FIX600
魯 Ol▲MEI l pM
DNP-HSA (50 n9/ml)
Fi9ure 16. Effects of combination of the RXR agonist EX600 with Re80 and Am80
0n the antigen-induced ZL-4 production.ZgE-sensiti2:ed RBL-2Z13 cells (2 Ⅹ 105 cells) Were stimulated with DNP-ESA (50 mg/ml) in the presence of Re80 or An80 vith or Without EⅩ600. The
concentrations of ZL-4 in the conditioned nediun at 4 h were detemined by EIJ工SA. Vertical bars represent S.E.H. from 4 wells. Statistical significance;
*P<0･05 and **P<0･01 vs･ the antigen-Stinulated control, #p<0･05 and #p<0･01
vs. Re80 or Am80 alone. N.D. indicates I-not detected'.. The results were
confirmed by two additional independent experiJbentS ･
ー19-0 ー19-0 ー19-0 ー19-0 ー19-0 ー19-0 ー19-0 o 0 0 0 0 0 6 5 4 3 Z 1 (一∈＼6d)寸ql + ∼++
o o 0.010.030.1 0.3
Cyclosporin A (pM)
Figur曹17 ･ Effects of cyclosporin A On the antigen-induced ZL-4 production･ 工gE-senSiti2:ed RBI･-2Z13 cells (2 Ⅹ 105 cells) were stimulated with DNP-ⅡSA
(50 ng/ml) in the presence or absence of cyclosporin A･ The concentrations of
m_4 in the conditioned medium at 4 h were detemined by EIJZSA. Vertical bars
represent s･E･光･ from 4 wells･ Statistical significance; *P<0･05, ***P<0･001
vs. the antigen-stimulated control･ N･D･ indicates mnot detectedl'･ The results
3-4 ステロイド性抗炎症薬のMAP kinase活性化抑制作用機序
3-4-1 MAPキナーゼキナーゼキナーゼRaf-1の細胞膜移行に対するdexamethasone
の効果
DexamethasoneはERKの活性化を抑制し､特にERKキナーゼキナーゼである
Raf-1のリン酸化を抑制することが明らかにしている｡ Raf-1は抗原刺激により低分子
量G蛋白質Rasが活性化されると細胞鹿に移行し､リン酸化されて活性化することが
知られている｡そこで､ dexamethasoneは､ Raf-1の膜移行を抑制しているのか､リ
ン酸化を抑制しているのかを明らかにするために､ dexamethasoneのRaf-1の膜移
行に対する作用について解析した｡抗原で刺激した後､細胞膜画分と細胞質画分に分画
し､それぞれのRaf-1童をウエスタンプロットにより解析したところ､
dexametha-soneはRaf-1の膜移行に対しては抑制作用を示さなかった(Fig. 1 8)｡
0 0 1 10 100
Dexamethasone (nM)
一■ Raf-1DNP-HSA (50 n9/ml)
Figtlre 18. Effects of dexazbethasone on the tranS10cation of Raf-1.
RBIJ-2tI3 cells were incubated at 370C for 18 h in the presence of ZgE and the indicated concentrations of dexaJnethasone. The cells were then stinulated
by the antigen DNP-ESA (50 ng/ml) for 1 nin. The me血brane fraction Was prepared as described in "xaterials and Hethodsl'. Raf-1 in the fraction was
血noblotted.
-4.考察
本研究により､ステロイド性抗炎症薬はMAPキナーゼの活性化を抑制し､特に
AP-1の活性化を抑制すること､そしてこのAP-1活性化抑制作用がサイトカイン産生
抑制作用のひとつの機序であることを明らかにした｡
4-1ステロイド性抗炎症薬のJNKの活性化抑制作用
ステロイド性抗炎症薬は極めて強い抗炎症作用を発現するが､その主な作用機序として
サイ十カインなどの炎症性空自質の合成の抑制が明らかにされている｡その分子機序とし
ては､ステロイド性抗炎症薬とGRの複合体がAP-1と直接結合し､ AP-1のDNA結合
を抑制することが有力視されている(3-5)｡本研究では､ dexamethasoneはJNKの活
性化を抑制することにより､ AP-1の活性化を抑制することを初めて明らかにし､ステロ
イド性抗炎症薬のAP-1活性抑制作用の新しい機序を提唱した(8)｡
AP-1の転写活性の発現には､その構成分子であるC-JunがJNKによりリン酸化さ
れることが重要である(9)｡ IgEで感作されたRBL-ZH3細胞を抗原刺激すると､ JNKの
活性化とC-Junのリン薮化が生じることが確認された(Fig. 1 )｡ Dexamethasoneで
18時間前処理することにより､この抗原刺激によるJNKの活性化が強く抑制されるこ
■とが明らかになった(Fig. 2)｡このときC-Junのリン酸化も抑制されたこと(Fig.2)
から､ステロイド性抗炎症薬によるJNKの活性化抑制作用がAP-1の転写活性抑制のひ
とつの機序であることが示唆された｡
RBL-ZH3細胞における抗原刺激によるJNKの活性化は､ P13-kinaseの活性化により
VaVが活性化され､これが低分子量G蛋白質Racの活性化を引き起こす(10,1 1)こと
により､ MEKK-1の活性化が誘導されると考えられている｡実際､ Fig.8に示すよう
に､ P13-kinaseの阻害薬はJNKの活性化を抑制した｡私たちは､ RBL-2日3細胞を抗
原で刺激すると､チロシンキナーゼLynおよびSykが活性化され､ Vavのテロシンリ′
ン薮化が増大すること(1 2)､さらにdexamethasoneはVavのチロシンリン酸化を抑
制しないこと(2)を明らかにしている｡一方今回､ Vavの下流であり､ JNKキナーゼキ
ナーゼであるMEKK-1の活性化が抑制されることが明らかになった(Fig.4)｡ これら
の結果は後に示すように､ dexamethasoneのERK活性化抑制の作用点がERKキナー
ゼキナーゼであるRaf-1にあることと一致し､ステロイド性抗炎症薬のMAPキナ-ゼ
活性化抑制作用点はMAPKキナーゼキナーゼレベルにあることが想定された｡
AP-1は､単にAP-1依存的な遺伝子発現に関与しているだけでなく､種々のサイト
カインの産生において転写因子NトATの作用を増強することも知られている｡そのひと
つの例としてJL-4がある(13)ので､つぎにRBL-ZH3細胞において､ AP-1の活性化
抑制が､ IL-4産生抑制につながるかどうか解析した｡
4-2 MAP kinase活性化抑制案のルー4産生抑制作用
MAPキナーゼはAP- 1をはじめとする種々の転写国子の活性化に関与している｡肥満
細胞はIL-4 (14)､ IL-6 (15)およびTNトα(16)など種々のサイトカインを産生す
る｡これらの中で､転写制御機構の解析が進んでおり､しかもAP-1の関与が明らかに
されているルー4産生について注目した｡すなわち､ MAPキナーゼの活性化あるいは活
性を抑制する薬物が､抗原刺激によるRBL-2日3細胞からのIL-4の産生を抑制するかど
うか検討した｡ P13-kinase阻害薬は抗原刺激によるERKの活性化はほとんど抑制しな
い(Fig. 6)ものの､ JNKおよびp38MAPKの活性化を強く抑制した(Figs. 7および
8)｡ JNKの活性化を特異的に抑制する薬物はこれまで報告されていないため､
wort-manninの作用を検討し､ ERK活性化阻害薬PD98059およびp38 MAPKの活性阻害
薬SB203580の効果と比較した｡その結果､ wortmanninおよびSB203580はIL-4
産生およびJL-4 mRNAの増加を濃度依存的に抑制し(Figs. 9および12)､ PD98059
はむしろ増加させた(Fig. 1 1)｡したがって､ RBL-2日3細胞からのIL-4産生は少なく
ともJNKおよびp38 MAPKの活性化を抑制することにより抑制されることが明らかに
なった｡なお､ wortmannjnは多様な作用を持つが､他のPJ3-kinase阻害薬
LY294002も同様のlL4産生抑制作用を示した(Fi9. 10)ことから､ wortmannin
のJL-4産生抑制作用はPf3-kinaseを抑制した結果であると考えられる｡また､
TNF-αの産生はPD98059で抑制されることも報告されており(17)､ MAPキナーゼの活性
化あるいは活性を抑制することは多くのサイトカインあるいは炎症性蛋白質の発現を抑制
-23-することにつながることが示唆された｡ PI3-kinaseは肥満細胞の脱票粒反応
(1 5,18-20)やvesicJetransport (21)を抑制すること､またTNF-αの産生を抑制
すること(22)が報告されているが､本研究により､ JL-4の産生にも関与していること
が明らかになり､ PJ3-kinaseの阻害薬が強い抗炎症･抗アレルギー作用を発現する可能
性も考えられる｡
JNKはC-Junをリン酸化し､ AP-1の活性化を引き起こすが､ p38MAPKがどのよ
うにtL-4産生に寄与するかは不明である｡ p38 MAPKは転写国子ATF-Zをリン酸化
し､その転写活性を増大させるが. ATF-Zが結合するDNA配列cAMP responsive
element (CRE)はJL-4の上流には見出されていない(23-25)｡ p38 MAPKはまた､
転写因子myocyte-enhancer factor ZCをリン酸化し､ C-Junの発現を誘導するこ
とも知られている(26)｡ RBL-2日3細胞において抗原刺激によU c-FosおよびC-Jun
のmRNAの発現が増大することも報告されており(27)､ p38MAPKはAP-1の構成
国子の発現調節に寄与している可能性もある｡
本研究ではまた､ PD98059がルー4産生を増大させることも明らかになった｡ ERK
はMAPK phosphataseであるMKP-3を誘導する作用があるため(28)､ ERKの活性
化を抑制するとp38 MAPKの活性化が生じることも明らかにされている(29)｡また
■PD98059はTNトαのプロモーター領域による遺伝子発現を増大することも報告され
ており(22) ､ ERKあるいはPD98059はMAP kinaseの活性化制御以外の未知の作用
も持っている可能性がある｡
4-3 レチノイドのルー4産生抑制作用
レチノイドはレチノイン酸受容体RARあるいはレチノイン酸X受容体に結合し､特異
的蛋白質の産生を誘導する｡一方､分化促進､増殖抑制作用などがあLJ.白血病などの治
療にも応用されている｡また､その分子機序としてAP-1の転写活性の抑制作用が明ら
かにされている｡本研究では､ )L-4産生にAP-1がどの程度関与しているかを明らかに
するために､レチノイドとしてRARやRAXとの親和性が明らかにされている
diazepinyJbenzojc acid誘導体を用いて､レチノイドのJL-4産生に対する作用を検
討した｡ RAR選択的レチノイドであるRe80およびAm80は抗原刺激によるlL-4の
産生(Fig. 13)およびlL4mRNAの増加(Fig. 14)を抑制したことから､レチノイド
はmRNAレベルで作用していると考えられる｡ Re80およびAm80の作用は､ RAR播
抗薬であるLE540で打ち消され(Fig. 15)､ RXR選択的レチノイドであるHX600で増
強された(Fig. 16)ことから､レチノイドのルー4産生抑制作用はRARを介したもので
あると考えられる｡これまで､ 3種のRAR (α. βおよびY)が知られている(30)｡
Re80はすべてのタイプのRARに結合するが､ Am80はRARαに強く､ RARβに弱く
結合する(31)ことから考えて､ lL4産生抑制作用は主としてRARαを介したもので
あると言える｡
前述のAP-lの活性化を抑制するPl3- kinase阻害薬がJL-4産生を部分的に抑制し
た結果と一致して､ AP-1の活性を抑制する作用を持つレチノイドもほぼ40 %弱の抑
制作用しか示さなかった｡ IL-4の転写には､主としてNF-ATとAP-1が関与しており
(1 3)､両方がlL-4のプロモーター領域の特定領域に結合することが最大の転写を誘導す
るのに必要である｡とくにレポーター遺伝子を用いた解析から､ NF-ATの結合が重要
で､ AP-1が結合することによりNトATによる転写が増大することが明らかにされてい
る(1 3)｡本研究において､ NF-ATの活性化を抑制するcyclosporin Aが抗原刺激によ
■るIL4産生を強く抑制したこと(Fig. 17)から､ RBL-ZH3細胞においてもNF-ATの
関与が大きく､ AP-1は増強的に作用していると考えられる｡
レチノイドはこれまで､ IL-6の産生を抑制することが報告されており(32,33)､白血
病細胞の増殖だけでなく､免疫系に対する作用も注目されていた｡また､最近レチノイド
はCD40+lL-4で刺激されたB細胞からのIgE産生を抑制することが報告されている
(34)が､今回さらにIgE産生に重要な役割を果たすJL-4の産生も抑制することが明ら
かになり､レチノイドはJgEの産生を制御し､ 7レルギー性炎症の発症と増悪を抑制す
る薬物として有用である可能性が示唆された｡
-25-4-4 ステロイド性抗炎症薬のMAP kinase活性化抑制作用機序
Dexam占thasoneは､ RBL-ZH3細胞において､抗原刺激によるERKの活性化を抑制
する(2)だけでなく､上述のようにJNKの活性化も抑制する｡グルココルチコイド受容
体括抗薬ERKの活性化抑制作用を打ち消したことから､このMAPキナーゼ活性化抑制
作用はGRを介したものであることが明らかになった(データ未掲載) ｡また､ ERKの
活性化抑制作用はRaf-1であることをすでに明らかにしている(2)が今臥JNKの活性
化抑制作用もMEKK-1の活性化抑制であることを明らかにし､ステロイド性抗炎症薬の
作用点はMAPKキナ-ゼキナーゼレベルであることが示唆された｡本研究ではさらに､
dexamethasoneがどのような分子機序でRaf-1の活性化を抑制するか解析した｡抗原
刺激により､ IgEが架橋されるとチロシンキナーゼが活性化し､ついで低分子量G蛋白
質Rasが活性化される｡ Raf-1は活性型Rasと結合することにより細胞膜に移行し､
そこでリン酸化を受けて活性化する(35-37)｡ Dexamethasoneは抗原刺激によるチEI
シンキナーゼの活性化を抑制せずに､ Raf-1のリン酸化を低下させることをすでに明ら
かにしている(2)ので､本研究では､ dexamethasoneがRaf-1の膜移行を抑制してい
るのか､あるいはリン酸化を直接抑制しているのかを明らかにすることを日的とし､
Raf-1の膜移行について検討した｡その結果､ dexamethasoneは抗原刺激による
■Raf-1の細胞質から細胞膜画分への移行は抑制しないことが明らかになり(Fig. 1 8)､
dexamethasoneのRaf-1の活性化抑制作用は､膜画分へ移行した後のRaf-1のリン
酸化反応を抑制しているか､あるいはRaf-1の脱リン酎ヒを先進していることが示唆さ
れた｡
ERKやJNKの活性化抑制作用には.比較的長時間の前処理が必要であることから､こ
のRaf-1リン酸化反応の抑制は､リン酸化酵素の転写阻害による蛋白質量の低下､なん
らかの阻害蛋白質の誘導､あるいは脱リン酸化酵素の誘導などが考えられ今後さらに詳
細な検討が必要である｡この分子機序の解析のために､現在､種々のRaf-1の部分ぺプ/
チドのGST融合蛋白質を作成し､ Raf-1リン酸化酵素を探索している｡
5.結論と今後の展望
本研究ではステロイド性抗炎症薬のサイトカイン産生機序のひとつとして､ MAP羊
ナーゼの活性化抑制を明らかにした｡また､ MAPキナーゼの活性化を抑制する薬物がサ
イトカインの産生を抑制することも明らかにし､ MAPキナーゼの活性調節が､新規抗炎
症薬の開発の標的となりうることが示唆された｡今後､ MAPキナーゼの活性化を抑制す
る薬物が抗炎症･抗アレルギー薬として開発されることが期待される｡
また､ステロイド成功炎症薬の作用機序としてGRとの複合体が転写国子の活性を直接
抑制するだけではなく､細胞内情報伝達経路を抑制することも見出し､その一端の分子機
序を明らかにした｡一方､ステロイド性抗炎症薬のIL-4産生抑制作用はAP-1の活
性･活性化抑制作用を示す薬物に比べて強力であり､ NF-ATの活性･活性化に対する作
用など､さらにステロイド性抗炎症桑の作用点を解析することの必要性も示唆された｡
ー27-文 献
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