ジヒドロピリジン誘導体による多剤耐性の克服

ジヒドロピリジン誘導体による多剤耐性の克服

著者

神渡 幹夫

雑誌名

鹿児島大学医学雑誌

巻

41

号

3

ページ

225-234

発行年

1990

URL

http://doi.org/10.11501/3087517

ジヒドロピリ

ジ

ン誘導体による多剤耐性の

克

服

神

渡 幹 夫

鹿 児 島 大 学 医 学 部 産 婦 人 科 学 教 室 ( 主 任 :永 田 行 博 教 授)

鹿 児 島 大 学 医 学 雑 誌 第

4

1

巻 第

3

号 別 冊 平 成 元 年 12月 10日 発 行

ど

鹿児島大学医学雑誌 第41巻 第3号 225-234頁 平 成 元 年12月 Med.

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.

Kagoshima Univ.， Vo 4.1

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.

No.3， 225-234， December， 1989

ジヒドロピリジン誘導体による多剤耐性の克服

神 渡 幹 夫

鹿児島大学医学部産科婦人科学教室 (主任:永田行博教疑) (原稿受付日 平 成 元 年8月12日)

Overcoming drug resisiance in cancer cells with dihydropyridine analogues

Mikio KAMIW A TARI

Department of Obstetrics and Gynecology， (Director:Pro

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Yukihiro NAGAT

A

.

M. 0.) Faculty of Medicine， Kagoshima University， Kagoshima， 890， ]apan

Key Words : multidrug-resistance， P-glycoprotein， dihydropyridine analogues

Snmmary

Ten synthetic dihydropyridine analogues were investigated for their ability to reverse drug-resistance ina multidrug-resistant human carcinoma cell line， KB-C.lFour dihydropyridine analogues completely reversed the resistance， 3 lowered the resistance and 3 had littleeffect.

The radioactive photoactive dihydropyridinecalcium channelblocker， [3H]azidopi問。photolabelsP-glycopro

tein in membrane vesiclesfrom KB-CI cells. This photolabeling was almost completely川hibitedby excess dihydropyridine analogues that reversed or lowered drug-resistance. ln contrast， the labeling was not significantly inhibited by analogues that do not reverse resistance. Among other reversing agents， cepharanthine and reserpine inhibited the

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H叫.I]az幻idopi問 photola凶beeli昭， but thioridazi問 did no.tSDB-吃哨ethyle閃diamir問 slightly inhibited the

labelingat100μM. An anticancer agent， vinblastine alsoinhibited the labeling

The correlationbetween the reversing ofthe dr暗ーresistanceand theinhibitionofthe ド[:]勺3可H]az幻机i代dopi川n photolabelingofP-glycoprotein by dihydropyridineanalogues suggests a role for P-glycoprotein i川nmul川tい1idrug-resist ance and alsothe reversing ofthe resistance by dihydropyridine analogues

はじめに

初 回 治 療 時 か ら 広 範 な 抗 癌 剤 に 耐 性 な 腫 蕩 や，抗癌剤投与によりいったん寛解したあと再 発した腫蕩の中に，同じ抗癌剤やそれとは関連 性のない多くの抗癌剤に対して耐性を獲得した 腫療の出現が臨床の場でしばしば経験され，癌 の 化 学 療 法 を 行 う 上 で 重 大 な 障 害 に な っ て い る. 最 近 に な り こ の よ う な 多 剤 耐 性 (multidrug resistance以下MDRと略す)についての分子生 物学的解析が急速に進み，多剤耐性癌細胞では， P -糖蛋白質が増加し (Kartner et al. 1985， Gottesman et a.l1988)， P-糖蛋白質をコードし ている多剤耐性遺伝子 (以下MDR-1と略す) の発現が充進していることが判明した.MDR

-1

遺伝子 の一次 構 造 が 細 菌 の 膜 能 動 輸 送 蛋 白 質，特にヘモリシン Bと類似していることから

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-糖蛋白質は能動排出ポンプとしての機能を 持っていることが推測されている (Gottesman et al.1988). P-糖 蛋 白 質 は 種 々 の 抗 癌 斉JI (Cornwell et a.l1988) ，およびATPと結合能が あり (Gottesman et a

1

.

1

988). A TPase活性を有 し て い る こ と が 報 告 さ れ た CHamada et al

[~26) 成 児 島 大 学 医 学 雑 誌 第 41巻 第 3号 平成元年12月 神渡:ジヒドロピリジン誘導体による多剤耐性の克服 [227)

門 心

1988) .米[I¥]の Ronlnson ら (1988)は p-精蛋 I'J伐 の185昏ト!のアミ ノ 般 が グ リ シ ン か ら パ リ ン に 変 化 す る と 細 胞 が コ ル ヒ チ ン に 優 先 的 に 耐 竹 に な る こ と を ノ

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した. し か し ， 抗 痛 剤 結 介 者)1

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¥Cornwellら ( 1986) は ピ ン プ ラ ス チ ン の フ ォ ト ア フ ィ ニ テ ィ ア ナ ロ グ が 特 異 的 に p-糖 蛍 白 質 を ラ ベ ル す る こ と を 示 し た . 多 剤 耐 性 を 克 服 す る 集 斉]1の ほ と ん ど が ， ビ ン プ ラ ス チ ン の フ ォ ト ア ナ ロ グ に よ る p-糖 蛋 白 質 の フ ォ ト ラ ベ ル を 阻 害 す る こ と が 判 明 し た (Akiyamaet al目1988). こ れ ら の 耐 性 克 服 薬 剤 は ， ピ ン プ ラ ス チ ン と 競 介 的 にp-精 蛋 白 質 に 結 合 す る と 考 え ら れ る 最近， Safaら(J987)に よ り フ ォ ト ア ク チ ブ な ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 で あ る ア ジ ド ピ ン が p-糖 蛋 白 質 を フ ォ ト ラ ベ ル す る 事 が 報 告 さ れ た.さらに，

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高 剤 の ピ ン プ ラ ス チ ン や カ ル シ ウム結抗斉]1の ニ モ ジ ピ ン が ア ジ ド ピ ン の フ ォ ト ラ ベ ル を 阻 害 し た . p-糖 蛋 白 質 は ， 多 剤 耐 性 を 克 服 す る カ ル シ ウ ム 拍 抗 剤 の ベ ラ パ ミ ー ル ・ ヂ ル チ ア ゼ ム ・ ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 な ど と 結 合 す る と 考 え ら れ る (Akiyama et al.1988， afaet a1.1987). 本 研 究 で は ， 新 た に 合 成 し た ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 に つ き ， 多 斉JI耐 性 克 服 活 性 と ， [3H] ア ジ ド ピ ン に よ る p-糖 蛋 白 質 の フ ォ ト ラ ベ ル を 阻 害 す る か 否 か を 調 べ ， ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 に よ る 多 剤 耐 性 克 服 の 機 構 を 解 析 し た

方 法

窒素ガスで高圧をかけて細胞を破壊した.その後，牒 糖 密 度 勾 配 遠 心 法 に てmembranevesicleを分離した (Akiyama et al.1988).蛋白濃度はBradfordの方法 により制定した (Bradfordet a.l1976). 5.フォトアフィニティラベル 96穴 の マ イ ク ロ プ レ ー ト に membranevesicJe 48μ1. 0.75μMの [3H]アジドピン (53Ci/nmol). 必要に応じて各々の濃度の薬剤を加え反応液の全量を 50μlに し た の ち15分 間 室 温 で 静 置 し た .250 Cで 8.薬剤l ジヒドロピリジン誘導体は日比化'

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にて新しく介成 された. [I:H]アジドピンはアマシャムより.ピンク リスチン・アドリアマイシン・アクチノマイシンJ)は シグマより購入した.SDBエチレンジアミンはIJII'I' 製粉より，セファランチンは化研

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北より入手した. 366nmの 紫 外 線 を20分 間 照 射 し た の ち . sodium 1.KB-C1細胞の抗癌剤に対する耐件度

結 果

1.細胞培養および細胞株 現配ではHeLa細胞由来とされているヒ卜鼻咽腔上 皮癌KB細胞はGottesman (NCI. Bethesda， MD)より 譲渡をうけた.多剤耐性変異細胞KB-C1細胞は.KB 細胞を突然変異誘発剤エチルメタンスルホネー卜で処 理後，コルヒチンを加えた培地で培養し徐々にコルヒ チンの濃度を上昇させ，最終的にコルヒチン濃度をl μg I mlで維持し培養した (Akiyamaeta1. 1985) 2. 細胞集結形成能による細胞生存率算出 細胞を60mmのディッシュに300個まき.16時間後に 種々の薬剤を加えた • 37"Cで10日間培養後に， 0.5% メチレンブルーで細胞集落を染色し，数えた.全ての 薬剤は使用する直前にdimetylsulfoxideで溶解した. ピンクリスチン(以下VCRと略す)に対する相対耐 性度はKB細 胞 が50%生存するVCR濃度 (D50)でジ ヒドロピリジン誘導体存在下でのKB細胞の

D

50値を 除した値であらわす• KB-Cl細胞も同様にKB細 胞 が 50%生存する VCR濃度 (D50値 ) で ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン誘導体存在下あるいは非存在下でのKB-C1細 胞 の VCRに対するD50値を除した値で示した. dodecylsulfatebufferで溶角草した 6.SDS尿素ゲルによる電気泳動 Debenhamら(1982)の方法のごとく， 4.5Mの尿素 を含む5%のポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行 い ， フ ル オ ロ グ ラ フ ィ を お こ な っ た (Bonner et al 1974). さらに，バンドに相当するゲルの部位を切取 り放射能活性を測定し，定量化した.蛋白はクマジー ブルーで染色した. 7.免疫沈降 100μgのmembranevesicleに1.5μM

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H]アジ ドピンを加えて. J-.記のごとくフォトラベルをおこな い， 2mlのbufferA (1 % CHAPSを含む)を加え混 和し. 4

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30分間静置した (Hamadaet a. ] l988).そ の後.P-糖蛋白質に対するモノクローナル抗体であ るC-219を4μg加え， 40 Cで2時間反応させた。さ らに20% protein A -Sepharose CL-4Bを200μ1を加え， 撹伴しながら40 Cで30分間反応させた.沈澱をbuffer Aで4回洗浄し， SDS尿素ゲルで電気泳動した. 3. カルシウム措抗活性の測定 カルシウム措抗活性の測定はカルシウム存在下での モルモッ卜の盲腸紐の収縮の阻害度により決定した まず， Hartley系の雄モルモyト(300-400g)より盲腸 紐を摘出し370 C，95%02， 5%C02の条件で生理的塩 溶 液 (NaCl.135mM;KC1，5mM; CaCI2.2mM; MgClz， lmM;D NaHC03

.

1

5mM; glucose，5.5mM)の は い っ た 浴 槽中で洗浄した.盲腸紐は初期加重を1gで牽引した のち，等張収縮をトランスデューサーで測定した目平 衡になった30分後に浴槽中の溶液をCa2 +を含まない 高K+の溶液(KC1，100mM; NaC1， 40mM)に変更した. 30分後，盲腸紐が完全に弛緩したのを確認し， 10mM のCaCl2を加えた.平衡状態になった30分後に，調べ る薬剤を加えた.カルシウム措抗活性はpID50(10-4M のパパペリンによる最大弛緩の50%をもたらすのに必 要なジヒドロピリジン誘導体量の負の対数)で表わし た. KB-Cl細胞はKB-3-]細胞にくらべピンクリスチン (VCR)で1200倍耐性， アクチノマイシンD (AClD) で 1121膏両t'性，ア ドリ アマイ シン (ADr~) で1611行耐 性であった. (表 1). KB-Cl細胞が多剤耐判.であるこ とがわかる.これらの抗癌剤の化学構造式を ~Il にノJ' すが， ー見して構造上の相関はみられないか，脂溶件 表l 各様の抗冊目剤に対するKB-C]細胞の耐性 度 細胞集落形成能を指標として各純の抗掛斉IJに付 する感受性をしらべ，KB細胞のD5oft{I， (50%放 死濃度)を lとした吋のI<B-C1細胞の0:，0仙の 相対値を求め相対的耐性皮とした. 相対的耐性皮 細胞株 KB-3-1 KB-C1 VCR Actl) ADR ]200 112 161 ω

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b. Act 0 c， AOR 4.membrane vesicleの作成 membrane vesicleはKB-C1細 胞 よ り 作 成 し た 24X 24cmのディ ッシュに細胞をまき，培養し， confluent な状態になったら，細胞を剥離し集めたのち，遠沈後， 図l 抗癌剤の化学構造式 ピンクリスチン (VCR) b.アクチノマイシンD (ActD) C アドリアマイシン (ADR)

Group 1 鹿 児 島 大 学 医 学 雑 誌 第 41 巻 第 3号 平成元年12月 神 渡 :ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 に よ る 多 剤 耐 性 の 克 服 [229) (228)

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表2 胞 の 抗 癌 剤 耐 性 の 克 服ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 に よ るKB-C1細 細 胞 集 法 形 成 能 を 指 標 と し て ピ ン ク リ ス チ ン に 対する感受性を調べ， KB細 胞 のD50値 (50%致 死 濃 度 ) を1と し た 時 の 各 細 胞 の ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 存 在 下 ， 非 存 在 下 で のD50値 の 相 対 値 を 求 め 相 対 的 耐 性 度 と し た. ピンクリスチンに ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 _{対 す る 相 対 的 耐 性 度} (μg/ml) KB KB-C1 Group

1

O 1200 PAK-1 O. 1 O. 7 10 O. 1 O.1 PAK-2 10 O. 1 1.0 20 PAK-3 5 0.3 2 10 0.3 0.4 PAK-4 5 0.3 4.0 10 O.1 O.5 icardipine 3 O. 5 11 6 0.4 1.3 Group

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PAK-5 0.3 172 10 0.2 34 PAK-6 10 0.2 14 20 O.1 O. 6 PAK-7 10 0.1 18 20 ifedipine 0.8 48 10 0.8 36 Group

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JP ， U H PAX-'u 図2 ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 の 化 学 構 造 式 *は不斉炭素原子をあらわす. であることが共通している. 2.ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 の 耐 性 鬼 服 作 用 新 た に 介 成 し た ジ ヒ ド ロ ピ リ ン ジ ン 誘 導 体 の構造 式 を[火.]2に 示 す . ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 の 濃 度 は2積 頬 を 使 用 し た . 低 い 濃 度 で は 細 胞 集 落 形 成 はKB細 胞 お よ びKB-Cl細 胞 と も に 阻 書 き れ な かっ た が ， 高 い 濃 度 で 両 細 胞 と も に 細 胞 集 部 形 成 能 の 約5 %が阻害さ れ た . 凶

3

は 細 胞 集 落 形 成 能 を 指 標 と し て ジ ヒ ド ロ ピ リジ ン 誘 導 体PAK-lの VCR耐 性 克 服 を 見 た も の で ある.PAK-1を10μg ml力日えることにより KB-Cl 細 胞 の

VCR

耐 性 は ほ ぼ 完 全 に 克 服 さ れ た.表

2

iこ10 種 類 の ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 お よ び ニ フ ェ ジ ピ ン ・ ニ カ ル ジ ピ ン の ピ ン ク リ ス チ ン 耐 性 克 服 /自 ピンクリスチン ヤgjml) 図3 PAK-1に よ る ピ ン ク リ ス チ ン 耐 性 克 服 効 果 KB細 胞 (・ ， 企，・) 及 びKB-C1細 胞 (0， ム ， 口 ) の 抗 癌 剤 耐 性 に 対 す る PAK-1の 効 果 を み た も の で 細 胞 集 落 形 成 能 で 算 出 し た . そ れ ぞ れ， PAK-1を 加 え な か っ た も の (・，

0)

5μg/ml 加 え た も の (A，ム)， 10μg/ml加 え た も の (・， 口 ) で 表 わ し た 効 果 を 示 す.PAK-1か ら PAK-4 ま で のp秀 導 体 は KB-Cl細胞のVCR耐 性 を ほ ぼ 完 全 に 克 服 し た . こ れ ら を グ ル ー プ

I

とした.PAK-5から PAK-7は 部 分 的 に 克 服 し た こ れ ら を グ ル ー フ

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とした.PAK 8 から PAK-10は 耐 性 を ほ と ん ど 克 服 し な か っ た . こ れ ら を グ ル ー プ田とした ー)f.ニ カ ル シ ピ ン は 完 全 に KB-Cl細胞の耐性を克服し， ニフ tジ ヒ ン は 部 分 的 に 克服した. 3.ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 の カ ル シ ウ ム 抗 抗 作 別 表

3

に10種 類 の 新 し く 合 成 し た ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 訴え 導 体 の カ ル シ ウ ム 陪 抗 作 用 を 示 し た，1司日、?に，ニフェ ジ ピ ン や ニ カ ル ジ ピ ン の 作 用 も 示 し た ー ニ カ ル ジ ヒ ン は 最 も カ ル シ ウ ム 出 抗 活 性 が 強 く，PAK-IOが 最 も 弱 い 今 回 の 新 し く 合 成 し た ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ンt誘導体の 中 でPAK-5が 最 も 強 い カ ル シ ウ ム

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斤￨生を示し た . そ こ で ， 耐 性 克 服 活 性 と の カ ル シ ウ ム 出

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'1'生と の 相 関 を 調 べ て み た (1χ:14 ) .その品占拠[l11Jr;.には明ら か な 相 聞 は 認 め ら れ な か っ た 4 ジ ヒ ド ロ ピ リ シ ン 誘j，[t体による ['HJアジド‘ピ ンの

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精 蛋 白 質 フ ォ ト ラ ベ ル の 問 弁 フ ォ ト ア ク チ フ な ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ンtl%

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本である， 表3 ジ ヒ ド ロ ピ1)ジンt誘導体のカルシウム1r'

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pID50 はカルシウム f占 Vc 作!IJの強さをぷす m f;~I{

でありモルモノトの宵腸*-11:のカルシウム以柿を

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(230) 鹿 児 島 大 学 医 学 雑 誌 第 41巻 第 3号 ['H] ア シ ト ピ ン ( 凶5) は 多 剤 耐 性 の じhinese hamster lungcellの細胞膜のp-糖 蛋 白 質 を フ ォ ト ラ ベ ルすることが宇

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された.多剤耐性を克服するカルシ ウム杭

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来剤はp-納 長 向 質 に 結 合 し p-糖 蛋 白 質 の 機 tì~ を問;与することにより耐性を克服すると推測され た (Safael al.1987) そこで，

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アジドピンによ るP-fl.!f蛋白質のフ寸トラベル実験を行い，ジヒドロ ピリジン誘導体のフ 4 トラベルへの影響をみた.図6 に 比 ら れ る 如 く，

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ア ジ ド ヒ ン は150から170kDa の 蛋 白 質 を 特 異 的 に フ ォ ト ラ ベ ル し た ( レ ー ンA) さ ら に こ の フ ィ ト ラ ベ ル さ れ た 蛋 白 質 は p-糖 蛋 白 質 の モ ノ クUナーJ，レj)日本で、あるC-219で 免 疫 沈 降 し た (レーンB)が ， コ ン ト ロ ー ル の マ ウ ス の!gGで は 免 役

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附しなかった(レーンC).ま た ， 親 株 のKB細 胞 で は150から170kDaの フ ォ ト ラ ベ ル 蛋 白 質 を 認 め な かった 次に，ジヒドロヒリジンs誘導体がP 糖蛋白質のフォ pID50 守 ， 民 ν r D カル y ウム一信託作用 Lu 10吉 10) 10' 耐 f主 交 H ;吾 T主 凶4 ジヒドロピリジン誘導体の耐性克服活性とカ ル シ ウ ム 指 抗 作 用 と の 相 関 耐 性 克 服 活 性 はジヒドロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 存 在 下 で のKB-C1細 胞 の ピ ン ク リ ス チ ン に 対 す るD50値 で シ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 非 存 在 下 で のKB-C1 細 胞 のD50値を除した値であらわした. 『ミた に¥グ¥CF)

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図5 [3H ] ア ジ ド ピ ン の 化 学 構 造 式

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平 成 元 年12月 神 渡 :ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 に よ る 多 剤 耐 性 の 克 服 (231) トラベル を 阻害す る か否 かをみた 図7-9に10種 類 ピンプラスチンは10から100μ1¥1の 濃 度 で アジドピ の ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 の フ ォ ト ラ ベ ル 阻 害 実 験 の ンのフォトラベルを50%間害した さらに他の多剤耐 結 果 を 示 し た . こ れ ら の 結 果 を 定 量 化 し た 結 果 を 凶10 性 克 服 薬 剤 に つ い て も 調 べ て み た と こ ろ ， セ ファラン に 示 し た . グ ル ー プ

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の2剤 で は1から10μMの 濃 チ ン と レ セ ル ピ ン は10から100μ Mの 濃 度 で [ 引 ] ア 度 で フ ォ ト ラ ベ ル を50%阻害した (岡10A).グルー ジドピンのフォトラベルを50%凹さした. ー

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の2剤 と グ ループ

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剤では， 10から100μM の 濃 度 で、フォトラベルを50%阻害した (図10B). し か し ， グ ル ー プ旧の3剤 は100μMで も フ ォ ト ラ ベ ル を 殆 ど 阻 害 し な かった (図10C) 5.ビンプラスチンや他の耐性克服薬剤によるフォト ラベルの間害

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ア ジ ド ピ ン に よ る P一 糖 蛋 白 質 の フォトラベル KB-C 1の vesicleを [3H ] ア ジ ド ピ ン と イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し ， 紫 外 線 照 射 し た あ と ， 可 溶 化 し て 電 気 泳動 し ， 乾 燥 後 フ ル オ ロ グ ラ フィーを行なっ た.A : KB-C 1 membrane vesicleをフォトラベ ル し た あ と 可 溶 化 し てSDS尿 素 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲルで電気泳動をおこなった.B 同椋にフォト ラ ベ ル し たものを CHAPSで口I溶 化したあと C -219を 用 い て 免 疫 沈 降 し た も の を 上 記 ゲ ル で 電 気 泳 動した. C Bと同様の実験であるが， C -219の かわりに同量のマウス IgGを用いた ';6-97 66- 116- 9'1-6G 43-図7 ジヒドロピリジン誘導体(グループ1)によ る [3H]アジドピンフォ トラベル の 阻害

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rOliロ. 戸AμKM:5 10 句 3-図9 ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン 誘 導 体 ( グ ル ー プ由)によ る

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によ る [3H ] ア ジ ド ピ ン フ ォ ト ラ ベ ル の 阻 害 ニ 100 0 >0 : J 度 (uM) 図10 [3

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ア ジ ド ピ ン フ ォ ト ラ ベ ル の ￨世'HI立の 定 量 A グ ル ー プ

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に 属 す る も の PAK-1 (ム)，PAK-2(口)， PAK-3 (e)， PAK-4 (())， NlcardipineIA.) B グループ日に属するもの PAK-5 (.)， PAK-6 (A.，) PAK-7 (勺)，Nifedipine(口) C グ ル ー プ凹に 属 す る も の PAK-8 (e)， PAK-9 (0)， PAK-10 (口)

(232) 鹿 児 島 大 学 医 学 雑 誌 第 41巻 第 3号 平成元年12月

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濃 度 (μM) 凶11 抗痛剤，耐性克服来斉IJによるフォトラベルの ド[['，与

A

チオリダジン .

0

， SDBエチレンジアミン， .，セファランチン .ム， レセルピン， .， ピンプラスチン イソフレノイドSDSエチレンジアミンとフェノチア ジン系カルモジュリン阻芹斉IJチオリダジンは10011~1 でも ~fì どフォトラベルを問主しなかった(凶 11)

考 察

本研究では.まず新しく合成したジヒドロピリジン 誘導体の多斉IJ耐性克服の活性についてヒト癌KS細 胞 を附いてスクリーニングし，カルシウム措抗作用との 関連性を調べた.その結果， PAK -1はPAK-5やニ とカルシウム措抗情性とは必ずしも相関しないことが わかった. 秋 山 ら は こ れ ま で ， 合 成 イ ソ プ レ ノ イ ド で あ る SD8エ チ レ ン ジ ア ミ ン は カ ル シ ウ ム 措 抗 作 用 は な い が，KS細 胞 の 多 剤 耐 性 を 完 全 に 克 服 す る こ と を 報 告 してきた (Nakagawaetal 1986. Yamaguchi etal 1986).カルシウム措抗作用は耐性克服薬剤が耐性を 克 服 す る た め に は 必 ず し も 必 要 で は な い と 考 え ら れ る.今同実験に用いた耐性克服活性を有するジヒドロ ピ1)ジン誘導体には，その構造式の中に陽性に荷電し た窒素原子が合まれる.耐性克服活性がない誘導体は それを含まない. しかし，今同は10種類のジヒドロピ リジン誘導体についての結果であるため，多剤耐性克 f 服活性と構造式との相聞については，より多数のジヒ ドロピリジン誘導体を検討する必要がある. 最近， Safaら (1987)やYangら (1988)が [3HJ アジドピンは

P-

糖蛋白質をフォトラベルし，このフォ トラベルは抗癌剤のピンプラスチンや数種のカルシウ ム措抗剤により阻害されることを報告した我々も， 多剤耐性細胞より抽出したmembranevesicleのp-糖 蛋 白 質 へ の [l:HJア ジ ド ピ ン フ ォ ト ラ ベ ル が ジ ヒ ド ロピリジン誘導体で阻害されることを証明した.耐 性 克服活性をもっジヒドロピリジン誘導体 (グループ

I

お よ び

n

)は [JHJア ジ ド ピ ン の フ ォ ト ラ ベル を 阻 害した. ゾj，耐性克服活性のみられないグループ田 の 誘 導 体 は わ ず か に フ ォ ト ラ ベJレを阻害するのみで あった. これらの結果から多剤耐性を克服するジヒド ロピリシンロ主導体がp-糖蛋白質の機能に影響を与え ていると持:iP.IJされる.また p-糖蛋由貿が殆 ど 発 現 していない親株のK8細胞でも，数種のジヒドロピリ r ジン訪導体を加えることにより VCRに対してより感 受 性 が 憎 加 し て い た . こ れ ら の 誘 導 体 はp-糖 蛋 白 質 と異なるある種の細胞構成成分に作用してK8細胞の VCR 感受性を変えていると推;P.IJされる p-除長白質への [lHJアジドピンの結合は他の耐 性克服装剤のセファランチン (Shiraishiet al1987) やレセルピン Onabaet al.1981)により阻害されたが， フ工ジピンに比べてカルシウム陪抗作用は弱L、が，完 チす11ダジンでは阻害されなかった.またSDSエチ 令に耐性を克服することが判明した.それに対して. レンジアミンは部分的にしか阻害しなかった

ド

HJ

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と ニ フ ェ ジ ピ ン は カ ル シ ウ ム 姑 抗 作 刑 は アジドピンが

P

-糟蛋白質に結合する部位はセファラ P.¥K-1よ)1強いが耐性を部分的にしか克服しなかっ ンイーン. レセルピンおよびジヒドロピリジン誘導体の た.P主K-9 ま¥P主K-6やPえK--;よりもカルシウム p-糟長白質への結合部位と同じか， 一部重なってい 倍抗作用は強いが.耐↑生克服作聞は弱い.これらのこ ることが示唆された. とより.ジヒドロピリジン

J

導体の多斉IJ耐性克服効県 秋 山 ら は (}988)， 最 近SD8エ チ レ ン ジ ア ミ ン を 神j度:ジヒドロピリジン誘導体による多剤耐性の克服 (233) 125]でラベルしたフォト誘導体を合成し， SD8エチレ ンジアミンがP-糖蛋白質に結合すること，そのSD8 エチレンジアミンのフォト誘導体の結合はピンプラス チンによって阻害されることを証明した.また， SDS エ チ レ ン ジ ア ミ ン は125]-NASVによる p-糖 蛋 白 質 の フォトラベルを阻害した (Akiyamaet al.1988) 以上のことより， SDSエチレンジアミンのp-槽 蛋 白質へ結合部位はピンブラスチンと同じかあるいは重 なっているが， [3HJアジドピンとは結合部位が同ー ではないことも推測きれる.一方，ピンプラスチンが [3H]ア ジ ド ピ ン の フ ォ ト ラ ベ ル も 阻 害 す る こ と を 考慮すれば， SDSエ チ レ ン ジ ア ミ ン と ア ジ ド ピ ン の 結合部位は非常に近接しているか，一部重なっている と推測される 他の可能性として， 1) p-糖蛋白質へのこれらの薬 剤の結合部位は同じであるが結合力が薬剤により異な る， 2) これらの薬剤が P一糖蛋白質に結合すること で 蛋 白 質 自 体 が 構 造 変 化 を き た し 他 の 薬 剤 と の 結 合 力が変化することなどが推測される.最近，秋山らは SDSエチレンジアミンのフォト誘導体のKd値がアジ ドピンのKd値よりも大きいことを見いだした (未発 表). 今 後 の 研 究 に よ り ， 抗 癌 剤 や 耐 性 克 服 薬 剤 のP 一糖蛋白質への結合部位を解明し，結合部位の詳細な 構造を明らかにする必要がある 以 上 の 結 果 は ， 市 販 さ れ て い る [3H]アジドピン を使用し， p-糖蛋白質へのフォトラベルの阻害度を 指標とすることにより 多剤耐性克服活性を有する薬 剤のスクリーニングを簡便にできることを示唆してい る.しかしながら，いくつかの誘導体は

p-

糖 蛋 白 質 の機能を阻害するためには，あらかじめ細胞内で代謝 を受ける必要があるかもしれない.今回の実験系では， そ の よ う な 誘 導 体 は ク ス リ ー ニ ン グ 不 可 能 と 恩 わ れ る おわりに，御指導，御校聞をいただいた永田行博教 授，ならびに終始直接御指導いただいた腫揚研究施設 秋山伸一教授に深謝いたします. なお，本論文の一部は第47回日本癌学会(1988年)， 第41回日本産科婦人科学会学術講演会 0989年)にお いて発表した.

文 献

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