ア ユ 冷 水 病 防 疫 に 関 す る 指 針
平成１６年３月
（平成２０年３月改訂）
アユ冷水病対策協議会
は じ め に
ア ユ 冷 水 病 に つ い て は 、 平 成 ６ 年 度 か ら ９ 年 度 ま で 水 産 庁 の 指 導 に よ り 関 係 県 に よ る ア ユ の 冷 水 病 関 係 地 域 合 同 検 討 会 を 、 平 成 １ ０ 年 度 か ら １ ２ 年 度 ま で 関 係 都 府 県 の 研 究 機 関 、 全 国 内 水 面 漁 業 協 同 組 合 連 合 会 等 を 構 成 員 と す る ア ユ 冷 水 病 対 策 研 究 会 を 、 平 成 １ ３ 年 度 か ら は 都 道 府 県 の 関 係 部 局 、 全 国 内 水 面 漁 業 協 同 組 合 連 合 会 等 を 構 成 員 と す る ア ユ 冷 水 病 対 策 協 議 会 を 開 催 し 、 ア ユ 冷 水 病 に 関 す る 共 同 研 究 及 び 蔓 延 防 止 対 策 を 実 施 し て き た 。 そ の 成 果 の 一 環 と し て 、 平 成 １ ３ 年 ３ 月 に ア ユ 冷 水 病 対 策 研 究 会 と し て 、「 ア ユ 冷 水 病 防 疫 に 関 す る 申 し 合 わ せ 事 項 」 等 を と り ま と め た 。 今 般 、 ア ユ 冷 水 病 対 策 協 議 会 に お い て は 、 こ れ ま で 得 ら れ た 知 見 等 を 踏 ま え て 、 都 道 府 県 等 が ア ユ 冷 水 病 対 策 を 講 じ る 上 で の 統 一 的 な 資 料 と し て 「 ア ユ 冷 水 病 防 疫 に 関 す る 指 針 」 を 作 成 し た 。 ア ユ 冷 水 病 対 策 の た め に は 、 ア ユ 種 苗 生 産 者 、 中 間 育 成 者 、 仕 立 て 関 係 者 、 大 型 養 成 者 、 蓄 養 者 、 輸 送 関 係 者 、 放 流 者 、 釣 り 人 、 オ ト リ 販 売 者 等 の 関 係 者 が ど の よ う な こ と に 留 意 す べ き か 十 分 理 解 し 、 取 り 組 む 必 要 が あ る 。 こ の た め 、 各 都 道 府 県 等 に お い て は 、 こ の 「 ア ユ 冷 水 病 防 疫 に 関 す る 指 針 」 と 併 せ 、 別 途 作 成 し た 「 ア ユ 冷 水 病 対 策 の ポ イ ン ト （ パ ン フ レ ッ ト ）」 を 活 用 し 、 関 係 者 へ の ア ユ 冷 水 病 対 策 の た め の 基 本 的 事 項 の 普 及 ・ 啓 発 を 図 り 、 ア ユ 冷 水 病 の 発 生 予 防 及 び 発 生 時 の 適 切 な 対 応 に 努 め ら れ る よ う お 願 い す る 。平 成 １ ６ 年 ３ 月
ア ユ 冷 水 病 対 策 協 議 会
改 訂 に 当 た っ て
ア ユ 冷 水 病 対 策 に つ い て は 、 平 成 １ ６ 年 度 以 降 も ア ユ 冷 水 病 対 策 協 議 会 を 継 続 す る こ と と さ れ 、 平 成 １ ６ 年 ３ 月 に 作 成 さ れ た 「 ア ユ 冷 水 病 防 疫 に 関 す る 指 針 」 及 び 「 ア ユ 冷 水 病 対 策 の ポ イ ン ト （ パ ン フ レ ッ ト ）」 等 の 活 用 に よ り 関 係 者 へ の ア ユ 冷 水 病 対 策 の た め の 普 及 ・ 啓 発 を 図 る と と も に 、 ア ユ 冷 水 病 に 関 す る 共 同 研 究 を 行 っ て き た 。 こ の 間 、 ア ユ 冷 水 病 に 関 す る 新 た な 知 見 が 得 ら れ る と と も に 、 診 断 方 法 の 改 良 等 が 図 ら れ た こ と か ら 、 今 般 、 本 指 針 を 改 訂 す る こ と と し た 。 引 き 続 き 、 各 都 道 府 県 及 び 関 係 者 の 協 力 に よ り ア ユ 冷 水 病 の 発 生 予 防 及 び 発 生 時 の 適 切 な 対 応 に 努 め ら れ る よ う お 願 い す る 。平 成 ２ ０ 年 ３ 月
ア ユ 冷 水 病 対 策 協 議 会
Ⅰ ． ア ユ の 冷 水 病 を 防 ぐ た め に
１ ． ア ユ の 冷 水 病 と は
（ 冷 水 病 の 特 徴 ） ・ グ ラ ム 陰 性 長 桿 菌 の フ ラ ボ バ ク テ リ ウ ム ・ サ イ ク ロ フ ィ ラ ム が 原 因 の 細 菌 感 染 症 。 ・ 主 な 症 状 は 鰓 や 内 臓 の 貧 血 で 、 体 側 や 尾 部 に 潰 瘍 症 状 （ い わ ゆ る 穴 あ き ） を 示 す も の も 多 い 。 こ の ほ か 、 下 あ ご に 出 血 や 潰 瘍 症 状 を 示 し た り 、 筋 肉 や 腹 腔 内 に 出 血 を 起 こ し て い る も の も 見 ら れ る 。 ・ 冷 水 病 菌 は 魚 の 状 態 を 悪 く す る と 発 病 し や す く 、再 発 も す る の で 、飼 育 中 は も ち ろ ん 、 輸 送 ・ 放 流 時 に お い て も 極 力 、 魚 に ス ト レ ス を 与 え な い こ と が 重 要 で あ る 。２ ． 基 本 的 事 項
（ １ ） 基 本 的 な 考 え 方 １ ） 養 殖 場 や 天 然 の 河 川 ・ 湖 沼 へ の 冷 水 病 の 拡 散 を 防 止 す る こ と を 基 本 理 念 と す る 。 ２ ） 移 動 ・ 放 流 種 苗 の 具 備 す べ き 条 件 と し て 、 病 原 菌 を 保 有 し て い な い こ と を 原 則 と す る 。 （ ２ ） 移 動 ・ 放 流 可 否 の 判 断 基 準 １ ） 移 動 ・ 放 流 直 前 に 冷 水 病 と 疑 わ れ る 症 状 も な く 、 継 続 し た 死 亡 が 見 ら れ な い 飼 育 群 に つ い て は 当 面 、 移 動 ・ 放 流 を 可 と す る 。 ２ ） 移 動 ・ 放 流 直 前 に 継 続 し た 死 亡 が あ る か 、 あ る い は ア ユ 冷 水 病 の 発 生 、 ま た は 冷 水 病 が 疑 わ れ る 症 状 が 一 部 の 個 体 で 認 め ら れ る 飼 育 群 に つ い て は 、 以 下 の 対 応 を 現 場 に 指 導 す る 。 ① 一 時 、 移 動 ・ 放 流 を 延 期 す る 。 ② 魚 病 診 断 機 関 に 診 断 を 依 頼 す る 。 ③ 診 断 結 果 が 冷 水 病 、 ま た は 他 の 疾 病 と な っ た 場 合 、 移 動 ・ 放 流 を 一 旦 中 止 し 、 効 能 が 承 認 さ れ た 水 産 用 医 薬 品 に よ る 治 療 や 加 温 処 理 等 に よ り 、病 状 の 回 復 を 図 る 。 ④ 治 療 後 は 一 定 期 間 飼 育 し た 後 に 保 菌 検 査 を 行 い 、 陰 性 を 確 認 し て か ら 放 流 を 可 と す る 。 （ ３ ） ア ユ 冷 水 病 診 断 及 び 保 菌 検 査 手 法 １ ） ア ユ 冷 水 病 の 診 断 は 資 料 １ 及 び 資 料 ２ に 記 載 さ れ た 方 法 に よ っ て 行 う 。 保 菌 検 査 は 診 断 法 に 準 じ て 行 う 。 ２ ） １ 飼 育 群 の 保 菌 検 査 個 体 数 は 60 個 体 と す る 。 PCR 法 に よ り 行 う 場 合 は 、 複 数 個 体 を プ ー ル し て １ 検 体 と し ６ 検 体 以 上 を 、 ま た 、 培 養 法 に よ り 行 う 場 合 に は 60 個 体 を検 査 す る 。
Ⅱ ． 防 疫 の た め の 具 体 的 措 置
種 苗 飼 育 施 設 及 び 管 理 ・ 輸 送 ・ 放 流 に 対 し て 、 以 下 の 措 置 の 普 及 を 図 る 。
１ ． 種 苗 の 飼 育 管 理 等 に 関 す る 疾 病 防 除 対 策 （ 種 苗 供 給 施 設 ・ 養 殖 場 等 ）
（ １ ） 適 正 な 飼 育 環 境 の 確 保 １ ） 飼 育 施 設 は 使 用 前 に 消 毒 を 実 施 し 、 飼 育 施 設 や 器 具 類 は 清 浄 な 状 態 を 保 つ 。 ま た 、 飼 育 担 当 者 以 外 の 不 必 要 な 立 ち 入 り を 規 制 し 、 か つ 、 手 や ゴ ム 手 袋 、 長 靴 、 合 羽 、 水 槽 、 器 具 等 の 消 毒 を 徹 底 す る 。 ２ ） 飼 育 器 具 類 （ タ モ 網 、 ブ ラ シ ） は 池 ご と に 専 用 と し 、 複 数 の 池 と の 混 用 は 避 け る 。 ３ ） 可 能 な 限 り 飼 育 密 度 を 低 く す る 。 ま た 、 残 餌 及 び 糞 等 を こ ま め に 除 去 す る ４ ） 常 に 飼 育 池 を 観 察 し 、 こ ま め に 衰 弱 し た 魚 や 瀕 死 魚 、 死 亡 魚 は 速 や か に 取 り 除 き 、 焼 却 等 に よ り 処 分 す る 。 継 続 し た へ い 死 が あ っ て 冷 水 病 の 発 生 が 疑 わ れ る 池 の 魚 は 移 動 さ せ ず 、 速 や か に 診 断 を 受 け る 。 ５ ） 用 水 は 地 下 水 を 使 用 す る こ と が 望 ま し い 。 河 川 水 を 使 用 す る 場 合 は 、 濾 過 し た 上 で 紫 外 線 で 殺 菌 処 理 を 施 す こ と が 望 ま し い 。 能 力 が 十 分 で あ れ ば 循 環 濾 過 で 飼 育 し て も 良 い が 、 飼 育 槽 へ の 流 入 口 に 紫 外 線 等 に よ る 殺 菌 装 置 を 設 置 し た 方 が 良 い 。 ま た 、 排 水 路 で は 、 種 苗 の 選 別 や 蓄 養 を 行 わ な い 。 ６ ） 飼 育 水 の 急 激 な 温 度 変 化 を 避 け る 。 ７ ） 飼 育 池 の 排 水 部 （ 河 川 水 を 使 用 の 場 合 は 注 水 部 も ） に は ス ク リ ー ン 等 を 設 置 し て 、 保 菌 あ る い は 汚 染 の 可 能 性 が あ る 生 物 の 侵 入 を 防 ぐ 。 ま た 、 水 車 等 の 水 し ぶ き が 他 の 池 に 飛 ば な い よ う に す る 。 ８ ） 施 設 ・ 器 具 類 の 消 毒 に 関 す る 措 置 ① 原 則 と し て 通 常 使 用 さ れ て い る 手 法 及 び 消 毒 剤 （ 逆 性 石 鹸 、 ア ル コ ー ル 類 、 塩 素 系 消 毒 剤 等 ） を 使 用 す る 。 ② 消 毒 剤 の 病 原 菌 へ の 作 用 機 序 や 特 性 を 理 解 し 、 水 産 生 物 や 人 体 、 環 境 に 及 ぼ す 影 響 を 避 け る こ と を 念 頭 に 置 き 、 薬 剤 の 選 定 や 消 毒 作 業 を 行 う 。 ③ 消 毒 剤 は そ の 都 度 調 整 し 、 用 法 、 用 量 を 厳 守 し 、 過 度 な 使 用 を 避 け る 。 ④ 使 用 後 の 消 毒 剤 の 廃 棄 は 環 境 に 配 慮 し 、 分 解 あ る い は 中 和 が 必 要 な 薬 剤 に つ い て は 、そ の 薬 剤 に 添 付 さ れ て い る 使 用 上 の 注 意 等 に 従 い 、適 切 に 処 理 し て 廃 棄 す る 。 ［ 補 足 説 明 ］ ・ 冷 水 病 菌 は 目 で 見 え な い の で 、 確 実 に 消 毒 さ れ た も の 以 外 は 全 て 、 冷 水 病 菌 が 付 い て い る と 思 っ て 作 業 す る こ と が 必 要 で あ る 。 ・ 特 に 人 体 、衣 服 、長 靴 、器 具 、タ モ 、鳥 な ど は 冷 水 病 菌 が 付 い て い る も の と し て 扱 う 。 ・ 消 毒 に は 以 下 の 消 毒 剤 を 使 う と 良 い 。 手 、 ゴ ム 手 袋 、 長 靴 、 合 羽 等 ‥ ‥ ‥ 逆 性 せ っ け ん 液 （ 100 ～ 200 倍 稀 釈 ） ア ル コ ー ル 類 （ 70 ％ ）タ モ 、 ブ ラ シ 等 飼 育 器 具 類 、 池 ‥ ‥ ‥ 逆 性 せ っ け ん 液 （ 100 ～ 200 倍 稀 釈 ） 塩 素 系 消 毒 剤 （ ｻﾗｼ粉 の 場 合 1,000 倍 稀 釈 ） （ ２ ） 種 苗 の 健 康 管 理 １ ） 高 密 度 飼 育 は 避 け る 。 ２ ） 過 度 の 給 餌 は 避 け る 。 必 要 に 応 じ 、 ビ タ ミ ン 、 消 化 剤 等 の 投 与 は し た 方 が 良 い 。 ３ ） 変 質 し た 可 能 性 の あ る 、 あ る い は 病 原 菌 に 汚 染 さ れ た 恐 れ の あ る 飼 ・ 餌 料 は 与 え な い 。 ４ ） 飼 育 期 間 中 に 種 苗 間 に 成 長 の 差 が 生 じ た 場 合 に は 適 度 な 間 隔 で サ イ ズ 選 別 を 行 い 、 極 端 に サ イ ズ の 異 な る 魚 の 混 入 は 避 け る 。 な お 、 網 ズ レ を 避 け る た め 、 タ モ 網 は で き る だ け 使 わ な い 。 ５ ） 種 苗 に ス ト レ ス を 与 え る こ と は 極 力 避 け る 。 ・ 必 要 以 上 の 選 別 は 行 わ な い 。 ・ 魚 の 分 養 時 等 に 塩 水 浴 （ 1%以 下 ） を す る と 良 い 。 た だ し 、 塩 分 が 高 く な る と ア ユ に 悪 影 響 を 及 ぼ す こ と が あ る の で 注 意 す る こ と 。 ま た 、 淡 水 へ の 馴 致 は 短 時 間 で 行 わ な い 。 ・ 不 用 意 に 魚 を 驚 か せ て パ ニ ッ ク 状 態 に さ せ な い 。 ・ 種 苗 を 計 量 す る 時 に は 、 魚 の 量 に 対 し て 可 能 な 限 り 水 の 量 を 多 く す る 。 ・ 種 苗 を 池 か ら 分 養 す る 時 、 飼 育 水 と 外 気 の 温 度 差 が 少 な い よ う に し た 方 が 良 い 。 ・ 海 産 、 人 工 種 苗 の 場 合 、 急 激 な 淡 水 馴 致 は 過 度 の ス ト レ ス を 与 え 、 馴 致 後 に 冷 水 病 の 発 生 を 引 き 起 こ し や す い の で 避 け る 。 ６ ）頻 繁 に 種 苗 の 行 動 を 観 察 し 、異 常 行 動 を 示 す 個 体 は 速 や か に 飼 育 水 槽 か ら 除 去 す る 。 （ ３ ） 冷 水 病 発 生 時 の 対 応 １ ） 冷 水 病 が 疑 わ れ る 症 状 あ る い は 死 亡 が 発 生 し た 場 合 に は 、 瀕 死 魚 や 死 亡 魚 を 早 急 に 取 り 除 き 、 病 気 の 蔓 延 防 止 に 努 め る と と も に 、 各 都 道 府 県 の 魚 病 診 断 機 関 に 診 断 を 依 頼 す る 。 ２ ） 冷 水 病 と 診 断 さ れ た ら 、 効 能 が 承 認 さ れ た 水 産 用 医 薬 品 （ ス ル フ ィ ソ ゾ ー ル ナ ト リ ウ ム ） の 投 与 や 加 温 処 理 を 施 し 、 病 状 が 回 復 す る ま で は 移 動 を 避 け 、 ま ず 飼 育 場 内 で の 拡 散 防 止 に 努 め る 。 ３ ） 過 密 養 殖 や 給 餌 過 多 が 冷 水 病 被 害 の 増 大 を も た ら す こ と か ら 、 飼 育 密 度 を 下 げ 、 餌 を 控 え 、 飼 育 環 境 の 浄 化 に 努 め る 。 ４ ） 冷 水 病 菌 の 施 設 外 へ の 拡 散 を 最 小 限 に す る た め 、 感 染 魚 や 死 亡 魚 等 を 排 水 路 等 に 投 棄 せ ず 、 焼 却 等 に よ り 処 分 す る 。 （ 予 防 、 治 療 法 及 び 種 苗 取 扱 い 上 の 注 意 点 ） ・ ア ユ 冷 水 病 は 水 平 感 染 が 比 較 的 容 易 に 成 立 す る の で 、 施 設 の 消 毒 、 取 り 除 い た 死 亡 魚 や 異 常 魚 の 処 理 、 飼 育 水 の 飛 沫 や 池 の 水 漏 れ 防 止 な ど 、 日 常 の 防 疫 活 動 に は 十 分 な 注 意 を 要 す る 。 ・ ア ユ の 冷 水 病 治 療 に 対 し て 効 能 が 承 認 さ れ た 水 産 用 医 薬 品 と し て は ス ル フ ィ ソ ゾ ー ル ナ ト リ ウ ム （ 商 品 名 イ ス ラ ン ソ ー ダ ） が あ る 。 魚 体 重 １ kg 当 た り １ 日 100 ～ 200mg
の 当 該 薬 剤 を 飼 料 に 添 加 し 、 投 与 す る こ と に よ っ て 、 ア ユ の 冷 水 病 に 起 因 す る 死 亡 率 は 低 下 す る 。 な お 、 ス ル フ ィ ソ ゾ ー ル ナ ト リ ウ ム は 治 療 の た め に 使 用 が 認 め ら れ て お り 、 予 防 投 薬 は 認 め て い な い の で 注 意 す る こ と 。 ・ 冷 水 病 の 治 療 に は 、 飼 育 水 温 を 一 時 的 に 上 昇 さ せ る 加 温 処 理 が 有 効 で あ る 。 ・ 方 法 は 2 回 加 温 で 、 加 温 水 を 徐 々 に 注 水 し て 飼 育 水 温 を ２ ３ ℃ で ３ 日 間 維 持 し 、 通 常 水 温 に 数 日 間 戻 し た 後 に 再 度 ２ ８ ℃ で ３ 日 間 維 持 す る 。 ・２ ３ ℃ の 加 温 処 理 は 温 度 上 昇 に ア ユ を 馴 致 す る た め の も の で あ り 、 高 い 治 療 効 果 は ２ ８ ℃ の 加 温 処 理 に あ る 。 ・ 冷 水 病 菌 は 、 魚 体 内 や 環 境 中 に 潜 在 す る 能 力 に 長 け て い る 可 能 性 が あ り 、 治 療 後 し ば ら く し て 再 発 す る こ と が あ る 。 ・ ま た 、 飼 育 池 で は も ち ろ ん 、 輸 送 時 に お い て も 、 被 害 の 軽 減 を 図 る た め ､極 力 、 魚 を 高 密 度 に 収 容 し な い こ と が 望 ま れ る 。 （ ４ ） 冷 水 病 発 病 魚 の 処 分 １ ） 冷 水 病 の 症 状 の あ る 個 体 は 損 傷 し な い よ う に 、 丁 寧 に 水 槽 か ら 取 り 除 く 。 ２ ） 冷 水 病 発 病 魚 は 煮 沸 、 焼 却 等 に よ り 的 確 に 処 理 す る 。 ３ ） 採 集 や 処 理 に 使 用 し た 器 具 、 用 具 類 は 使 用 後 直 ち に 消 毒 す る と と も に 、 手 や ゴ ム 手 袋 、 長 靴 、 合 羽 等 の 消 毒 も 同 時 に 行 う 。
２ ． 種 苗 の 輸 送 中 及 び そ の 前 後 に 関 す る 疾 病 防 除 対 策
（ １ ） 種 苗 の 取 り 上 げ に 関 す る 措 置 １ ） 輸 送 前 に は 餌 止 め を 行 う 。 輸 送 直 前 ま で の 給 餌 や 濃 密 飼 育 は し な い よ う に す る 。 ２ ） 種 苗 を 池 か ら 輸 送 用 水 槽 へ 移 す 際 に は 、 急 激 な 水 温 変 化 を 避 け 、 か つ 、 水 温 馴 致 期 間 を 可 能 な 限 り 長 く と る 。 ３ ） 取 り 上 げ 及 び 計 数 は 慎 重 に 行 い 、 可 能 な 限 り ス ト レ ス の 少 な い 方 法 を 選 択 す る 。 ４ ） ス レ 防 止 の た め 、 網 （ 網 生 け 簀 を 含 む ） は な る べ く 使 用 せ ず 、 で き る だ け バ ケ ツ 等 で 水 ご と す く う よ う に す る 。 ５ ） 輸 送 前 の 魚 の 健 康 状 態 を 注 意 深 く 観 察 し 、 発 病 魚 の 輸 送 は し な い （ 寄 生 虫 の 付 着 や 冷 水 病 以 外 の 疾 病 等 の 異 常 も 含 め て ）。 （ ２ ） 輸 送 に 関 す る 措 置 １ ） ト ラ ッ ク 、 活 魚 水 槽 な ど は 、 使 用 前 後 に 必 ず 消 毒 す る 。 洗 浄 、 乾 燥 し て か ら 使 用 す る 。 ２ ） 輸 送 時 の 種 苗 密 度 を 可 能 な 限 り 低 く す る 。 ３ ） 輸 送 時 の 水 温 の 急 激 な 変 化 を 避 け る 。 ４ ） 輸 送 距 離 に 合 わ せ て 、 収 容 密 度 や 輸 送 方 法 を 選 択 す る な ど 、 可 能 な 限 り 種 苗 に 無 用 の ス ト レ ス を か け な い よ う に 注 意 す る 。 ５ ） 輸 送 ト ラ ッ ク の 同 一 水 槽 に 、 複 数 業 者 の 魚 を 混 ぜ て 収 容 し な い 。７ ） ア ユ の 体 型 が 小 さ い ほ ど 、 水 量 当 た り の 輸 送 量 を 少 な く す る 。 ８ ） 輸 送 中 は 時 々 魚 の 状 態 や 水 温 、 酸 素 を チ ェ ッ ク す る 。 ９ ） 輸 送 中 ま た は 輸 送 後 に は 、 薄 い 塩 水 浴 （ 0.2 ～ 0.9 ％ ） を す る と 良 い 。 た だ し 、 塩 分 が 高 く な る と ア ユ に 悪 影 響 を 及 ぼ す こ と が あ る の で 注 意 す る 。 ま た 、 塩 水 浴 後 の 淡 水 へ の 馴 致 は 短 時 間 で 行 わ な い 。 １ ０ ） 輸 送 中 の 過 度 の エ ア レ ー シ ョ ン 及 び 酸 素 供 給 は 、 鰓 に 障 害 を 与 え る の で し な い よ う に す る 。 １ １ ） 輸 送 中 、 水 面 に 発 生 す る 泡 は で き る だ け こ ま め に 取 り 除 く 。 １ ２ ） 輸 送 中 、 死 亡 魚 や 異 常 魚 を こ ま め に 取 り 除 く と と も に 、 死 亡 魚 や 異 常 魚 を 無 処 理 の ま ま 投 棄 し な い 。 １ ３ ） 輸 送 時 の 水 温 や 溶 存 酸 素 等 、 水 質 の 管 理 を 輸 送 担 当 者 に 徹 底 さ せ る 。 ［ 補 足 説 明 ］ ・ 輸 送 時 に は 、 ア ユ を 池 か ら 「 取 り 上 げ 」 て 「 計 量 」 し 、 ト ラ ッ ク の 水 槽 へ 「 高 密 度 で 収 容 」し 、更 に 、走 行 す る た め「 連 続 的 な 振 動 」が あ り 、ま た 排 泄 や 呼 吸 等 に よ る「 水 質 の 悪 化 」 が 起 こ る 。 ・ こ れ ら は 全 て 、 ア ユ に と っ て 大 き な ス ト レ ス の 原 因 と な り 、 ア ユ の 状 態 を 悪 く し て 冷 水 病 の 発 生 を 引 き 起 こ し や す く す る 。 輸 送 の ス ト レ ス を 可 能 な 限 り 小 さ く す る よ う に 心 が け る 。 ・ 輸 送 中 の 排 泄 に よ る 「 水 質 の 悪 化 」 や 、 餌 の 消 化 に よ る エ ネ ル ギ ー 消 耗 を 防 ぐ た め 、 輸 送 前 に は 必 ず 餌 止 め を す る 。 ・ 輸 送 中 に 水 面 に 出 る 泡 に は 、 ア ユ の 排 泄 に 由 来 す る ア ン モ ニ ア 等 の 有 害 物 質 が 吸 着 さ れ て い る 。 こ の た め 、 泡 を こ ま め に 取 り 除 く こ と は 、 水 槽 水 の 水 質 悪 化 を 軽 減 す る こ と に つ な が る 。
３ ． 放 流 に 関 す る 疾 病 防 除 対 策
（ １ ） 放 流 時 期 ・ 場 所 の 決 定 １ ） 河 川 水 温 や 流 量 、 餌 と な る 付 着 藻 類 の 状 況 等 、 河 川 の 状 況 を 継 続 的 に 記 録 す る 。 ２ ） ア ユ 豊 漁 年 の 河 川 の 状 況 を 基 準 と し て 、 当 該 年 の 放 流 時 期 や 場 所 、 回 数 、 放 流 量 を 決 定 す る 。 ３ ） 放 流 河 川 の 水 温 の 低 い 時 期 や 水 温 変 動 の 大 き い 時 期 、 ま た 濁 水 の 出 や す い 時 期 の 放 流 を 避 け る 。 ４ ） 降 雨 等 に よ り 急 激 な 水 温 変 化 が 予 測 さ れ る 時 の 放 流 は 避 け 、 水 温 が 安 定 し た 状 態 に な っ て か ら 放 流 す る 。 ５ ） 河 川 水 が 増 水 や 、 濁 っ て い る 時 、 ま た は 濁 る こ と が 予 想 さ れ る 時 の 放 流 は 避 け る 。 ６ ） 放 流 対 象 河 川 の 水 温 上 昇 （ 日 間 最 低 水 温 が 13 ℃ 以 上 と な る 時 ） を 目 安 に 、 そ れ 以 後 の 時 期 に 放 流 予 定 量 を 数 回 に 分 け て 、２ 週 間 程 度 の 間 隔 を お い て 放 流 す る の が 良 い 。（ ２ ） 種 苗 の 選 択 及 び 取 扱 い １ ） 放 流 用 種 苗 は 種 苗 購 入 時 に 保 菌 検 査 結 果 か ら 冷 水 病 原 因 菌 の 保 菌 が な い こ と が 確 認 さ れ た 種 苗 を 選 択 す る こ と を 原 則 と す る 。 ２ ） 放 流 時 に は 輸 送 水 槽 内 で 可 能 な 限 り 、 河 川 水 温 に 馴 致 さ せ る 。 ３ ） 放 流 時 の タ モ 網 使 用 な ど 、 無 用 の ス ト レ ス を 種 苗 に 与 え な い 。 ４ ） や む を え ず タ モ 網 な ど を 使 用 す る 際 で も 、 他 車 と の 共 用 を し な い 。 ５ ） 放 流 現 場 に 到 着 し た 時 点 で 、 冷 水 病 を 発 症 あ る い は 冷 水 病 が 疑 わ れ る 症 状 が 一 部 の 個 体 で 認 め ら れ る 輸 送 水 槽 の 種 苗 は 、 一 旦 蓄 養 池 等 に 移 し 、 速 や か に 診 断 を 受 け 、 診 断 で 陽 性 と な っ た 場 合 は 、 治 療 し 陰 性 を 確 認 し た 後 放 流 す る 。 ６ ） 死 亡 魚 、 異 常 魚 を 天 然 水 域 に 投 棄 せ ず 、 焼 却 す る 等 適 切 に 処 理 す る 。 ［ 補 足 説 明 ］ ・ ア ユ は 放 流 さ れ る 前 に 輸 送 さ れ て く る 。 輸 送 は 「 取 り 上 げ 、 計 量 」、 活 魚 槽 へ の 「 高 密 度 収 容 」「 水 質 悪 化 」、 走 行 に よ る 「 振 動 」 な ど と い っ た 、 ア ユ に ス ト レ ス を 引 き 起 こ す 様 々 な 要 素 を 含 ん で い る 。 ・ 放 流 場 所 に 着 い た ア ユ は 、 こ れ ら の ス ト レ ス 要 素 に さ ら さ れ た 直 後 で 、 ア ユ の 側 か ら す れ ば 決 し て 良 い 状 態 で は な く 、 む し ろ 冷 水 病 が 発 生 し や す い 状 態 に あ る 。 ・ そ の た め 、 放 流 に 際 し て は こ れ 以 上 の ス ト レ ス を 与 え て 、 ア ユ の 状 態 を 更 に 悪 く し な い よ う に す る こ と が 肝 要 で あ る 。 ・ 河 川 水 と の 水 温 差 、河 川 水 の 低 水 温 、濁 水 、増 水 は 全 て ア ユ に 大 き な ス ト レ ス と な り 、 冷 水 病 発 病 の 引 き 金 に な る の で 、 避 け る こ と が 必 要 で あ る 。 ・ 冷 水 病 菌 が 河 川 に 残 存 し て い る 可 能 性 を 考 え て 、 あ ら ゆ る 面 に わ た っ て ア ユ の 取 扱 い に 注 意 す る 。 ・ ま た 、 冷 水 病 は ア ユ か ら ア ユ へ と 感 染 す る の で 、 死 ん だ ア ユ や 瀕 死 の ア ユ を 放 流 す る と 、 元 気 な ア ユ ま で 感 染 す る 危 険 が あ る 。 ・ 放 流 予 定 日 に 予 期 せ ぬ 出 水 等 が あ る 場 合 を 考 慮 し て 、 危 険 回 避 の た め 、 数 回 に 分 け て 放 流 す る 方 が 良 い 。 ・「 昔 は こ れ ぐ ら い 大 丈 夫 だ っ た 。」「 今 ま で 何 度 も や っ て 大 丈 夫 だ っ た 。」 と い う 放 流 の 仕 方 は 、 今 は 通 用 し な い と 思 っ て 放 流 す る 方 が 賢 明 で あ る 。 （ ３ ） 放 流 に あ た っ て の 参 考 事 例 １ ）漁 業 協 同 組 合 で は 放 流 効 果 を 上 げ る こ と を 意 図 し て 実 際 に 様 々 な 対 策 を 行 っ て い る 。 最 も 効 果 の あ っ た と す る 対 策 は「 無 病 ア ユ の 確 保 ・ 放 流 」と「 適 切 な 放 流 時 期 の 決 定 」 で あ っ た が 、 具 体 的 に は 次 の と お り で あ る 。 ・ 水 温 の 上 昇 を 計 測 し て 放 流 開 始 日 を 調 整 し た 。 ・ 放 流 場 所 を 複 数 箇 所 に 分 け て 放 流 し た 。 ・ 種 苗 の 供 給 先 ま で 行 っ て 、 購 入 す る ア ユ の 状 態 を 確 か め た 。 ・ 放 流 回 数 を 複 数 回 に 分 け て 放 流 し た 。 ・ 放 流 種 苗 の サ イ ズ を い ろ い ろ な サ イ ズ に 分 け て 放 流 し た 。 ・ 付 着 藻 類 （ こ け ） の 状 況 を 観 察 し て 放 流 開 始 日 を 調 整 し た 。 ・ 放 流 前 に 魚 病 等 の 検 査 を 行 っ た 。
・ 全 体 の 放 流 量 が 減 っ て も 、 冷 水 病 の な い 種 苗 を 放 流 し た 。 ・ 放 流 種 苗 の 購 入 先 を 信 頼 の で き る １ ヶ 所 だ け に し た 。 ・ 人 工 産 、 海 産 、 琵 琶 湖 産 等 の 由 来 や 、 生 産 地 （ 生 産 業 者 ） が 異 な る 種 苗 は 、 同 一 水 系 あ る い は 同 一 支 流 に 放 流 し な か っ た 。 ・ 冷 水 病 菌 に 感 染 し て い な い と 考 え ら れ る 種 苗 ほ ど 上 流 に 放 流 し た 。 ２ ） 川 の 付 着 藻 類 （ こ け ） の 状 況 と ア ユ 漁 の 善 し 悪 し の 関 連 に つ い て ・ 放 流 開 始 時 に こ け が 良 く 付 い て い る ほ ど 、 解 禁 当 初 の ア ユ の 歩 留 ま り は 良 か っ た 。 ・ 解 禁 当 初 の ア ユ の 歩 留 ま り が 良 け れ ば 、 そ の シ ー ズ ン 全 般 に 良 い 結 果 で あ っ た 。 ・ こ け の 成 育 は 水 温 を 含 め た 、 河 川 の 状 況 を 判 断 す る 良 い 指 標 で あ る 。 こ け が 良 く 付 い て か ら 放 流 す る こ と は 、 良 い 結 果 を 得 る た め の 対 策 と し て 、 試 し て み る 価 値 が あ る と 思 わ れ る 。
Ⅲ ． 防 疫 体 制 の 確 立
１ ． 防 疫 体 制 の 整 備
（ １ ） 本 指 針 及 び 「 ア ユ 冷 水 病 対 策 の ポ イ ン ト 」 を 活 用 し て 、 各 都 道 府 県 の 実 状 に 合 わ せ た 普 及 啓 発 を 推 進 す る 。 （ ２ ） 防 疫 体 制 を 強 化 す る た め に 、 別 添 来 歴 カ ー ド の 確 実 な 普 及 を 図 る 。 な お 、 様 式 に つ い て は 各 都 道 府 県 の 実 状 に 合 わ せ て 変 更 可 と す る 。 ［ 補 足 説 明 ］ 来 歴 カ ー ド に つ い て 冷 水 病 の 被 害 を 軽 減 す る た め に は 、 ど の よ う な 来 歴 を 持 つ 種 苗 が 良 好 な 水 揚 げ を も た ら す の か を 知 る こ と が 大 切 で あ る 。 そ の た め に は 、 種 苗 の 来 歴 を 記 録 す る 必 要 が あ る 。 こ の 来 歴 を 記 録 し た 用 紙 を 来 歴 カ ー ド と い う 。 来 歴 カ ー ド （ 用 紙 は 各 都 道 府 県 の 水 産 試 験 研 究 機 関 で 配 布 ） は 種 苗 供 給 施 設 の 一 つ の 池 で 同 時 に 飼 育 す る 種 苗 ご と に 作 成 し 、 種 苗 を 出 荷 す る 際 に 、 来 歴 カ ー ド を 添 付 す る 。 な お 、 一 つ の 池 の 種 苗 を い く つ か の 移 送 先 へ 送 付 す る 場 合 は 、 そ れ ぞ れ の 移 送 先 へ の 送 り 状 に 来 歴 カ ー ド （ コ ピ ー で 可 ） を 添 付 す る 。 ま た 、 複 数 の 池 の 種 苗 を 混 合 し て 移 送 す る 場 合 は 、 混 合 し た 全 て の 種 苗 の 来 歴 カ ー ド （ コ ピ ー で 可 ） を 送 り 状 に 添 付 す る 。 種 苗 移 動 の 各 段 階 で 来 歴 カ ー ド に 必 要 事 項 を 記 入 す る 。 ま た 、 放 流 事 業 者 や 養 殖 事 業 者 な ど 、 最 終 的 に 種 苗 を 受 け 取 っ た 事 業 者 は 、 添 付 さ れ て き た 来 歴 カ ー ド に 、 そ の 年 の 釣 果 や 水 揚 げ の 良 否 等 を 記 入 し て 、 各 都 道 府 県 の 水 産 試 験 研 究 機 関 に 送 付 す る 。２ ． お と り ア ユ に つ い て
お と り ア ユ を 介 し た 冷 水 病 の 拡 大 を 防 ぐ た め 、 お と り ア ユ の 防 疫 に つ い て 普 及 啓 発 を 図 る （ １ ） 冷 水 病 の 恐 れ の な い ア ユ を お と り と し て 販 売 す る 。 （ ２ ） 未 発 生 水 域 で は 、 他 水 域 か ら の お と り を 持 ち 込 ま な い 。 （ ３ ） 発 生 水 域 で は 、 他 水 域 へ お と り と し て 持 ち 出 さ な い 。 ［ 補 足 説 明 ］ 遊 漁 者 が 注 意 す べ き 事 項 ・ 体 表 に 異 常 が 認 め ら れ た り 、 元 気 の な い お と り ア ユ は 購 入 し な い 。 ・ 釣 っ た ア ユ 、 お と り ア ユ は す べ て 持 ち 帰 る 。 ・ 他 の 河 川 で お と り ア ユ と し て 購 入 し た ア ユ 、 他 の 河 川 で 釣 っ た ア ユ は 、 お と り ア ユ と し て 使 用 し な い 。 ・ タ モ 網 、 引 き 舟 、 タ ビ 、 ウ ェ ー ダ ー 等 は 、 使 用 後 、 洗 浄 ・ 乾 燥 し た あ と 、 ア ル コ ー ル 等 に よ り 消 毒 す る 。資 料1
培 養 に よ る ア ユ 冷 水 病 菌 の 検 出
釣 菌 部 位 死 因 の 特 定 腎 臓 、 病 患 部 保 菌 検 査 エ ラ と 腎 臓 、 可 能 な ら 脳 も 加 え る 培 地 改 変 サ イ ト フ ァ ー ガ 培 地 を 用 い る 。 エ ラ の 場 合 は 、 雑 菌 の 繁 殖 を 制 御 す る た め に 、 ト ブ ラ マ イ シ ン 5μ g/mL を 添 加 し た 培 地 を 用 い る 。 培 地 原 料 は デ ィ フ コ 社 製 を 用 い る （ 血 清 は 添 加 し な い ）。 血 清 を 添 加 す る 場 合 は 明 記 す る 。 薬 剤 （ サ ル フ ァ 剤 ） 感 受 性 試 験 に は 、 血 清 添 加 培 地 は 用 い な い 。 培 養 温 度 18 ℃ と す る （ 腎 臓 や 脳 ）。 エ ラ や 病 患 部 か ら の 細 菌 分 離 で は 、 カ ビ や 雑 菌 が 繁 殖 し 、 保 菌 検 査 が 困 難 な こ と が 多 い た め 、 低 温 で 培 養 し 、 温 度 条 件 を 明 記 す る 培 養 菌 の 確 認 コ ロ ニ ー の 観 察 は 必 須 で あ り 黄 色 の コ ロ ニ ー を 形 成 す る 長 桿 菌 で あ る 。 菌 の 同 定 は PCR 法 （ 資 料 ２ ） に よ り 行 い 、 確 定 す る 。 ま た 、 抗 血 清 を 用 い た 凝 集 試 験 な ど は 検 査 者 の 手 慣 れ た 方 法 で 行 う 。 （ こ の 場 合 、 検 査 法 を 明 記 す る 。）資 料 2
PCR に よ る ア ユ 冷 水 病 診 断
新 た に 開 発 さ れ た ロ タ マ ー ゼ 遺 伝 子 群 に １ つ の PPIC（ peptidyl-prolyl cis-trans isomerase C） 遺 伝 子 を タ ー ゲ ッ ト と し た PCR（ 以 下 、 ロ タ マ ー ゼ 法 と 略 す ） が 陽 性 で あ る 場 合 を 確 定 と す る 。 ま た 、 必 要 に 応 じ て 遺 伝 子 型 分 け も 実 施 す る 。 本 タ ー ゲ ッ ト は Izumi ら (2003)が 発 見 し た 遺 伝 子 断 片 で あ り 、 吉 浦 ら (2006)が 同 定 し て 検 出 用 PCR を 改 良 し た 。 な お 、 従 来 の ２ つ の PCR に よ る 方 法 (下 記 の 方 法 １ 、 方 法 ２ ） や そ の 他 の PCR 等 も 診 断 に は 使 用 で き る が 、 菌 の 遺 伝 子 型 分 け に は 使 用 で き な い 。 テ ン プ レ ー ト （ 試 料 ） の 調 製 培 養 法 （ 資 料 １ ） に よ り 得 ら れ た コ ロ ニ ー を 用 い る 。 や む を え な い 場 合 に は 腎 臓 、 病 患 部 ま た は エ ラ を 検 体 と す る 。 こ の 場 合 、 200 µL の STE buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)を 加 え 、 ホ モ ジ ナ イ ズ す る （ エ ラ に つ い て は 別 記 の 方 法 で 洗 浄 濃 縮 液 を 試 料 と し て 用 い た 方 が 検 出 感 度 が 高 い ）。 コ ロ ニ ー 、 10 µL ホ モ ジ ネ ー ト ま た は エ ラ 洗 浄 濃 縮 液 を 、 300 µL 5%Chelex100 ま た は 300 µL TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0)と 混 合 55 ℃ 30 分 ま た は 5 ～ 10 秒 激 し く 撹 拌 5 ～ 10 秒 激 し く 撹 拌 95 ℃ 10 分 20 分 沸 騰 水 中 に 置 く 氷 中 2 分 遠 心 分 離 （ 10,000 G、 10 分 ） 遠 心 分 離 （ 10,000 G、 4 ℃ 、 3 分 ） ↓ 上 澄 み を テ ン プ レ ー ト と し て 使 用 す る （ テ ン プ レ ー ト は 4 ℃ で 保 存 可 ）。 ＊ DNA の 抽 出 に は 他 の 方 法 、 例 え ば 、 ISOGEN ま た は DAN 精 製 用 の カ ラ
ム （ QIAamp DNA Mini kit 等 ） を 用 い る 方 法 で も 可 。 ロ タ マ ー ゼ 法 ： 吉 浦 ら (2006) Ａ ） 増 幅 PCR 反 応 液 組 成 ： 20 µL テ ン プ レ ー ト 1 µL 10 x Ex Taq buffer 2 µL 2.5mM dNTPs Mixture 0.8 µL Forward Primer (10 µM)*1 1 µL Reverse Primer (10 µM)*2 1 µL Ex Taq (5 unit / µL)*3 0.1 µL 滅 菌 DW 14.1μL
*1: fpPPIC1F 5'-GTACCATGATACAGTCAGGTTTTTATACCA-3' 30 mer *2: fpPPIC1R 5'-GCGTTTTTAAATCCAACTCTTGCTTCG-3 27 mer
*3: Takara Ex Taq Hot Start Version (5 unit / µL) PCR 条 件 ① 95 ℃ １ 分 ② 次 を 35 回 95 ℃ 15 秒 、 60 ℃ 30 秒 、 72 ℃ 30 秒 ③ 終 了 後 は 4 ℃ で 保 持 （ オ プ シ ョ ン : 鋳 型 DNA サ ン プ ル が 薄 い と 予 想 さ れ る 場 合 は 、 40 サ イ ク ル ま で サ イ ク ル 数 を 増 や し て PCR 反 応 を 行 う 。） Ｂ ） PCR 増 幅 産 物 の チ ェ ッ ク 前 項 Ａ ）の PCR 後 の 反 応 液（ 3 µL）を 試 料 と し て 、3% ア ガ ロ ー ス ゲ ル を 用 い 、 定 電 圧 100 V、 25 分 間 の 条 件 で 電 気 泳 動 を 行 い 、 PCR 増 幅 産 物 の 有 無 を 確 認 す る 。 判 定 ： 346 bp の 増 幅 産 物 が 認 め ら れ た 場 合 、 陽 性 と す る （ 右 図 ）。 Ｃ ） PCR 増 幅 産 物 の 制 限 酵 素 処 理 制 限 酵 素 処 理 反 応 液 組 成 ： 10 µL PCR 反 応 液 （ 増 幅 産 物 が 十 分 量 あ る も の ） 5 µL 10 x H buffer（ Hinf I に 添 付 し て あ る も の ） 1 µL 制 限 酵 素 Hinf I (10 unit / µL) 0.2 µL 滅 菌 DW 3.8 µL 前 項 Ｂ ） で 十 分 量 の 増 幅 産 物 （ ハ ッ キ リ と し た バ ン ド ） が 確 認 で き た も の は 、 制 限 酵 素 Hinf I に よ る 増 幅 産 物 の 消 化 を 行 う 。 上 記 制 限 酵 素 処 理 反 応 液 を 調 整 し 、 37 ℃ で 2 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト す る 。（ 反 応 液 量 が 少 な い の で 、 汎 用 イ ン キ ュ ベ ー タ ー ま た は PCR 装 置 を 37 ℃ に 設 定 し て 使 用 す る 。 ウ ォ ー タ ー バ ス は 、 チ ュ ー ブ の フ タ 内 側 に 水 滴 が 付 い て 反 応 液 量 が 変 化 す る こ と に よ り 、 結 果 が 安 定 し な い 場 合 が あ る の で 、 な る べ く 使 用 し な い 。） Ｄ ） Hinf I 消 化 断 片 長 の 違 い に よ る 遺 伝 子 型 の 解 析 前 項 Ｃ ） で 作 製 し た 消 化 済 液 （ 3 µL） を 試 料 と し て 、 3%ア ガ ロ ー ス ゲ ル を 用 い 、定 電 圧 100 V で 30 分 間 電 気 泳 動 を 行 い 、 PCR 増 幅 産 物 の 消 化 断 片 長 と 種 類 を 確 認 す る 。 判 定 ： 63 bp, 129 bp, 154 bp の ３ つ の 断 片 が 認 め ら れ る 場 合 は 遺 伝 子 型 Ａ 、 192 bp, 154 bp の ２ つ の 断 片 が 認 め ら れ る 場 合 は 遺 伝 子 型 Ｂ と 判 定 す る （ 右 図 ）。 分 子量マー カ ー アユ 株 （ F P C 84 0） ギン ザ ケ 株 （N C IM B 19 47) 75 bp 222 bp 179 bp 126 bp 分 子量マー カ ー アユ 株 （ F P C 84 0） ギン ザ ケ 株 （N C IM B 19 4 7) 222 bp 179 bp 126 bp 396 bp 350 bp 3%アガロースゲル 346 bp
吉 浦 康 寿 ・ 釜 石 隆 ・ 中 易 千 早 ・ 乙 竹 充 (2006): Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase C 遺 伝 子 を 標 的 と し た PCR に よ る Flavobacterium psychrophilum の 判 別 と 遺 伝 子 型 . 魚 病 研 究 , 41 (2), 67-71. （ 別 記 ） エ ラ 洗 浄 濃 縮 液 の 作 り 方 エ ラ に 3 mL の PBS（ － ） を 加 え 、 30 秒 激 し く 撹 拌 ↓ エ ラ だ け を 取 り 出 す ↓ 遠 心 分 離 （ 500 G、 4 ℃ 、 10 分 ） ↓ 上 清 を 別 の チ ュ ー ブ に 移 す ↓ 遠 心 分 離 （ 10,000 G、 4 ℃ 、 10 分 ） ↓ 上 清 を 捨 て る ↓ 遠 心 分 離 産 物 を 50 µL の PBS（ － ） に 懸 濁 さ せ 、 10 µL を 試 料 と し て 用 い る ※ 10 尾 を プ ー ル し 、 1 検 体 と し て 分 析 可 能
従 来 の 方 法
方 法 １ ： Toyama et al. (1994) 1 回 目 の 増 幅 を 行 な う （ プ ラ イ マ ー は 20F と 1500R を 用 い る ） 容 器 中 に 以 下 の 溶 液 を 混 合 す る x10 PCR 緩 衝 液 1.00µL dNTP Mix (各 2.5 mM) 0.80 20F (10 µM) 1.00 1500R (10 µM) 1.00 Taq DNA ﾎﾟﾘﾒﾗｰｾﾞ 0.05 テ ン プ レ ー ト 2.00 DW 4.15 計 10.0 µLプ レ ヒ ー テ イ ン グ 94 ℃ 、 5 分 増 幅 は 30 回 熱 変 性 94 ℃ 、 30 秒 ア ニ ー リ ン グ 51 ℃ 、 90 秒 伸 張 72 ℃ 、 120 秒 最 終 サ イ ク ル 72 ℃ 、 5 分 終 了 後 は 4 ℃ で 保 持
1 回 目 の 増 幅 後 、 1/10 TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH8.0)で 5%に 稀 釈 し 、 2 回 目 の テ ン プ レ ー ト と す る 2 回 目 の 増 幅 を 行 な う （ プ ラ イ マ ー は PSY-1 と PSY-2 を 用 い る ） 容 器 中 に 以 下 の 溶 液 を 混 合 す る x10 PCR 緩 衝 液 2.00 µL dNTP Mix (各 2.5 mM) 1.60 PSY-1 (10 µM) 2.00 PSY-2 (10 µM) 2.00 Taq DNA ﾎﾟﾘﾒﾗｰｾﾞ 0.10 テ ン プ レ ー ト 4.00 DW 8.30 計 20.0 µL プ レ ヒ ー テ イ ン グ 94 ℃ 、 5 分 増 幅 は 30 回 熱 変 性 94 ℃ 、 30 秒 ア ニ ー リ ン グ 51 ℃ 、 90 秒 伸 張 72 ℃ 、 120 秒 最 終 サ イ ク ル 72 ℃ 、 5 分 終 了 後 は 4 ℃ で 保 持 プ ラ イ マ ー 20F ： 5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3' 1500R： 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' PSY-1： 5'-CGATCCTACTTGCGTAG-3' PSY-2： 5'-GTTGGCATCAACACACT-3'
Takashi Toyama, Kumiko kita-Tsukamoto and Hisatsugu Wakabayashi (1994): Identification of Cytophaga
方 法 ２ ： Izumi and Wakabayashi (2000） 増 幅 （ プ ラ イ マ ー は PSY-G1F と PSY-G1R を 用 い る ） 容 器 中 に 以 下 の 溶 液 を 混 合 す る x10 PCR 緩 衝 液 1.00 µL dNPT Mix(各 2.5 mM) 0.80 PSY-G1F(10 µM) 1.00 PSY-G1R(10 µM) 1.00 Taq DNA ﾎﾟﾘﾒﾗｰｾﾞ 0.05 テ ン プ レ ー ト 2.00 DW 4.15 計 10.0 µL プ レ ヒ ー テ イ ン グ 94 ℃ 、 5 分 増 幅 は 35 回 熱 変 性 94 ℃ 、 60 秒 ア ニ ー リ ン グ 56 ℃ 、 60 秒 伸 張 72 ℃ 、 120 秒 最 終 サ イ ク ル 72 ℃ 、 5 分 終 了 後 は 4 ℃ で 保 持 プ ラ イ マ ー PSY-G1F： 5'-TGCAGGAAATCTTACACTCG-3' PSY-G1R： 5'-GTTGCAATTACAATGTTGT-3'
Shotaro Izumi and Hisatsugu Wakabayashi (2000): Sequencing of gyrB and their application in the identification of Flavobacterium psychrophilum by PCR. Fish Pathology, 35(2), 93-94.
電 気 泳 動 1%ア ガ ロ ー ス 電 気 泳 動 で 産 物 を 検 出 す る 。 ア ガ ロ ー ス は ゲ ル 強 度 約 1,500 g / cm3 を 使 用 す る 7 ～ 8 V / cm で 約 30 分 間 通 電 す る 泳 動 用 サ ン プ ル ： 10 µL PCR 産 物 + 3 µL ト ラ ッ キ ン グ 色 素 液 （ マ ー カ ー と し て 宝 酒 造 の pHY マ ー カ ー （ #3404A） な ど を 使 用 す る ） ト ラ ッ キ ン グ 色 素 液 2% SDS 25% Ficoll
0.125% BPB 40 mM Tris-HCl 5 mM EDTA
（ ト ラ ッ キ ン グ 色 素 液 は 、 制 限 酵 素 購 入 等 の 際 に 付 属 し て く る も の で 良 い ）
泳 動 緩 衝 液 TAE buffer（ 40 mM Tris-Acetate, 1 mM EDTA, pH8.0
泳 動 後 、 エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ド で 染 色 し 、 UV (302 nm)透 過 光 で 観 察 ま た は 写 真 撮 影 。 判 定 ： 1,089bp（ 方 法 １ の 場 合 ） ま た は 1,017bp（ 方 法 ２ の 場 合 ） の 所 に 明 瞭 な バ ン ド が あ れ ば 陽 性 。
そ の 他 の PCR 等
下 記 の 論 文 に 、 上 記 以 外 の PCR 等 が 紹 介 さ れ て い る 。 PCRUrdaci, M. C., C. Chakroun, D. Faure and J. F. Bernardet (1998): Development of a polymerase chain reaction assay for identification and detection of the fish pathogen Flavobacterium psychrophilum.
Research in Microbiology, 149, 519-530.
del Cerro, A., I. Marquez and J. A. Guijarro (2002): Simultaneous detection of Aeromonas salmonicida,
Flavobacterium psychrophilum, and Yersinia ruckeri, three major fish pathogens, by multiplex PCR. Applied and Environmental Microbiology, 68, 5177-5180.
Ballarda, A., D. Faure and M. C. Urdaci (2002): Development and application of a nested PCR to monitor brood stock salmonid ovarian fluid and spleen for detection of the fish pathogen Flavobacterium
psychrophilum. Journal of Applied Microbiology, 92, 510-516.
定 量 PCR
del Cerro, A., M. C. Mendoza and J. A. Guijarro (2002): Usefulness of a TaqMan-based polymerase chain reaction assay for the detection of the fish pathogen Flavobacterium psychrophilum. Journal of Applied
Microbiology, 93, 149-156. LAMP 永 田 恵 里 奈 ・ 江 口 充 (2007): 環 境 水 に お け る ア ユ 冷 水 病 菌 Flavobacterium psychrophilum の 定 量 的 モ ニ タ リ ン グ . 日 本 水 産 学 会 誌 ， 73(2)， 306-309. 安 中 敏 光 ・ 小 島 禎 ・ 池 戸 正 成 ・ 吉 浦 康 寿 ( 2007) : LAMP 法 に よ る Flavobacterium psychrophilum（ 冷 水 病 菌 ） の 検 出 . 平 成 19 年 度 日 本 魚 病 学 会 講 演 要 旨 集 ， p49.
