骨 髄

81 6 金沢大 学十全医学会雑 誌 第8 9巻 第6号 81 6‑^{8 24 (1 98 0)}

ヒ ト骨 髄 ^の冷‡東保 存に関 す^る研 究

Ⅰ. 骨 髄 冷ⁱ東保存 条 件^に関 する基 礎 的検討

金沢 大学 医 学 部 第³ 内 科

石 野 千 津 子

( 昭和^{5 5}年^{1 1}月^{2 5 日}受付)

本論 文^の要 旨は第^{3 9}回 日本血液学 舎総会, 第^{2 5}回 日本 輸血学会 総会^にお^い て発表 し た^･

骨髄 抑制は悪 性 疾 患^の化 学 療 法や放 射 線 治 療を継 続 す る さ^い, 必 ず 遭遇す る重 大な問 題^であ り, そ^のた め にし ば し ば治療を中断せ ざ る を得な か^った り^, あ る^い は重 篤な合 併症^の発生を み るに いた る. し た が^{って こ} の骨 髄 抑 制を克 服でき れ ば, 現在よ り強 力な化学 療 法 が可 能^{と な り, し か}もよ り良 好な治 療 効 果を期 待 する こと も可 能^であ る^{. こ の} よ う な観 点か ら化 学 療 法お よ び放 射線 治 療^の結果も た ら さ れ る致 命 的な造 血 不 全に 対して_, 前 も^{っ て}冷 凍 保 存してお^いた 正常 造 血 能を有 する自 家骨 髄を投与 する と^いう治 療 方 法が考え ら れ る^{‖2 】}. こ の方法を臨床 的に応 用す る た め^には, まず冷 凍 保 存さ れ た骨 髄が解 凍後 移 植さ れ る場 合^に十 分な造 血機^{能を維 持し得る よ うに,種々 の角 度か ら冷 凍 保存,} 解 凍 条件を検 討し, 至適 条件を設 定 する必 要が あ る^.

骨 髄は形 態 的^にも機 能 的に も異な^っ た数 種 矯^の細 胞 群^によって構 成さ れて いる. 冷 凍 保 存 する骨 髄^の中^で 最も重要な細 胞は造 血 幹 細 胞^であ り, 骨 髄^の冷 凍 保 存

は造 血 幹 細 胞^の保 存^に他な ら ない. 造 血 幹 細 胞は機 能 的 単 位と し^て測 定可 能^であ る が, 形 態 学 的^には ま だ同 定さ れ^てお らず, 骨 髄 細 胞1 0^{4 〜} 1 0⁵ 個に1 個^の割 合

で存在 する といわ れ る^{3 )}. こ のよ う^に骨 髄^には造 血 幹 細 胞^の他に hete r oge n o u s c el l p^op^ulatio n s が存 在 す る た め に, 冷 凍 保 存^{し た}骨 髄^の生 存性^の判 定や至 適 条 件^の評 価が困 難^であ^った^. 生 存 性^の判 定^に は形 態 学 的 変 化, 色 素排 泄 試 験,

3H ^‑ thy mi d in の と り込み な ど が指 標と して利用さ れてき た. し か し な が ら, これ ら の方 法は必 ずし も造血 幹 細 胞と して の機 能を反 映し^て いる と はいえず, こ のた め至 適 冷 凍 保 存 条 件は研 究 者

によ^って異な^{って い}る^のが実 状^であっ た. 自 家 骨 髄 移 植が成 功 する た め^には, 解 凍 骨 髄 細 胞 中^の造 血 幹 細 胞 が移 植後た だ ち に生 者 する だ けでな く, 自己再 生, 分 化, 増殖という造 血 幹細 胞と して の機 能を維持し な け

Stud_y o n Cry^op^re s e r v atio n of H u m a n B one

O _{p t}im al Co nditio n fo r H e m op^oietic A ctivit y^.

れ ば な ら な^い. 近 年造 血 幹 細 胞^に関す る研 究は急 速^に 進 歩し, そ^の成 果と し^{て い}く^つかの成 熟 段 階^の異な る 造 血 幹 細 胞^の存 在が明ら か^にさ れ, その定量 的測 定 法 も確 立さ れ^{て い} る^{4 )}.多 能 性 幹細 胞 (^{C O}lo ny fo r ming u nitin sp l^{e e n} ,C F U ^‑ S) は赤 血 軋 白 血 球, 血小 板 に分化 する能 力を有し, 冷 凍 保 存骨 髄^の生 存 性^の判定

に は最も望ま し^い造 血 幹 細 胞^の定 量 的 測 定 法^であ る^ユ). し か し^{こ の} C F U ^‑ S 測 定 法は致 死 量照射^マ ウス にお け る脾コ ロ ^{ニ ー}形 成を利用 す る も^{の で}, ヒ ト ではこれ に相 当 する造 血 幹 細 胞^の測 定 法は ま だ確 立さ れて いな い. し た が^{っ て}, 七 卜骨 髄^の造 血 能を評 価す る に は顆 粒 球 系 前 駆 細 胞 (^{c o}lo ny fo r ming ^{u n}it in c ultu r e,

C F U ^‑ C) や赤 芽 球 系 前 駆 細 胞 (^{e r}y thr opoietin r e spo n siv e c olo ny fo r min g ^{u n}it_, C F U ‑ ^E ; e ry thr opoietin r e spo n siv e bu r st fo r ming u nit,

B F U ^‑ E) な どで測 定 する^のが最も 適当と 思 わ れ る^. こ こ では C F U ^‑ C を指 標と し^て, ヒ ト骨 髄 冷 凍 保 存^の

至 適 条 件を決 定 する た め^の基 礎 的 条 件, 即ち凍 害保 護 剤^の種 類と濃 度, 血 清 添加^の影 響, 細 胞 濃 度, 保存 期 間等に つい て検討を行^い, 臨床 的^に も 応用^でき る至 適 条件を設 定^でき たの で報 告 する^.

材 料お よ び方法 1) 骨 髄細胞

鉄 欠 乏性 賓 血^, 本 態性 血 小 板 減少 症, 寛解 期白 血 病 患 者, 鑑 別 診 断^のた め骨 髄 穿 刺を受け た非血 液疾 患^の 患 者^のう ち 正常な骨 髄 像を示す症例^を対 象と して, 胸 骨よ り 通常^の方 法^で骨 髄 穿 刺 液を 吸引し, これ を小試 験 管^に移して室 温 下で約1時 間 静 置 後,buffy c o at を 採 取し た. つぎ^に,こ のbuf fy c o at を M cCoy 5 A 培 養 液 (Gr a nd Isla nd Biologic al Co. G I B C O, Ne w

M a r r o w C ell. Ⅰ^. D ete r min atio n of the

Clliz uk o Ishiⁿ o, D ep^{a r}tm e nt of Inte r n al M ^{edicin e} (^m), K a n a z a w a U ni_{v e r s}i_{t y} Sch o ol of M ed icin e, K a n a z a w a ,J^ap^{a n ■}

Yo rk) ^で2 回 洗 浄し, 骨 髄 細胞 浮 遊 液^{と し た. 小} 郡は

コ ント^{ロ M} )L/( 冷 凍前) ^のC F U ‑ ^{C 測 定に用い, 残り}

を冷 凍保 存し た^. 2) C F U ‑ ^{C の}測定

C F U R ^{C の}測 定は P i ke & Rob in s o n^{5 }}の方 法^に準 じて行^った. 培 養 液は P i ke らの処 方^に従^{っ て},ア ミ ノ

酸や^どタ^ミンを添 加し た M cCoy 5 A 培 養 液^に牛 胎 児 血 清 (F C S, F lo w Lab. Sta nm o r e, N. S. W .

Au str a ria) を 1 5 % 加え た も^のをplatin g ^{m e}d iu m と し^て用^いた^. こ の Platin g m ed iu m に寒 天 (Ba cto age r,D I F C O Lab.Detr oi t M ich iga n) を 0^.5 % 加え,

さ ら に正 常^ヒト末梢 血よ り得た白 血 球を 1 ^× 1 0⁸/･^氾エ

と な る よ うに添加 調 整し, こ の1Inエを35 m mの組 織 培 養 皿(Falc o n ♯30 0 1 C A) に分 注してfe ederlaye r を 作 製し た. 新鮮 骨 髄 細 胞あ る^い は解 凍 骨 髄 細 胞^は,

0^.3%寒 天を含む_plating ^{m e}d iu m に 2 ^×1 0⁵/ mL t な る よ う に調 整し, その1 m ほ feede r lay er に重 層し

0 V e r laye r と し た. 培 養は triplic ate で 3 7 ℃,

7^.5 % C O2^,1 0 0 % 湿 度^の条 件 下^で1 4 日間 行^いt 培 養終 了 後 倒立 顕 微鏡 下^で50 個以上の細 胞か ら な る ^{コ ロ ニ ー}

を算 定し た^. 冷 凍 保 存 前 後^の 検 討は同 ^〜 の fe eder laye rも し く は同^一 人^の末 梢 白 血球に て作成し た もの

を用^いた.

3) 凍 害 保 護 液

凍害 保 護 剤^{は グ リセリン} ( 和 光純 薬, 東京) お よ び d im ethyl s ulfo xi de(D M S O 和光) を用^い,

L^{M cCoy}

5 A 培 養 液^に種^{々 の}濃 度^のグ リ^セリ^ンま た は D M S O を 使用 直 前^に加え^て凍 害 保 護 液を作 製し た^.

4) 冷 凍 保 存 方 法

細 胞 数を 2 ^× 10⁷/ mいこ調 整し た骨 髄 細 胞 浮 遊 液に グ リ^セリ^ンま た は D M S O を そ れ ぞ れ 1 0 % ,20% ,30 % 含 む凍 害 保 護 液を等 量, 緩 徐^に加え凍 害 保 護 剤^の最 終 濃 度が 5 % ^,1 0 %,1 5 % と な る よ うにし た^. これ を 1 山 づ っ

凍結 保 存^{チ ュ ー} ブ(Nu n c,N ^‑ 1 0 7 6 ‑ ^{1 De n m a rk})

に分 注し, プ^ロ グラム フリ ^ー ザ ^ー ( 荏 原 製 作 所P F 2 2,

東京)^に静 置し‑ 1 ^℃/min の冷 却 速 度^{で ‑} 7 0 ℃ まで

緩 速 冷 凍^を行^い, た だ ちに液体 窒 素 申 (‑ 1 9 6 ℃) に

保 存し た^. 5) 解 凍

解 凍は 4 0 ℃^の恒 温槽で急 速 解 凍によ^って行^った^.原 則と して保 存 後7 日 か ら30 日 まで の間に解 凍し,

一 部

は保 存 期 間^の影響をみる た めに_, さ らに長 期 間 保 存し た^.

6) 洗 浄 方法

M cC^oy 5 A 培 養 液をでき る だ け ゆ^っ く り加え,1 0 倍 以上^に希 釈し, 2回 遠心洗 浄を行^った後 細 胞数を算定し

細 胞 回 収率を求め, さ らにC F U ^‑ C 測定を行^っ た^.同 時に0 .25 % try pa n b lu e を用^い, 色 素排 泄 試 験^によ る 生 存性, ギムザ染 色^によ る形 態 学 的変 化も検 討し た^.

成 繚

1) 凍 害 保 護 剤^の細 胞 毒 性

グ リ^セリ^ン, D M S O な ど凍 害 保護 剤は細 胞 毒性^のな い こと が 望 ま しい の で^{8 )}, C F U ^‑ C に対す る影響を検 討し た.Ov e rlaye r 中にグ リ^セリ^ンは 0.5,1.0, 2.0,

8^.0 ‰ D M S O は 8.2, 0^.5,1^.0^,2^.0, 5^.0 % と な る よ うに添 加し, グ リ^セリ^ンあ る^いは D M S O ^の 存 在 下^で C F U ^‑ C測 定 を行^っ た. その成績は図1 ^に示さ れ る よ うに , グ リ^セリ^ン, D M S O は ともに濃 度 依 存 性に in Vitr o コ ロ ^{ニ ー} 形 成を抑 制し た^. グ リセリ^ンは 1 % で コ ロ ニ ^ー 形成 抑 制 率は30% ,5 % ^で抑 制 率は 8 0 % と な り,

グ リセリ^ン8% 以上^の存 在 下^{でコ ロ ニ ー} 形 成は全く み ら れ な か ^った^. ま た D M S O が 0^.5 % 存在 する と^{コ ロ ニ}

ー形 成 抑制率^{は30% であ}り. 1 % では抑制 率 63% と な り, D M S O 2% 以 上では^{コ ロ ニ ー} 形 成は全 く 認め な か

っ た. 以上^の結 果よ り以 下^の実 験では凍 害 保 護剤を除 去 する た め^に解 凍骨 髄 細 胞は洗 浄を行うことに し た^.

2) 形 態 学 的変 化

図 2 は凍結 保 存前 後^の骨 髄 細 胞^のギ^ムザ染 色標 本^で あ る^. 解凍骨 髄^の染色 標 本^で特 徴 的なこと は成熟 好 中 球は著 明な減 少^を示し, 形 態 的に分類 不 能^の細 胞が著 し く増 加し た^{. こ}れ ら^の細 胞は変 性^によ り細 胞 質を失

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No. of C F U ^･C (^te st)

( ト 転 売 所 百石て^さ嘉i･扇｢^{) ×1 0 0}

図1 C_{y t}ot_{o x}ic effe ct of c ryop^{r o}t_{e c}tiv e age nts O n gr an ulo cy te pr oge nito r c ells(C F U^‑C)

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った核 幻 影と言わ れ る も^のと考え ら れ る. 残 存して い る顆 粒 球も核お よ び細胞 質^の膨 化, あ る^いは核 濃 縮,

細 胞 質^の脱 顆 粒が み ら れ た^. 好 中球^に比^べて好 酸 球,

好 塩 基 球の顆 粒 球は比 較 的よ く保た れて いた.

一 方 赤

芽球や リ^{ン パ}球は 以上^のよ う な変 化が少な く, その形 態 学 的 特 徴を か な り保 持して いた. 表1 は冷 凍 保 存 前 後^の骨 髄細 胞^の百 分 率を 1 0 例^の平 均 値で示し た も^の

であ る が. 未 熟お よ び成 熟 顆 粒 球^の著 滅が 認 め ら れ る

野

の に対し^て赤 芽 球お よ び リ^{ン パ}球^の比率は変 化を示さ ず^{, 一}方 形 態 学 的^に分類 不能と判 断さ れ る細 胞は 42 .4

±1 7^.4 % と高 率^にみ ら れ た^. 3) 凍 害保護 剤の影 響

グリ セリ^ンお よ び D M S O ^の各 濃 度 (5 ^〜 1 5 % ) で骨 髄 細 胞を冷 凍保 存し た場 合^の生 存 性, 細 胞 回 収 率,

C F U M ^C 回 収 率を表2 ^に示し た^.try p^{a n} b lu e 色 素排 泄 試 験^によ る生 存 性は グ リセリ ン各 濃 度, D M S O 各濃

図2 G ie m s a^‑Stain ed s m e a r s of bo n e m a r r o w c ells fr e sh o n e sin the left _{a n}d f^{r o z e n･} tha w ed o n e^'s in the righ^t(^×4 0 0)

Tab lel^. C ha nge sin di ffe r e ntials of bo n e m a r r o w c ellsbefo r e a nd ^afte rfr e e zing D iffe r e ntials( % ) Ty pe ofc ell

Ery thr obla sts

Im m atu r e g^{r a n u}lo cy te s

Matu r e gr a n ulo cy te s

L_ym pho cy te s

Un cla s si負ed

2 4^.8^±4.3 2 1.3^±7.9 24.6±4^.9 21^.8^±1 1^.1

0

2 4.9^±1 4.3 4.8^{± 4}.9 3^.1 ±4^.0 21.4 土 12.2 4 2.4^±1 7.4 Ea chv alu e r epr e s e ntsthe m e a n ±_st_{a n}da rd d^{e v}iatio nin l O e xp^{e r}im e nts.