その応用利用 百日咳菌が産生する物質の探索と

百 日 咳 菌 が産 生 する 物 質 の 探 索 と その応 用 利 用

北 里 大 学 大 学 院 感 染 制 御 科 学 府 感 染 制 御 科 学 専 攻

感 染 制 御 ・免 疫 学 履 修 コース 免 疫 機 能 制 御 科 学

DI-

目 次

緒 言 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 3

1. 百 日 咳 菌 が 分 泌 す る 黄 色 色 素 の 同 定 と そ の 役 割 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 5 1.1. 材 料 お よ び 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 7 1.2. 結 果 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 21 1.3. 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 24

2. 百 日 咳 の 新 規 診 断 用 抗 原 の 探 索 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 47 2.1. 材 料 お よ び 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 49 2.2. 結 果 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 55 2.3. 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 56

結 論 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 65

謝 辞 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 67

引 用 文 献 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 68

緒 言

百 日 咳 菌 は グ ラ ム 陰 性 の 短 桿 菌 で あ り 、 百 日 咳 の 起 因 菌 と し て 知 ら れ て い る 。 百 日 咳 の 主 症 状 で あ る 痙 れ ん 性 の 咳 症 状 は 、 治 療 を 受 け な か っ た 場 合 、 2 ～ 3 ヶ 月 間 と い う 長 期 に わ た り 続 く こ と も あ る 。 ま た そ の 伝 染 力 は 強 く 、 免 疫 の な い 家 族 内 接 触 者 、 特 に ワ ク チ ン 未 接 種 の 乳 児 で は 90 ％ 以 上 に 伝 染 す る [ WHO, 2005.] 。 生 後 6 ヶ 月 以 下 の 乳 児 が 発 症 す る と 、 肺 炎 や 脳 症 の 合 併 症 な ど に よ っ て 死 に 至 る こ と も あ る [Greenberg DP , 2005.] 。 百 日 咳 菌 は 免 疫 細 胞 障 害 作 用 を 示 す 百 日 咳 毒 素 (PT) や 宿 主 へ の 付 着 に 関 与 す る 繊 維 状 赤 血 球 凝 集 素 ( FHA)な ど 様 々 な 病 原 因 子 を 産 生 す る こ と が 知 ら れ て い る も の の 、 咳 発 作 の 発 症 メ カ ニ ズ ム に つ い て は 未 だ 不 明 で あ る 。 ま た 、 PT や FHA は 百 日 咳 ワ ク チ ン の 主 要 構 成 成 分 で あ り 、 百 日 咳 の 診 断 用 抗 原 と し て も 使 用 さ れ て い る 。 し か し 、 感 染 防 御 免 疫 に お け る 標 的 抗 原 に つ い て は 未 だ 同 定 さ れ て い な い も の も あ り 、 未 知 な 部 分 が 存 在 す る 。 百 日 咳 菌 が 産 生 す る 既 知 物 質 に 関 し て は 多 面 的 な 解 析 が 行 わ れ て い る こ と を 考 え る と 、 百 日 咳 菌 が 産 生 す る 未 同 定 物 質 が 、 咳 を 含 め た 病 原 性 発 現 や 感 染 防 御 免 疫 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 高 い と 考 え ら れ た 。 そ こ で 本 研 究 で は 、 百 日 咳 菌 が 産 生 す る 未 同 定 物 質 を 探 索 し 、 そ の 機 能 や 応 用 利 用 の 可 能 性 を 考 察 し た 。

百 日 咳 菌 が 産 生 す る 低 分 子 量 物 質 に つ い て は シ デ ロ フ ォ ア を 除 き ほ と ん ど 研 究 が さ れ て お ら ず 、 新 た な 探 索 と 得 ら れ る 知 見 の 積 み 重 ね が 重 要 で あ る と 考 え ら れ る 。 病 原 性 を 示 す 百 日 咳 菌 を 培 養 す る と 、 そ の 培 養 上 清 は 鮮 や か な 黄 色 を 呈 す る こ と が 知 ら れ て い る 。 細 菌 が 分 泌 す る 色 素 は 病 原 性 に 関 与 す る こ と が 知 ら れ て い る [Liu GY, 2009; Venil CK, 2013.] 。 例 え ば 緑 膿 菌 が 分 泌 す る 青 緑 色 色 素 で あ る ピ オ シ ア ニ ン は 、 バ イ オ フ ィ ル ム 形 成 促 進 作 用 な ど を 有 す る こ と が 知 ら れ て い る

[Kanthakumar K , 1993; Costa KC, 2017.] 。 ま た 、 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 は 、 抗 酸 化 作 用 を 持 つ ス タ フ ィ ロ キ サ ン チ ン と い う 黄 色 色 素 を 分 泌 す る [ Liu GY , 2005; Pelz A , 2005.] 。 し か し 、 百 日 咳 菌 に 関 し て は 黄 色 色 素 を 分

泌 す る こ と は 知 ら れ て い た も の の 、 こ の 色 素 に 関 す る 詳 細 な 研 究 は 行 わ れ て こ な か っ た 。 そ こ で 、 百 日 咳 菌 が 分 泌 す る 色 素 の 同 定 と そ の 機 能 の 解 明 を 目 指 し 、 研 究 を 開 始 し た 。

百 日 咳 菌 の 高 分 子 量 産 生 物 質 の 解 析 に お い て は 、 直 接 的 生 理 活 性 を 有 す る タ ン パ ク 質 毒 素 な ど の 研 究 が 主 と し て 進 め ら れ て き た 。 現 在 の 血 清 学 的 診 断 法 に お い て は 、 ワ ク チ ン 抗 原 で あ る PT と FHA が 診 断 用 抗 原 と し て 使 用 さ れ て い る た め 、 ワ ク チ ン 接 種 後 の 免 疫 と 感 染 に よ る 免 疫 の 区 別 が 付 か な い と い う 問 題 が あ る 。 こ の こ と は 、 ワ ク チ ン 接 種 者 に お け る 百 日 咳 の 診 断 を 困 難 に す る 要 因 と な る 。 そ こ で 、 百 日 咳 患 者 血 清 が 認 識 す る P T、 FHA 以 外 の 百 日 咳 菌 産 生 タ ン パ ク 質 を 探 索 し 、 診 断 用 抗 原 と し て の 可 能 性 を 考 察 し た 。

1. 百 日 咳 菌 が 分 泌 す る 黄 色 色 素 の 同 定 と そ の 役 割

細 菌 が 分 泌 す る 色 素 は 、 バ イ オ フ ィ ル ム 形 成 促 進 作 用 や 酸 化 ス ト レ ス 抵 抗 性 な ど を 示 す こ と が 知 ら れ て お り [ Hassett DJ , 1992;

Kanthakumar K , 1993 ; Costa KC, 2017.] 、 細 菌 の 病 原 性 に 関 与 す る こ と も 多 い [Liu GY, 2009; Venil CK, 2013.] 。 一 方 、 百 日 咳 菌 の 培 養 上 清 は 鮮 や か な 黄 色 を 示 す こ と か ら 、 百 日 咳 菌 は 黄 色 の 色 素 を 菌 体 外 へ 分 泌 す る と 考 え ら れ て き た ( Fig 1)。 ま ず 、 研 究 で 広 く 使 用 さ れ て い る 百 日 咳 菌 東 浜 株 の 培 養 上 清 か ら 黄 色 色 素 を 抽 出 し 、 そ の 同 定 を 試 み た 。 そ の 結 果 、 百 日 咳 菌 東 浜 株 培 養 上 清 中 か ら 黄 色 を 示 す リ ボ フ ラ ビ ン と ル ミ ク ロ ム が 検 出 さ れ た 。 本 研 究 で は 、 培 養 上 清 中 に ド ミ ナ ン ト に 分 泌 さ れ て い た リ ボ フ ラ ビ ン の 役 割 を 解 明 す べ く 研 究 を 行 っ た 。 近 年 、 病 原 因 子 の ジ ェ ノ タ イ プ や フ ェ ノ タ イ プ の 変 異 し た 百 日 咳 菌 に よ る 百 日 咳 の 流 行 が 報 告 さ れ て い る こ と か ら [齋 籐 、 2 012 ; Moriuchi T , 2017.] 、 新 鮮 分 離 株 に お い て も リ ボ フ ラ ビ ン が 分 泌 さ れ て い る か 確 認 し た 。Bordetella 属 細 菌 は 様 々 な 病 原 因 子 を 産 生 す る が 、 そ の 中 に は 、 菌 種 特 異 的 に 産 生 さ れ る も の も 知 ら れ て い る 。 例 え ば 、 免 疫 細 胞 障 害 作 用 を 持 つ PT は 、 百 日 咳 菌 の み が 産 生 能 を 有 し 、 他 の Bordetella 属 細 菌 は 産 生 し な い [Gerlach G, 2001 ; Dorji D , 2017 .]。 そ こ で 、 リ ボ フ ラ ビ ン の 分 泌 が 百 日 咳 菌 に 特 異 な 現 象 な の か を 調 べ る た め に 、 百 日 咳 菌 を 含 め た

Bordetella 属 4 菌 種 に お け る リ ボ フ ラ ビ ン 分 泌 の 有 無 を 調 べ る こ と と し た 。

次 に、リボフラ ビンの作 用 を 推 察 するた めにも 百 日 咳 菌 の各 増 殖 段 階 におけるリ ボフラ ビン分 泌 状 況 を 調 べる必 要 があると考 え 、培 養 上 清 中 のリボフラ ビン量 を 経 時 的 に調 べた 。また 、植 物 共 生 細 菌 の 一 種 で あ る ア ル フ ァ ル フ ァ 根 粒 菌 に お い て 、 菌 体 外 に 分 泌 さ れ た リ ボ フ ラ ビ ン が 菌 の 増 殖 お よ び 宿 主 へ の 定 着 を 促 進 す る と い う 報 告 が あ る [ Yang G , 2002.] こ と か ら 、 百 日 咳 菌 に お い て も 培 養 上 清 中 に 分 泌 さ れ た リ ボ フ ラ ビ ン が 、 菌 の 増 殖 や 宿 主 へ の 定 着 に 影 響 を お よ ぼ し て い る 可 能 性 が あ る と 考 え ら れ た 。 そ こ

で 、 リ ボ フ ラ ビ ン が 百 日 咳 菌 の 増 殖 に お よ ぼ す 影 響 を 調 べ た 。 さ ら に 、 リ ボ フ ラ ビ ン の 阻 害 剤 と し て 報 告 さ れ て い る ル ミ フ ラ ビ ン [Kearney EB, 1952; Becvar J, 1982; Plantinga A, 2011.] が 百 日 咳 菌 の 宿 主 細 胞 へ の 付 着 に お よ ぼ す 影 響 を 調 べ 、 次 い で 、 マ ウ ス モ デ ル を 使 用 し 、 ル ミ フ ラ ビ ン が in vivo に おける 百 日 咳 菌 の 定 着 におよ ぼす影 響 を 調 べた 。

最 後 に 、 リ ボ フ ラ ビ ン 添 加 に よ っ て 産 生 量 に 影 響 を 受 け る タ ン パ ク 質 が 存 在 し た 場 合 、 そ の タ ン パ ク 質 は リ ボ フ ラ ビ ン の 作 用 に 関 与 し て い る 可 能 性 が あ る と 考 え 、 リ ボ フ ラ ビ ン の 分 子 的 な 作 用 メ カ ニ ズ ム 解 明 の 手 掛 か り を 得 る べ く 、 リ ボ フ ラ ビ ン 添 加 に よ る 菌 体 タ ン パ ク 質 プ ロ フ ァ イ ル の 変 化 を 調 べ た 。

1.1. 材 料 お よ び 方 法 1.1.1. 試 薬

標 品 と し て 使 用 し た リ ボ フ ラ ビ ン と ル ミ ク ロ ム お よ び ル ミ フ ラ ビ ン は 、 そ れ ぞ れ ナ カ ラ イ テ ス ク （ 京 都 ） と 東 京 化 成 工 業 （ 埼 玉 ） お よ び Santa cruz biotechnology ( Dallas, TX , USA) か ら 購 入 し た 。

1.1.2. 菌 株

百 日 咳 菌 の 標 準 株 と し て 広 く 使 用 さ れ て い る 東 浜 株 Ⅰ 相 菌 (B.

pertussis TohamaI) を 使 用 し た [Kasuga T, 1953.]。 一 方 、 新 鮮 分 離 野 外 株 と し て 2010 年 に 関 東 地 方 で 分 離 さ れ た 代 表 的 な 百 日 咳 菌 臨 床 分 離 株 を ２ 株 使 用 し た ( Table 1) 。 SK2 株 は パ ー タ ク チ ン （ 付 着 因 子 ） 非 産 生 株 で あ り 、 S K 3 株 は 百 日 咳 毒 素 と パ ー タ ク チ ン の ジ ェ ノ タ イ プ が 東 浜 株 と 異 な っ て い た ( Table 1) 。 百 日 咳 菌 以 外 の Bordetella 属 細 菌 と し て 、 ヒ ト に 感 染 し て 百 日 咳 を 起 こ す パ ラ 百 日 咳 菌 12822 株 (B.

parapertussis 12822)[ Kasuga T , 1953; Heininger U , 2002.] 、 お よ び B. holmesii ATCC51541 [Weyant RS, 1995.] を 使 用 し た 。 ま た 、 動 物 に 感 染 し 、 気 管 支 炎 な ど を 起 こ す Bordetella 属 細 菌 と し て 気 管 支 敗 血 症 菌 RB50 株 (B. bronchiseptica RB50)[Cotter PA , 1994.]を 使 用 し た 。

1.1.3. 培 地

平 板 培 地 と し て Bordet - Gengou 寒 天 培 地 (BG 培 地 ) お よ び メ チ ル 化 β サ イ ク ロ デ キ ス ト リ ン 寒 天 培 地 (MCD 寒 天 培 地 ) を 使 用 し た 。 液 体 培 地 と し て Stainer- Scholte 培 地 (S/S 培 地 )を 使 用 し た 。 調 製 法 は 、 以 下 に 示 し た 。

1.1.3.1 B G 培 地

1% ( w/v ) グ リ セ ロ ー ル 水 500 mL に Bordet -Gengou Agar Base (BD, Franklin Lakes , NJ, USA)15 g を 懸 濁 し た 。 そ の 後 、 121 ℃

で 15 分 間 、 高 圧 蒸 気 滅 菌 し 、 51℃ ま で 放 冷 後 、 緬 羊 脱 繊 維 素 血 液 (日 本 バ イ オ テ ス ト 研 究 所 ま た は 日 本 生 物 材 料 セ ン タ ー 、 い ず れ も 東 京 )75 mL を 加 え 混 和 し た 。 そ の 後 、 シ ャ ー レ に 注 ぎ 、 平 板 培 地 と し て 製 し た 。

1.1.3.2. S/S 培 地

Table 2 の 通 り 成 分 を 混 合 し 、 12 1 ℃ で 15 分 間 、 高 圧 蒸 気 滅 菌 し た 。 使 用 直 前 に Supplement ( Table 3) を 最 終 濃 度 1% (v/v) と な る よ う に 加 え た 。

1.1.3.3 . MCD 寒 天 培 地

Table 4 の 通 り 成 分 を 混 合 し 、 12 1 ℃ で 15 分 間 、 高 圧 蒸 気 滅 菌 し た 。 51℃ ま で 放 冷 後 、 S upplement (Table 4)を 最 終 濃 度 が 1% ( v/v )と な る よ う に 加 え た 。 さ ら に 、 0.22 µ m PVDF フ ィ ル タ ー (Merck

Millipore )で ろ 過 滅 菌 し た 20% ( w/v ) メ チ ル 化 β サ イ ク ロ デ キ ス ト リ ン ( 東 京 化 成 工 業 )溶 液 を 最 終 濃 度 が 2 mg/mL と な る よ う に 加 え 、 平 板 培 地 と し て 製 し た 。

1.1.4. シ ー ド 菌 液 の 培 養

百 日 咳 菌 を B G 培 地 に 塗 抹 し て 、 36.5 ℃ で 4 日 間 培 養 し た 。 β 溶 血 を 示 す 真 珠 様 コ ロ ニ ー を 釣 菌 し 、 BG 培 地 上 に 塗 布 し て 、 36.5 ℃ で 1 日 間 増 菌 培 養 し た 。 培 地 上 に 増 殖 し た 百 日 咳 菌 を 滅 菌 綿 棒 で 集 菌 し 、 1× 10⁹ cells/mL と な る よ う S / S 培 地 に 懸 濁 し た 後 、 3 6.5℃ で 約 24 時 間 、 振 と う 培 養 (185 r pm, 36.5 ℃ ) し た 。 培 養 容 器 と し て 50 mL バ イ オ リ ア ク タ ー チ ュ ー ブ (T PP, Trasadingen , Switzerland ) を 用 い 、 培 養 容 量 は 20 mL/tube と し た 。

1.1.5. 黄 色 色 素 の 抽 出

S/S 培 地 に 2 ×10⁹ cells/mL と な る よ う シ ー ド 菌 液 を 植 菌

後 、 36.5 ℃ で 1 ～ 7 日 間 静 置 培 養 し た 。 培 養 容 器 は ガ ラ ス 大 ル ー 瓶 を 使 用 し 、 培 養 容 量 は 、 250 mL/flask と し た 。 得 ら れ た 培 養 液 を 遠 心

（ 13,400× ɡ , 3 0 min, 4 ℃ ） 後 、 上 清 を 回 収 し 、 孔 径 0.2 µm の ポ リ エ ー テ ル ス ル ホ ン (P ES) 膜 ( TPP) で 、 ろ 過 滅 菌 し た 。 得 ら れ た 非 感 染 性 上 清 を 、 あ ら か じ め メ タ ノ ー ル 3 m L と MilliQ 水 3 mL で コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ し た Sep- Pak C 1 8 （ 充 填 剤 量 , 360 mg; カ ラ ム 容 量 , 0.7 mL; Waters, Milford , MA, USA ） 固 相 抽 出 カ ラ ム に 通 し た 。 上 清 を 通 し た カ ラ ム を 3 mL の MilliQ 水 で 洗 浄 後 、 0.002 ％ (v/v) 塩 酸 メ タ ノ ー ル で 溶 出 し 、 色 素 粗 画 分 を 得 た 。

1.1.6. High perfor mance liquid chromatography (HPLC )

前 項 の 方 法 に 従 っ て 得 ら れ た 色 素 粗 画 分 を 溶 媒 濃 縮 装 置

(Soltra mini , テ ク ノ シ グ マ , 岡 山 )で 乾 固 後 、 MilliQ 水 で 乾 固 物 を 溶 解 さ せ HPLC に 供 し た 。 HPLC に は 、 Symmetry C 18 カ ラ ム (2.1 ×150 mm, 粒 子 径 : 3.5 µm; Waters )を 接 続 し た Agilent 1100, 1200 シ リ ー ズ シ ス テ ム (Agilent Technologies , Santa Clara , MA, USA)を 使 用 し た 。 移 動 相 と し て 、 ア セ ト ニ ト リ ル と 0.05 ％ ( w/v ) リ ン 酸 含 有 MilliQ 水 を 使 用 し 、 流 速 0.2 mL/min で ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を 行 っ た 。 リ ニ ア グ ラ ジ エ ン ト 溶 出 ( ア セ ト ニ ト リ ル 5 → 100 %, 2 0 min , 室 温 )に よ っ て カ ラ ム に 吸 着 し た 物 質 を 分 離 し た 。

1.1.7. 紫 外 可 視 吸 収 ス ペ ク ト ル 測 定

紫 外 可 視 吸 収 ス ペ ク ト ル は 、 HPLC シ ス テ ム に 接 続 し た フ ォ ト ダ イ オ ー ド ア レ イ 検 出 器 ( Waters)で 測 定 し た 。

1.1.8. 質 量 分 析 ( L C- ESI -MS)

LC-ES I- MS は 、 Inertsil ODS -4 カ ラ ム （ 3.0 ×250 mm; GL Sciences, 東 京 ） を 接 続 し た Agilent 1200 シ リ ー ズ シ ス テ ム (Agilent ) と AB Sciex QSTAR Hybrid LC/MS/MS シ ス テ ム ( AB Sciex , Framingham , MA , USA ) を 使 用 し た 。 移 動 相 は 、 1 .5 ％ ( w/v )酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム 水 溶 液

と 1.5 ％ ( w/v) 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム - メ タ ノ ー ル 溶 液 を 使 用 し た 。 リ ニ ア グ ラ ジ エ ン ト 溶 出 は 、 流 速 を 0.5 mL/min と し 、 30 分 か け て 酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム メ タ ノ ー ル 溶 液 の 割 合 が 5 ～ 100 ％ (v/v )と な る よ う 設 定 し た 。 ま た 、 カ ラ ム 温 度 は 40℃ と し た 。 ス ペ ク ト ル デ ー タ は 、 フ ォ ト ダ イ オ ー ド ア レ イ 検 出 器 で 検 出 し た 。 フ ラ グ メ ン ン テ ー シ ョ ン は 、 質 量 -電 荷 比 (m/z)の 検 出 範 囲 が 100～ 2,000 Da の 範 囲 で 記 録 し た 。 そ の 他 の パ ラ メ ー タ ー は イ オ ン ス プ レ ー 電 圧 , 5500 V; ソ ー ス ガ ス 流 量 , 50 L/min;

カ ー テ ン ガ ス 流 量 , 3 0 L/min; デ ク ラ ス タ リ ン グ ポ テ ン シ ャ ル , 50 V;

フ ォ ー カ シ ン グ ポ テ ン シ ャ ル , 250 V; 温 度 , 450 ℃ ; コ ー ン 電 圧 , 2 0、 3 5 お よ び 50 V と し た 。

1.1.9. 黄 色 色 素 の 同 定

百 日 咳 菌 の 培 養 上 清 か ら 得 ら れ た 色 素 粗 画 分 を 、 Section 1.1.6 の 通 り HPLC で 分 離 し た 。 O D21 0で 溶 出 物 質 を モ ニ タ ー し 、 黄 色 物 質 の ピ ー ク に 含 ま れ る 物 質 を 、 紫 外 ・ 可 視 吸 収 ス ペ ク ト ル 測 定 お よ び 質 量 分 析 に 供 し た 。

紫 外 ・ 可 視 吸 収 ス ペ ク ト ル 測 定 と 質 量 分 析 の 結 果 を も と に デ ー タ ベ ー ス （ Dictionary of Natural Products; Chapman and Hall , London, U K ） 検 索 を 行 い 、 黄 色 色 素 の 候 補 物 質 を 抽 出 し た 。 そ の 後 、 デ ー タ ベ ー ス 検 索 で ヒ ッ ト し た 化 合 物 の 高 純 度 標 品 を 入 手 し 、 HPLC に お け る 保 持 時 間 、 紫 外 ・ 可 視 極 大 吸 収 波 長 、 お よ び 分 子 量 を 百 日 咳 菌 の 分 泌 し た 黄 色 色 素 と 比 較 し た 。

1.1.10. 黄 色 色 素 の 定 量

黄 色 色 素 の 分 泌 量 は 、 濃 度 既 知 の 標 品 と ク ロ マ ト グ ラ ム に お け る ピ ー ク 面 積 を 比 較 し て 算 出 し た 。 ま た 、 菌 体 あ た り の リ ボ フ ラ ビ ン 分 泌 量 は 、 培 養 上 清 中 の リ ボ フ ラ ビ ン 量 を 培 養 液 中 の 総 菌 数 で 割 る こ と で 求 め た 。 培 養 液 中 の 総 菌 数 は 、 培 養 液 の OD6 5 0 値 か ら 算 出 し た 。

1.1.11. リ ボ フ ラ ビ ン 添 加 培 地 で の 培 養

リ ボ フ ラ ビ ン 添 加 培 地 で 百 日 咳 菌 東 浜 株 を 培 養 し た 。 シ ー ド 菌 液 （ OD6 50： 0.3 ～ 0.5 ） を 、 菌 の 最 終 濃 度 が 0.01×10⁹ cells/mL ま た は 0.1× 10⁹ cells/mL と な る よ う に 植 菌 し 、 36.5 ℃ で 7 日 間 振 と う

（ 200 rpm ） 培 養 し た 。 培 養 液 の O D6 50 を 経 時 的 に 測 定 し た （ 層 長 16 mm, miniphoto 5 18R, TAITEC , 埼 玉 ） 。

1.1.12. ル ミ フ ラ ビ ン 添 加 培 地 で の 培 養

リ ボ フ ラ ビ ン の 阻 害 剤 で あ る ル ミ フ ラ ビ ン を 10 µg/mL と な る よ う に 培 地 中 に 添 加 し 、 百 日 咳 菌 を 培 養 し た 。 シ ー ド 菌 液 （ OD6 50： 0.3

～ 0.5 ） を 、 菌 の 濃 度 が 0.01 × 10⁹ cells/mL と な る よ う に ル ミ フ ラ ビ ン 添 加 培 地 へ 植 菌 し た 。 植 菌 後 、 36.5 ℃ で 4 日 間 振 と う （ 200 rpm ） 培 養 し て 得 ら れ た 培 養 液 の OD65 0を 測 定 （ 層 長 16 m m, miniphoto 518R, TAITEC ） し た 。

1.1.13. 細 胞 付 着 性 試 験

細 胞 付 着 性 試 験 は 、 斎 藤 ら の 方 法 に 従 っ て 行 っ た [ 斎

藤 , 2017.] 。 24 well 細 胞 培 養 用 プ レ ー ト ( TPP)に ヒ ト 肺 上 皮 細 胞 由 来 の A549 細 胞 、 ま た は ヒ ト 気 管 支 上 皮 細 胞 由 来 の BEAS -2B 細 胞 を そ れ ぞ れ 6.0× 10⁵ cells/well と な る よ う に 植 え 、 5%CO2存 在 下 、 37 ℃ で 24 時 間 培 養 し コ ン フ ル エ ン ト に し た 。 3 7 ℃ に プ レ ヒ ー ト し た

Hank's Balanced Salt Solutions (HBSS (-)), (富 士 フ ィ ル ム 和 光 純 薬 工 業 , 大 阪 ) で 各 well を 洗 浄 後 、 100 µg/mL ル ミ フ ラ ビ ン 加 HBSS (-)、

ま た は HBSS(-) を 1 mL/well と な る よ う に 加 え た 。 そ の 後 、 百 日 咳 菌 東 浜 株 を multiplicity of infection ( MOI )= 5 と な る よ う に 各 well に 加 え た 。 5%CO2存 在 下 、 36.5 ℃ で 2 時 間 培 養 後 、 Dulbecco’ s phosphate buffered saline ( DPBS （ -） )1 mL/well で 細 胞 表 面 を 3 回 洗 浄 し 、 細

胞 に 付 着 し て い な い 百 日 咳 菌 を 除 い た 。 そ の 後 、 滅 菌 MilliQ を 1 mL/well と な る よ う に 加 え 、 5 分 後 に ピ ペ ッ テ ィ ン グ に よ っ て 細 胞 を 破 壊 し 細 胞 に 付 着 し た 菌 を 回 収 し た 。 回 収 し た 菌 液 を DPBS (- )で 段 階 希 釈 し 、 各 段 階 希 釈 液 を 100 µL ず つ MCD 寒 天 培 地 に 塗 抹 し た 。 塗 抹 後 の プ レ ー ト を 36.5 ℃ で 5 日 間 培 養 後 、 MCD 寒 天 培 地 上 に 生 育 し た コ ロ ニ ー の 数 を 計 数 し 、 細 胞 に 付 着 し た 生 菌 数 を 算 出 し た 。

1.1.14. 動 物 実 験

実 験 動 物 の 飼 育 お よ び 動 物 実 験 は 北 里 大 学 動 物 実 験 委 員 会 の 実 験 許 可 の も と 、 北 里 大 学 に お け る 動 物 実 験 等 に 関 す る 規 定 に 則 っ て 行 っ た (承 認 番 号 : 1 7 -052) 。

1.1.14.1. 実 験 動 物

5 週 齢 の 雌 性 BALB/c マ ウ ス （ 日 本 SLC , 静 岡 ） を 使 用 し た 。

1.1.14.2. 攻 撃 用 菌 液 の 調 製

百 日 咳 菌 東 浜 株 を BG 培 地 に 塗 抹 し て 、 36.5 ℃ で 培 養 し た 。 4 日 間 培 養 し て 得 ら れ た Ⅰ 相 菌 コ ロ ニ ー を 釣 菌 し 、 BG 培 地 上 に 塗 り 広 げ て 36.5 ℃ で 1 日 間 、 増 菌 培 養 し た 。 増 殖 し た 百 日 咳 菌 を 滅 菌 綿 棒 で 集 菌 し 、 100 µ g/mL ル ミ フ ラ ビ ン 加 DPBS （ -） 、 ま た は DPBS （ - ） に 懸 濁 さ せ 、 OD6 5 0を 1.0 に 調 整 し た 。 こ の 菌 懸 濁 液 を そ れ ぞ れ 、 100 µg/mL ル ミ フ ラ ビ ン 加 DPBS （ - ） ま た は DPBS （ - ） で 30 倍 希 釈 し て 攻 撃 用 菌 液 と し た 。

1.1.14.3. 感 染

百 日 咳 菌 東 浜 株 を 含 む 攻 撃 用 菌 液 50 µL を そ れ ぞ れ 麻 酔 下 で マ ウ ス に 経 鼻 接 種 し た 。 麻 酔 薬 は 、 ソ ム ノ ペ ン チ ル （ 共 立 製 薬 , 東 京 ） を 使 用 し た 。 ソ ム ノ ペ ン チ ル ( 共 立 製 薬 )1 mL を 24 mL の DPBS （ -）

で 25 倍 希 釈 し 、 腹 腔 内 投 与 （ 0.5 mL/dose ； ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル ナ ト リ ウ ム と し て 1.3 mg/dose ） し た 。

感 染 0 日 （ 2 時 間 ） 、 2 日 、 お よ び 5 日 後 に マ ウ ス を 頸 椎 脱 臼 に よ っ て 安 楽 死 さ せ 、 肺 を 無 菌 的 に 摘 出 し た 。 摘 出 し た 肺 を DPBS （ -）

10 mL 中 で ホ モ ジ ナ イ ズ し た （ D T -2 0 ホ モ ジ ナ イ ズ チ ュ ー ブ , ULTRA - TURRAX チ ュ ー ブ ホ モ ジ ナ イ ザ ー ; IKA , Staufen , Germany ） 。 ホ モ ジ ナ イ ズ し た 肺 懸 濁 液 を 10^{- 1}倍 希 釈 液 と し 、 DPBS （ -） で 1 0^{- 2}、 10^-3、 10^{- 4}希 釈 ま で 10 倍 段 階 希 釈 液 を 調 整 し た 。 1 0^{- 1}、^～1 0^-4倍 希 釈 し た 肺 懸 濁 液 100 µL を MCD 寒 天 培 地 に 塗 抹 し 、 36 . 5 ℃ で 5 日 間 培 養 し た 。 生 じ た コ ロ ニ ー を 計 数 し 、 肺 内 生 菌 数 を 算 定 し た 。

1.1.15. SDS polyacrylamide gel electrophoresis ( SDS -PAGE )

百 日 咳 菌 東 浜 株 を Section 1.1.4. に 記 載 の 通 り 培 養 し 、 シ ー ド 菌 液 を 得 た 。 シ ー ド 菌 液 を S/S 培 地 お よ び 10 µg/mL リ ボ フ ラ ビ ン 含 有 S/S 培 地 に 0.01 ×1 0⁹ cells/mL と な る よ う に 植 菌 後 、 36.5 ℃ で 4 日 間 、 静 置 培 養 し た 。 培 養 容 器 は 、 2 5 cm² 組 織 培 養 用 フ ラ ス コ (TPP)を 使 用 し た 。 培 養 液 の 容 量 は 、 5 mL/flask と し た 。 培 養 液 を 遠 心

（ 13,400× ɡ , 3 0 min, 4 ℃ ） 後 、 得 ら れ た 菌 体 タ ン パ ク 質 の SDS -PAGE プ ロ フ ァ イ ル を 調 べ た 。 す な わ ち 、 百 日 咳 全 菌 体 を OD6 5 0 が 0.8 （ 層 長

=1 0 m m） と な る よ う に 百 日 咳 菌 全 菌 体 を MilliQ 水 に 懸 濁 し 、 そ の 5 0 µL と 等 容 量 の 20 ％ ト リ ク ロ ロ 酢 酸 を 加 え た 。 混 合 後 、 室 温 で 5 分 間 静 置 し た 。 卓 上 遠 心 機 で 遠 心 （ 16,200 ×ɡ , 5 min, 4 ℃ ） し 、 上 清 を 除 い た 後 、 2 - メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル 加 Laemmli sample buffer (Table 5)12 µL を 加 え て 混 和 し た 。 こ の 試 料 を 1 00℃ に て 5 分 間 加 熱 し 、 放 冷 後 、 SDS-PAGE に 供 し た 。 10％ 分 離 ゲ ル (Table 6 )を 調 製 し た 後 に 、 濃 縮 ゲ ル (Table 7, 8 ) を 重 層 し 使 用 し た 。 泳 動 は 60 V で 2 時 間 行 い 、 泳 動 終 了 後 、 Bio -Safe Coomassie G 250 stain (BIO -RAD, Hercules, CA , USA)で 染 色 し た 。 分 子 量 マ ー カ ー と し て Precision Plus Protein Standards

Dual Color( BIO -R AD) を 用 い た 。 得 ら れ た SDS-PAGE プ ロ フ ァ イ ル を デ ン シ ト メ ト リ ー 解 析 に 供 し 、 バ ン ド の 濃 さ を ピ ク セ ル 強 度 で 表 し た 。 デ ン シ ト メ ト リ ー 解 析 ソ フ ト は 、 Quantity one 1 次 元 解 析 ソ フ ト ウ ェ ア (BIO -RAD, Hercules, CA ) を 使 用 し た 。

1.1.16. ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法

BvgA の 検 出 は 、 ラ ビ ッ ト 抗 BvgA ペ プ チ ド 抗 体 （ 北 里 大 学 、 阿 部 章 夫 博 士 よ り 分 与 ） を 使 用 し ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 で 解 析 し た 。 百 日 咳 菌 の 全 菌 体 タ ン パ ク 質 は 、 Section 1.1.15. の 方 法 に 従 っ て SDS - PAGE に て 展 開 後 、 TRANS -BLOT SD SEMI - DRY TRANSFER CELL ( BIO -RAD ) と 転 写 バ ッ フ ァ ー ( Table 9) を 使 用 し て 、 ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 に 転 写 し た (15 V, 300 mA, 30 min) 。 こ の ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 を 5% ( v/v )ブ ロ ッ キ ン グ ワ ン ( ナ カ ラ イ テ ス ク )お よ び Tween 20 加 Tris- buffered saline (pH: 7.4, TBS)に 浸 し 、 30 分 間 振 と う し た 。 次 い で 、 5 % (v /v) ブ ロ ッ キ ン グ ワ ン ( ナ カ ラ イ テ ス ク ) お よ び 0.1% (v/v ) Tween 20 加 TBS で 1,000 倍 希 釈 し た ラ ビ ッ ト 抗 BvgA ペ プ チ ド 抗 体 を 加 え 、 90 分 間 振 と う し た 。 メ ン ブ レ ン を 0.05 % ( v/v ) Tween 20 加 TBS で 3 回 洗 浄 し た 後 、 5% (v/v ) ブ ロ ッ キ ン グ ワ ン ( ナ カ ラ イ テ ス ク )お よ び 0.05 % (v/v) Tween 20 加 TBS で 1,000 倍 希 釈 し た ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ 標 識 抗 ラ ビ ッ ト IgG 抗 体 (Jackson ImmunoResearch Laboratories , West Grove , PA , USA ) を 添 加 し 60 分 間 振 と う し た 。 メ ン ブ レ ン を 0.05 % ( v/v) Tween 20 加 TBS で 3 回 洗 浄 し 、 1- Step NBT -BCIP(Roche , Basel, Switzerland ) を 使 用 し 、 発 色 反 応 を 行 っ た 。 7 % (v/v) 酢 酸 、 続 い て MilliQ 水 に メ ン ブ レ ン を 浸 し 反 応 を 停 止 さ せ た 。

1.1.17. プ ロ テ オ ミ ク ス 解 析

タ ン パ ク 質 の 同 定 は 、 Genomin 株 式 会 社 (Pohang, Korea ) に 委 託 し た 。 す な わ ち 、 百 日 咳 菌 菌 体 タ ン パ ク 質 の SDS -PAGE に お け る バ ン

ド を 切 り 出 し 、 ト リ プ シ ン 消 化 後 、 エ レ ク ト ロ ン ス プ レ ー イ オ ン 化 タ ン デ ム 質 量 分 析 ( ESI - MS/MS )に よ っ て 解 析 し た 。 各 種 タ ン パ ク 質 の 同 定 は MASCOT サ ー チ に よ っ て 行 っ た 。

1.1.18. 統 計 解 析

統 計 解 析 は 、 GraphPad Prism ver . 6 （ GraphPad Software, La Jolla, C A , USA ） を 使 用 し た 。t-検 定 ま た は Two-way ANOVA に て 解 析 を 行 っ た 。 T wo- way ANOVA に よ る 解 析 で は 、 解 析 後 ポ ス ト ホ ッ ク 検 定 と し て Bonferroni 検 定 を 行 っ た 。

(a)

(b)

Fig 1 . 百 日 咳 菌 の培 養 上 清 (a) S/S 培 地

(b) 百 日 咳 菌 東 浜 株 を 2× 10⁹ cells/mL となるように S/S 培 地 に 懸 濁 した 後 、 静 置 培 養 (36.5℃ , 7 日 間 )し て得 ら れた 培 養 上 清

T a b le 1. 使 用 し た 菌 株 の 特 徴

百 日 咳 菌 株 分 離 年 ジェノタイプ 百 日 咳 毒 素^*

ptxP ptxA ptxB

パータク チン^* Prn 東 浜 1 9 5 3 1 2 1 1 SK2 2 0 1 0 1 2 2 1（ただしパータクチン非産生）

SK3 2 0 1 0 3 1 2 2

* : 百 日 咳 毒 素 およ びパータク チンの番 号 は、それぞれのジェノタイプを 示 す。

T a b le 2 . St a i n e r -S ch o lte 培 地

成 分 量

T ri s -b a se 1 .5 3 g

Glu ta m ic a ci d ( Mo n o so d iu m s a l t ) 1 0 .7 2 g

Na C l 2 .5 0 g

K H2P O4 0 .5 0 g

L -p ro l in e 0 .2 4 g

KC l 0 .2 0 g

M g C l2・6 H2O 0 .1 0 g

1 M Ca C l² 1 3 5 µ L

M il l iQ wa t e r Ad d to 1 L

HCl で 培 地 の 最 終 pHを 7.6 に 合 わ せ た 。

T a b le 3 . Su p p l e m e n t

成分 量

Glu ta t h io n e ( re d u c e d ) 1 .0 0 g

L - c yst in e 0 .4 0 g

Asc o rb ic a c id 0 .2 0 g Fe S O4 7 H2O 0 .1 0 g

N ia c in 0 .0 4 g

M il l iQ wa t e r Ad d to 1 0 0 m L L- cystine を 溶 解 さ せ る た め に H Clを 加 え た 。 Supplement を 調 製 後 、 0.2 µ m PVDF フ ィ ル タ ー で ろ 過 滅 菌 し た 。

T a b le 4 . メ チ ル 化 β サ イ ク ロ デ キ ス ト リ ン 寒 天 培 地

成 分 量

Ba ct o A ga r 1 7 g

So d i u m g lu ta m a te m o n o h yd r a te 1 0 .7 g

T ri s -b a se 6 .1 g

Ca sa m i n o a c id 2 .5 g

Na C l 2 .5 g

K H2P O4 0 .5 0 g

L -p ro l in e 0 .2 4 g

KC l 0 .2 0 g

M g C l2 6 H2O 0 .1 0 g

1 M Ca C l2 1 3 5 µ L

M il l iQ wa t e r a d d to 1 L

HCl で 培 地 の 最 終 pH を 7.6 に 合 わ せ た 。

T a b le 5 . L a e m m l i sa m p le b u f f e r

成 分 量

1 0 % so d iu m d o d e c yl su lf a te 2 0 0 µ L

1 M T r is - H Cl 2 0 0 µ L

5 0 % g l yc e ro l 3 5 0 µ L

0 .0 3 % b ro m o p h e n o l b lu e 1 0 0 µ L 1 M d i th io th re i to l 1 0 0 µ L 0 .1 % p yr o n in Y 5 0 µ L

T a b le 6 . 1 0 % p o l ya c r yl a m i d e g e l

成 分 量

4 0 % a c r yl a m i d e /B i s so lu t io n , 3 7 .5 : 1 2 .3 m L 3 M T r is -b a se (p H 8 .9 ) 1 .6 m L 1 0 % a m m o n iu m p e ro xo d i su lf a te 4 0 µ L N, N, N , N -m e t h yl e th yle n e d ia m in e 1 0 µ L

M il l iQ wa t e r 4 .9 m L

T a b le 7 . St a c k in g m i xtu re

成 分 量

Ac r yla m id e 7 .5 g

N,N’-methylene -bis-acrylamide 1 .5 g

T ri s -b a se 4 .5 4 g

M il l iQ wa t e r Ad d to 2 7 0 m L

HCl で 溶 液 の p H を 6 . 8に 調 整 す る 。

T a b le 8 . St a c k in g ge l

成 分 量

Sta c k in g m i xt u r e 2 .7 m L

1 0 % a m m o n iu m p e ro xo d is u lf a te 4 0 µ L N, N, N , N -m e t h yl e th yle n e d ia m in e 1 0 µ L

T a b le 9 . Re c ip e o f tra n sf e r b u f f e r f o r W e ste rn b lo t ti n g

成 分 量

Gl yc in e 7 .2 g

T ri s -b a se 1 .5 g Me t h a n o l 1 0 0 m L

M il l iQ wa te r Ad d to 5 0 0 m L

1.2. 結 果

百 日 咳 菌 が 分 泌 す る 黄 色 色 素 の 同 定 を 試 み た 。 色 素 粗 画 分 を HPLC で 分 離 し た と こ ろ 、 黄 色 を 示 す 物 質 が 保 持 時 間 6. 5 分 お よ び 8.9 分 で 溶 出 さ れ た (Fig 2)。 以 下 、 カ ラ ム 保 持 時 間 6.5 分 を 示 し た 物 質 を 黄 色 物 質 1 、 8.9 分 の 物 質 を 黄 色 物 質 2 と 表 記 す る 。 こ れ ら に つ い て 、 紫 外 可 視 吸 収 ス ペ ク ト ル 測 定 お よ び 質 量 分 析 を 行 っ た と こ ろ 、 黄 色 物 質 1 の 極 大 吸 収 波 長 は 、 226 、 268 、 370 お よ び 450 nm (Fig 3) を 示 し 、 そ の プ ロ ト ン 負 荷 分 子 [M+H]⁺の 質 量 は 、 377 で あ っ た (Fig 4) 。 一 方 、 黄 色 物 質 2 の 極 大 吸 収 波 長 は 、 2 16、 2 60、 353 お よ び 388 nm ( Fig 5) を 示 し 、 そ の プ ロ ト ン 負 荷 分 子 [M+H ]⁺の 質 量 は 、 243 で あ っ た (Fig 6)。

得 ら れ た 機 器 分 析 デ ー タ を も と に デ ー タ ベ ー ス 検 索 を 行 っ た 結 果 、 黄 色 物 質 1 は リ ボ フ ラ ビ ン ( Fig 7a )、 黄 色 物 質 2 は ル ミ ク ロ ム (Fig 7b) で あ る と 考 え ら れ た た め 、 両 化 合 物 の 標 品 を 入 手 し HPLC に お け る カ ラ ム 保 持 時 間 、 極 大 吸 収 波 長 、 お よ び 分 子 量 を 試 料 と 比 較 し た (Table 10 , 11; F ig 2 ～ 6)。 そ の 結 果 、 黄 色 物 質 1 と リ ボ フ ラ ビ ン 、 黄 色 物 質 2 と ル ミ ク ロ ム の HPLC に お け る カ ラ ム 保 持 時 間 、 極 大 吸 収 波 長 、 お よ び 分 子 量 は 完 全 一 致 し た ( Table 10, 11)。 以 上 の 結 果 か ら 、 百 日 咳 菌 が 分 泌 す る 黄 色 色 素 は リ ボ フ ラ ビ ン と ル ミ ク ロ ム で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま た 、 百 日 咳 菌 東 浜 株 に お け る リ ボ フ ラ ビ ン と ル ミ ク ロ ム の 分 泌 量 を 調 べ た 。 Section 1.1. 4. お よ び 1.1.5.に 記 載 の 通 り 百 日 咳 菌 を 培 養 し 得 ら れ た 培 養 上 清 中 の リ ボ フ ラ ビ ン お よ び ル ミ ク ロ ム の 量 を 調 べ た と こ ろ 、 リ ボ フ ラ ビ ン 量 は 46 µ g/ 250 mL で あ り 、 ル ミ ク ロ ム は 、 6 µg/ 250 mL で あ っ た 。 こ の 結 果 か ら 、 培 養 上 清 中 の 両 化 合 物 存 在 比 （ リ ボ フ ラ ビ ン ： ル ミ ク ロ ム ） は 、 お よ そ 7.7： 1 で あ り 百 日 咳 菌 が 分 泌 す る 黄 色 色 素 は 主 に リ ボ フ ラ ビ ン で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 百 日 咳 菌 新 鮮 分 離 株 (S K 2, S K3 株 )に お い て も 、 東 浜 株 と 同 様 に リ ボ フ ラ ビ ン を 分 泌 し て い る か 調 べ た 。 S K2 、 SK3 株 の 培 養 上 清 は 共 に 黄 色 を 呈 し 、 HP LC に お い て リ ボ フ ラ ビ ン と 同 一 の 保 持 時 間 に ピ ー ク

を 検 出 し た 。 そ の ピ ー ク の 物 質 は 、 2 26, 268, 370, お よ び 450 nm の 極 大 吸 収 波 長 を 示 し 、 分 子 量 は 376 を 示 し 、 リ ボ フ ラ ビ ン の 値 と 完 全 一 致 し た こ と か ら 、 SK 2 株 お よ び S K3 株 は 東 浜 株 と 同 様 リ ボ フ ラ ビ ン を 分 泌 す る こ と が 明 か と な っ た ( Fig 8, 9) 。 さ ら に 、百 日 咳 菌 以 外 の

Bordetella 属 菌 種 が、 リボフラ ビンを 分 泌 し ているか 調 べた 。その結 果 、百 日 咳 菌 に 加 え 、ヒ トに感 染 し百 日 咳 を 引 き起 こすパラ 百 日 咳 菌 、B. holmesii、およ び犬 、猫 、豚 などに感 染 し 気 管 支 炎 などを引 き起 こす気 管 支 敗 血 症 菌 はすべて 培 養 上 清 中 にリボフラビンを 分 泌 していた (Table 12 )。各 Bordetella 属 菌 種 間 のリ ボフラ ビン分 泌 量 に有 意 な差 は検 出 されなかった (Table 12 )。

百 日 咳 菌 東 浜 株 を 250 mL の S/S 培 地 に 2×10⁹ cells/mL と な る よ う に 植 菌 し た 。 36.5 ℃ で 1 ～ 6 日 間 静 置 培 養 し 、 培 養 上 清 中 の リ ボ フ ラ ビ ン 濃 度 を 経 時 的 に 定 量 し た 。 そ の 結 果 、 培 養 上 清 中 の リ ボ フ ラ ビ ン 濃 度 は 、 百 日 咳 の 増 殖 の 誘 導 期 か ら 対 数 増 殖 前 期 に か け て 上 昇 し 、 対 数 増 殖 後 期 か ら 定 常 期 に 低 下 し た ( Fig 10 a)。 ま た 、 菌 体 あ た り の リ ボ フ ラ ビ ン 分 泌 量 は 、 誘 導 期 か ら 対 数 増 殖 前 期 ま で の 方 が 対 数 増 殖 後 期 以 降 よ り も 多 か っ た ( Fig 1 0b) 。

リボフラ ビン添 加 培 地 で百 日 咳 菌 を 培 養 し 、その増 殖 に寄 与 するのか について調 べた 。1 0 µ g/mL リボフラ ビン含 有 S/S 培 地 4 mL に百 日 咳 菌 を 0 .01× 10⁹ cells/mL または 0.1 ×10⁹ cells/mL となるよ う に植 菌 し 、 36.5 ℃で 振 とう (200 rpm)培 養 し た 。リ ボフラ ビンを S/S 培 地 に 添 加 すると、リボフラ ビン不 含 培 地 で培 養 した ときと比 較 し て、百 日 咳 菌 の増 殖 が促 進 されることが明 らか と なった (Fig 11a)。この 現 象 は 、菌 濃 度 が低 いとき (0.01× 1 0⁹ cells/mL)に観 察 され、菌 濃 度 が高 い (0.1 ×10⁹ cells/mL)ときには観 察 されなか った (Fig 11b)。

ま た 、 リボフラビンの 阻 害 剤 であるルミ フラ ビンを 培 地 に添 加 し た場 合 、リ ボフラ ビ ンの 添 加 によ る百 日 咳 菌 の 増 殖 促 進 作 用 が見 ら れなくなった (Fig 12)。

ル ミ フ ラ ビ ン が 百 日 咳 菌 の 宿 主 細 胞 へ の 付 着 に お よ ぼ す 影 響 を 調 べ る た め に 、 ル ミ フ ラ ビ ン 添 加 時 に お け る A549 細 胞 、 お よ び BEAS -2B 細 胞 へ の 付 着 性 の 変 化 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、 ル ミ フ ラ ビ ン を 添

加 し て も 両 細 胞 に 対 す る 百 日 咳 菌 の 付 着 性 に 変 化 は 見 ら れ な か っ た ( Fig 13 ) 。次 に、マウスモデルにおいて百 日 咳 菌 とルミ フラ ビンを 同 時 に経 鼻 接 種 し 、 ルミ フラ ビンを 加 えていない対 照 群 と肺 内 生 菌 数 推 移 を 比 較 し た ところ、ルミフラ ビンを 同 時 接 種 した 方 が 、肺 内 生 菌 数 が有 意 に 低 く 推 移 し た (Fig 14)。 ル ミ フ ラ ビ ン は 、 実 験 に 使 用 し た 濃 度 で は 菌 の 増 殖 を 阻 害 し な い こ と を 確 認 し た こ と か ら 、 マ ウ ス モ デ ル の 結 果 は ル ミ フ ラ ビ ン に よ っ て 、 百 日 咳 菌 の 定 着 が 阻 害 さ れ た も の と 推 察 さ れ た 。これらのことか ら、 ルミフラ ビン は 百 日 咳 菌 の宿 主 への 付 着 に は関 与 し ないが、その 宿 主 への定 着 に 関 わることが 示 唆 された (Fig 13, 14 )。

百 日 咳 菌 の 全 菌 体 タ ン パ ク 質 を S DS-PAGE で 分 離 し 、 得 ら れ た SDS-PAGE プ ロ フ ァ イ ル を デ ン シ ト メ ト リ ー で 解 析 し た 。 そ の 結 果 、 リ ボ フ ラ ビ ン 添 加 培 地 で 百 日 咳 菌 を 培 養 し た 場 合 、 リ ボ フ ラ ビ ン 不 含 培 地 で 培 養 し た と き に 比 べ て 、 分 子 量 23 kDa の バ ン ド が 濃 く な っ た (Fig 15 ) 。 こ の こ と か ら 、 リ ボ フ ラ ビ ン の 添 加 で 23 kDa の タ ン パ ク 質 の 発 現 が 亢 進 し た 、 ま た は こ の タ ン パ ク 質 の 分 解 が 抑 え ら れ た こ と が 示 唆 さ れ た 。 こ の バ ン ド を プ ロ テ オ ミ ク ス 解 析 に 供 し た と こ ろ 、 リ ボ フ ラ ビ ン 添 加 で 発 現 の 亢 進 ま た は 分 解 が 抑 え ら れ た タ ン パ ク 質 は 百 日 咳 菌 の 病 原 因 子 産 生 制 御 を 担 う BvgA で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 リ ボ フ ラ ビ ン 添 加 に よ る BvgA 発 現 量 を 詳 細 に 調 べ る た め 、 リ ボ フ ラ ビ ン 添 加 培 地 お よ び 不 含 培 地 で 百 日 咳 菌 を 培 養 し た と き の BvgA 発 現 量 に つ い て ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 で 解 析 後 、 得 ら れ た BvgA の バ ン ド 濃 度 を デ ン シ ト メ ト リ ー に て 半 定 量 的 に 数 値 化 し た 。 そ の 結 果 、 リ ボ フ ラ ビ ン 添 加 培 地 で 培 養 し た と き の 方 が リ ボ フ ラ ビ ン 不 含 培 地 で 培 養 し た と き に 比 べ 、 B vgA の バ ン ド の 濃 さ が 濃 か っ た ( Fig 16)。

1.3. 考 察

百 日 咳 菌 の 培 養 上 清 中 に 存 在 す る 黄 色 色 素 は 、 リ ボ フ ラ ビ ン と ル ミ ク ロ ム で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 両 化 合 物 の 培 養 上 清 中 存 在 比 （ リ ボ フ ラ ビ ン ： ル ミ ク ロ ム ） は 、 7. 7 ： 1 で あ っ た 。

リ ボ フ ラ ビ ン は 、 多 く の 細 菌 に よ っ て 生 合 成 さ れ る こ と が 知 ら れ て お り [ Bereswill S , 1999 ; Vitreschak AG , 2002] 、 菌 体 内 で フ ラ ビ ン ア デ ニ ン ジ ヌ ク レ オ チ ド ( FAD )や フ ラ ビ ン モ ノ ヌ ク レ オ チ ド (FMN )に 変 換 さ れ る 。 F AD や FMN は 、 電 子 伝 達 系 で の プ ロ ト ン 転 移 反 応 な ど ATP を 生 成 す る 経 路 で 機 能 す る こ と か ら 、 FAD や FMN の 原 料 で あ る リ ボ フ ラ ビ ン の 供 給 は 、 細 菌 （ 特 に 好 気 性 細 菌 ） の 効 率 的 な エ ネ ル ギ ー 獲 得 の た め に 必 須 で あ る [Abbas CA, 2001 ; Vitreschak AG , 2002.] 。 細 菌 が リ ボ フ ラ ビ ン を 菌 体 外 へ 分 泌 す る 報 告 は い く つ か 存 在 す る [ Marsili

E, 2008 ; Rajamani S , 2008; Yurgel SN , 2014.] 。 そ の 例 と し て 、 ア ル フ ァ ル フ ァ 根 粒 菌 、 シ ュ ワ ネ ラ 属 細 菌 が リ ボ フ ラ ビ ン を 分 泌 す る と い う 報 告 が あ る [ Marsili E , 2008 ; Yurgel SN , 2014.] 。 ま た 、 バ チ ラ ス 属 細 菌 に お い て 、 そ の 変 異 体 に よ る リ ボ フ ラ ビ ン の 工 業 的 な 生 産 方 法 も 試 み ら れ て い る [ Mack M , 1998.] 。 一 方 、 百 日 咳 菌 に お け る リ ボ フ ラ ビ ン 分 泌 の 報 告 は 無 く 、 そ の 分 泌 意 義 に 興 味 が 持 た れ た 。 ル ミ ク ロ ム は リ ボ フ ラ ビ ン の 側 鎖 部 分 が 存 在 し な い 構 造 を 有 し ( Fig 7 )、 光 照 射 、 お よ び 酸 性 条 件 下 で リ ボ フ ラ ビ ン が 分 解 し て 生 ず る こ と が 分 か っ て い る [Huang R, 2006 ; Remucal CK , 2011.] 。 ア ル フ ァ ル フ ァ 根 粒 菌 が ル ミ ク ロ ム を 分 泌 す る と い う 報 告 が あ る [Dakora FD, 2015.] 。 し か し 、 ア ル フ ァ ル フ ァ 根 粒 菌 に お け る ル ミ ク ロ ム 分 泌 に 関 し て は リ ボ フ ラ ビ ン が 光 分 解 さ れ 、 副 次 的 に ル ミ ク ロ ム を 生 ず る の で は な い か と い う 報 告 も あ り [Phillips DA , 1999.] 、 そ の 詳 細 は 明 ら か と な っ て い な い 。 今 後 、 百 日 咳 菌 に お い て も 、 ル ミ ク ロ ム の 分 泌 機 構 や 生 合 成 経 路 に つ い て 詳 細 に 調 べ 、 ル ミ ク ロ ム 分 泌 能 に 関 す る 知 見 を 得 る 必 要 が あ る 。

日 本 で 分 離 さ れ た 新 鮮 分 離 株 2 株 に お い て も 、 東 浜 株 と 同 様

に リ ボ フ ラ ビ ン が 分 泌 さ れ て い る か 調 べ た 。 P T 遺 伝 子 は 、 PT オ ペ ロ ン の プ ロ モ ー タ ー を コ ー ド す る 遺 伝 子 で あ る ptxP、 毒 素 活 性 部 位 （ A サ ブ ユ ニ ッ ト ） を コ ー ド す る 遺 伝 子 (ptxA)と 細 胞 結 合 部 位 （ B サ ブ ユ ニ ッ ト ） を コ ー ド す る 遺 伝 子 (ptxB)か ら な る [Locht C, 1986; Nicosia A, 1986; Tamura M, 1982] 。 近 年 、 PT 遺 伝 子 (ptxP、 ptpA、 ptpB )、 お よ び パータク チンの 構 造 遺 伝 子(prn)の変 異 株 が多 く検 出 されている[Bouchez V, 2009 ; Mooi FR , 2009; van Gent M, 2012; Hegerle N, 2012;

Otsuka N, 2012 Petersen RF, 2012; Schmidtke A J, 2012; Bodilis H, 2013 ; Pawloski L C, 2014 , 齋 籐 、2012. ]。使 用 し た 百 日 咳 菌 は 、 近 年 野 外 で 検 出 さ れ る 代 表 的 な 株 で あ り 、 国 内 に お け る 臨 床 分 離 株 の ほ と ん ど は PT や パ ー タ ク チ ン のジェノタイ プが実 験 室 株 と大 きく異 なる SK3 株 型 であり、パータク チンを産 生 し ない SK2 株 型 がそれに続 く分 離 頻 度 である

[Otsuka N, 2012 ; 齋 籐 、2 012.]。調 べ た 結 果 、 SK2 株 お よ び SK 3 株 は と も に リ ボ フ ラ ビ ンを分 泌 し ていた(Fig 8, 9)。また 、百 日 咳 菌 以 外 の

Bordetella 属 菌 種 3 菌 種 に 関 し ても リ ボフラ ビンを 分 泌 していた(Table 12)。 これら の 結 果 から 、リボフラ ビン分 泌 能 は Bordetella 属 細 菌 の菌 種 を 超 え て保 存 された 性 質 であることが示 唆 された 。 今 後 、病 原 性 の強 度 とリボフラ ビン分 泌 の 関 連 などを 明 らかに するた め、より多 くの分 離 株 においてリ ボフラ ビンの分 泌 性 を 調 べていく必 要 が あると考 え ている。

細 菌 においてリボフラ ビンは、GTP とペントースリン酸 回 路 の中 間 体 で あるリブロ ース 5-リン酸 から 、 4 つの酵 素 (GTP cyclohydrolase, Riblose-5- phosphate, RibB; Pyrimidine deaminase, Pyrimidine reductase, RibD; Riboflavin synthase β-chain, RibH; Riboflavin synthase α- chain, RibE)の 触 媒 によっ て合 成 されることが知 ら れている (Fig

17 )[Vitreschak AG, 2002.] 。また 、これら の酵 素 を コードする遺 伝 子 は、オペロ ン(rib オペロ ン )を 形 成 する[Vitreschak AG, 2002.] 。本 研 究 で使 用 し た Bordetella 属 4 菌 種 は 、すべて rib オペロ ンを 保 有 し ており、自 身 でリボフラ ビ ンを 合 成 することが可 能 と考 えら れた 。また 、それぞれの菌 種 間 における RibB、

RibD、および RibH のアミノ 酸 配 列 の相 同 性 を BLAST サーチによっ て調 べた ところ、8 8%～ 99%と高 い値 を 示 した 。一 方 RibE に関 しては、B. holmesii の み 他 の Bordetella 属 菌 種 とのアミノ酸 配 列 の相 同 性 が 3 5%～37%と低 いものの、

RibE ホモロ グを コードする遺 伝 子 を 保 有 することが分 かった 。リボフラ ビンは水 溶 性 ビタ ミンであり、脂 質 二 重 膜 を 通 過 し ないことから 、その分 泌 にはトラ ンスポータ ー（分 泌 装 置 ）が必 要 であると考 えら れる。シュワネラ 属 細 菌 において

Multudrug and Toxin Extlusion fam ily protein(MATE family

protein)によっ てリボフラ ビンが 分 泌 される ことが知 ら れている [Garcia-Angulo VA, 2017.] 。MATE family protein は、薬 剤 排 泄 に関 与 するタンパク 質 であり、

多 くの 細 菌 が保 有 するも のの その構 造 には多 様 性 が存 在 する [Moriyama Y, 2008; Garcia-Angulo VA, 2017] 。今 回 調 べた すべての Bordetella 属 菌 種 は MATE family protein のホモロ グをコードする遺 伝 子 を保 有 し ていること から Bordetella 属 細 菌 も 、このタ ンパ ク 質 を 介 し てリボフラ ビンを 分 泌 している可 能 性 が ある。

百 日 咳 菌 の 増 殖 過 程 に お け る リ ボ フ ラ ビ ン の 分 泌 量 を 経 時 的 に 調 べ た 結 果 、 培 養 上 清 中 の リ ボ フ ラ ビ ン 濃 度 は 対 数 増 殖 期 ま で 上 昇 し 、 定 常 期 以 降 で 低 下 す る こ と が 明 ら か と な っ た ( Fig 10a) 。 菌 体 あ た り の リ ボ フ ラ ビ ン 分 泌 量 は 誘 導 期 か ら 対 数 増 殖 前 期 の 方 が 定 常 期 以 降 よ り も 多 い こ と が 示 唆 さ れ た (Fig 10b) 。 こ れ ら の こ と か ら 、 菌 体 外 に 分 泌 さ れ た リ ボ フ ラ ビ ン は 、 百 日 咳 菌 の 増 殖 初 期 段 階 に お い て 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る と 推 察 さ れ た 。また 、本 研 究 では百 日 咳 菌 の増 殖 を OD6 5 0で評 価 したが 、今 後 分 泌 さ れた リボフラビンと百 日 咳 菌 増 殖 の関 連 性 を 詳 細 に明 ら かに するた めに は 、生 菌 数 を 経 時 的 に 測 定 し た実 験 も 行 う 必 要 がある。

リボフラ ビンは、菌 体 内 で FMN や FAD に変 換 され ATP 合 成 の補 酵 素 としてはたら くことが知 ら れている [Abbas CA, 2001; Vitreschak

AG, 2002.] 。今 回 の 実 験 において、培 地 へのリボフ ラビンの添 加 により百 日 咳 菌 の 増 殖 促 進 作 用 が 観 察 された(Fig 11)。百 日 咳 菌 が 培 地 中 の リ ボ フ ラ ビ ン を 吸 収 す る こ と で 、 菌 体 内 に お け る FAD や FMN の 安 定 的 か つ 速 や か な 供

給 が な さ れ エ ネ ル ギ ー 獲 得 が 効 率 的 に 行 わ れ た 結 果 、 増 殖 促 進 が 誘 導 さ れ た こ と が 示 唆 さ れ た 。 百 日 咳 菌 に よ る リ ボ フ ラ ビ ン の 吸 収 機 構 は 不 明 で あ る が 、 リ ボ フ ラ ビ ン は 水 溶 性 を 示 す こ と か ら そ の 吸 収 機 構 は ト ラ ン ス ポ ー タ ー を 介 し た も の で あ る と 推 察 さ れ る 。 こ れ ま で 、 リ ボ フ ラ ビ ン の イ ン ポ ー タ ー と し て 、 9 つ の タ ン パ ク 質 が ア ル フ ァ ル フ ァ 根 粒 菌 な ど に お い て 報 告 さ れ て い る ( RibU , RibM , RibN, RibV , RibZ, RfnT , RfuABCD , RibXYZ, Imp)[ Garcia -Angulo VA , 2017.] 。 BLAST サ ー チ の 結 果 、 百 日 咳 菌 の 機 能 未 知 タ ン パ ク 質 で あ る BP2600 が RfnT と 47% の 相 同 性 を 示 す こ と が 明 ら か と な っ た 。今 後 、分 泌 されたリボフラビンの分 布 や動 態 を 明 らかに するた めに 、放 射 性 同 位 体 で標 識 された リボフラ ビンを 培 地 に添 加 し百 日 咳 菌 を 培 養 する必 要 が ある。 さらに、リ ボ フ ラ ビ ン 産 生 欠 損 株 や 分 泌 能 を 欠 失 さ せ た 株 を 作 製 し 、 リ ボ フ ラ ビ ン に よ る 百 日 咳 菌 の 増 殖 促 進 作 用 に つ い て 詳 細 に 調 べ て い く 必 要 が あ る 。

近 年 、 リ ボ フ ラ ビ ン が ヒ ト の 免 疫 系 を 抑 制 す る と い う 報 告 が あ り [Levit R , 2018.] 、 百 日 咳 菌 が リ ボ フ ラ ビ ン の 分 泌 に よ っ て 宿 主 免 疫 を 制 御 し て い る 可 能 性 も あ り 得 る と 考 え ら れ た 。

今 後 、 菌 体 外 に リ ボ フ ラ ビ ン を 分 泌 し な い 変 異 株 を 作 製 し 、 培 地 上 で の 増 殖 や マ ウ ス 体 内 で の 生 菌 数 の 推 移 を 調 べ る こ と で 、 よ り 詳 細 に 菌 体 外 リ ボ フ ラ ビ ン の 役 割 を 調 べ 、 さ ら に リ ボ フ ラ ビ ン が 宿 主 免 疫 に お よ ぼ す 影 響 を 明 ら か に す る た め に 、 宿 主 細 胞 ま た は 、 マ ウ ス へ の 感 染 後 の サ イ ト カ イ ン 産 生 量 変 化 な ど も 調 べ て い く 必 要 が あ る と 考 え て い る 。

BvgAS 系 は BvgA と BvgS の 2 成 分 か ら成 り、この制 御 系 が活 性 化 (Bvg⁺)されると 、菌 体 膜 に 存 在 する膜 貫 通 センサーキ ナーゼである BvgS がリン 酸 化 され、それに 共 役 し て最 終 的 に転 写 調 節 因 子 である BvgA がリン酸 化 され る。BvgA はリン酸 化 されることでプロモーター領 域 への結 合 が増 強 される。これ によって、様 々な病 原 遺 伝 子 の転 写 が活 性 化 され、また 、病 原 性 抑 制 遺 伝 子 (vsg)を 抑 制 する BvgR が 発 現 することで、付 着 因 子 、毒 素 や ３型 分 泌 装 置 など

の 病 原 因 子 の 発 現 が制 御 されている [Chen Q, 2017.] 。一 方 、この制 御 系 がオ フの 状 態 (Bvg^-)では、BvgA と BvgS を 介 し たシグナル伝 達 が行 われず、病 原 因 子 を 産 生 し なくなる。Bvg^-と Bvg⁺状 態 の切 り替 わりは可 逆 的 であり、百 日 咳 菌 を 低 温 培 養 (25 ℃)した り、培 地 中 にニコチン酸 や MgSO4を 添 加 したりすることで Bvg^-状 態 が誘 導 されることが 知 ら れている [Deora R, 2001; Chen Q, 2017.] 。

リ ボ フ ラ ビ ン が 百 日 咳 菌 の タ ン パ ク 質 発 現 に お よ ぼ す 影 響 を 調 べ た と こ ろ 、 リ ボ フ ラ ビ ン の 添 加 に よ っ て 、 分 子 量 23 kDa の 菌 体 タ ン パ ク 質 の 発 現 が 亢 進 さ れ た 、 も し く は こ の タ ン パ ク 質 の 分 解 が 抑 え ら れ た も の と 考 え ら れ た (Fig 15 , 16) 。 プ ロ テ オ ミ ク ス 解 析 の 結 果 、2 3 kDa の 菌 体 タ ンパ ク 質 は BvgA で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 し か し 、

BvgA 産 生 量 を 半 定 量 的 に 調 べ る 実 験 は 単 回 の み の 結 果 で あ る こ と か ら 、 今 後 複 数 回 の 実 験 に よ っ て 再 現 性 を 得 る 必 要 が あ る 。 ま た 、 リ ボ フ ラ ビ ン と BvgA の 関 連 性 に つ い て 明 ら か に す る た め に 今 後 、 リ ボ フ ラ ビ ン 産 生 欠 損 株 を 作 製 し て 、 リ ボ フ ラ ビ ン 産 生 の 有 無 と B vgA 産 生 量 の 関 連 性 に つ い て も 調 べ る 必 要 が あ る 。 さ ら に 、 リ ボ フ ラ ビ ン が BvgAS 制 御 系 の 活 性 化 に 関 与 す る の か に つ い て 明 ら か に す る た め に は 、 BvgA の リ ン 酸 化 の 状 態 を 調 べ る 必 要 が あ る 。

(a)

(b)

(c)

Fig 2 . 黄 色 色 素 粗 画 分 のクロ マトグラ ム

HPLC は 、Section 1.1. に 記 載 の通 り行 った。 (a)色 素 粗 画 分 のクロマトグラ ム OD 、(b)リボフラ ビン標 品 のクロ マトグラ ム、(c)ルミクロ ム標 品 のクロマトグラ ム

(a)

(b)

Fig 3 . 黄 色 色 素 1(a)およびリボフラ ビン標 品(b)の紫 外 可 視 吸 収 スペクトル

(a) (b)

Fig 4 . 黄 色 色 素 1(a)および リボフラビン標 品(b)の LC-ESI-MS スペクトル

(a)

(b)

Fig 5 . 黄 色 色 素 2(a)およびルミ クロ ム標 品(b)の紫 外 可 視 吸 収 スペクトル

(a) (b)

Fig 6 . 黄 色 色 素 2(a)およびルミクロム標 品 (b)の LC-ESI-MS スペクトル

(a)

(b)

Fig 7 . リ ボフラ ビン (a)とルミク ロム (b)の構 造

T a b le 1 0 . 黄 色 色 素 1 とリ ボフラ ビン標 品 の機 器 分 析 データ HPLC

保 持 時 間

（min）

極 大 吸 収 波 長

（nm）

分 子 量

黄 色 色 素 1 6 .5 2 2 6 , 2 6 8 , 3 7 9 , および 4 5 0 3 7 6 リ ボ フ ラ ビ ン 6 .5 2 2 6 , 2 6 8 , 3 7 0 , および 4 5 0 3 7 6

T a b le 1 1 . 黄 色 色 素 2と ル ミ ク ロ ム 標 品 の 機 器 分 析 デ ー タ HPLC

保 持 時 間

（min）

極 大 吸 収 波 長

（nm）

分 子 量

黄 色 色 素 2 8 .9 2 1 6 , 2 6 0 , 3 5 3 , および 3 8 8 2 4 2 ル ミ ク ロ ム 8 .9 2 1 6 , 2 6 0 , 3 5 3 , および 3 8 8 2 4 2

(a)

(b)

Fig 8 . 百 日 咳 菌 SK2 株 が分 泌 した リボフラ ビンの検 出 (a)紫 外 可 視 吸 収 ス ペクトル (b)LC-ESI-MS スペクトル

(a)

(b)

Fig 9 . 百 日 咳 菌 SK3 株 が分 泌 した リボフラ ビンの検 出 (a)紫 外 可 視 吸 収 ス ペクトル (b)LC-ESI-MS スペクトル

T a b le 1 2. Bo r d e te l la 属 細 菌 培 養 上 清 中 の リ ボ フ ラ ビ ン 量 菌 株 リ ボ フ ラ ビ ン（1 0^{- 1 8} g /c e l l） 百 日 咳 菌 東 浜 5 .7±3 .2

パラ 百 日 咳 菌12822 1 0 .8±3 .6 B. h o l me s i i AT C C 5 1 5 4 1 2 .0±0 .8 気 管 支 敗 血 症 菌 R B 50 2 .8±0 .6

データ は、3回 の実 験 の平 均 値 ±標 準 偏 差 を 示 す 。

(1菌 体 あ た り の リ ボ フ ラ ビ ン 分 泌 量（1 0^{- 1 8} g /ce l l）= 培 養 上 清 中 の リ ボ フ ラ ビ ン 量 / OD6 5 0値 か ら 求 め た 培 養 液 中 の 百 日 咳 菌 数 )

(a)

(b)

Fig 10. 百 日 咳 菌 培 養 上 清 中 に 分 泌 さ れ る リ ボ フ ラ ビ ン 量 の 経 時 変 化 (a )250 mL の 培 養 上 清 中 の リ ボ フ ラ ビ ン の 濃 度 (b )1 菌 体 あ た り の リ ボ フ ラ ビ ン 分 泌 量 。 丸 印 が 百 日 咳 菌 の 増 殖 を OD65 0で 示 し て お り 、 四 角 印 が リ ボ フ ラ ビ ン 量 を 示 す (1 菌 体 あ た り の リ ボ フ ラ ビ ン 分 泌 量 =培 養 上 清 中 の リ ボ フ ラ ビ ン 量 / OD6 5 0値 か ら 求 め た 培 養 液 中 の 百 日 咳 菌 数 ) 。 デ ー タ は そ れ ぞ れ 平 均 値 ± 標 準 偏 差 値 を 示 す 。

(a)

(b)

Fig 11. リ ボ フ ラ ビ ン が 百 日 咳 菌 の 増 殖 に お よ ぼ す 影 響

10 µg/mL リ ボ フ ラ ビ ン 添 加 S/S 培 地 ま た は S/S 培 地 で 百 日 咳 菌 東 浜 株 を 培 養 し た と き の 増 殖 を 調 べ た 。 百 日 咳 菌 東 浜 株 を 4 mL の 培 地 に 植 菌 し 36.5 ℃ で 振 と う （ 200 rpm ） 培 養 し た 。 培 養 容 器 は 、 ガ ラ ス 試 験 管 を 使 用 し た 。 ( a )百 日 咳 菌 を 0.01× 10⁹ cells/mL で 植 菌 し た と き の 増 殖 曲 線 を OD65 0で 示 す （ 黒 丸 印 , リ ボ フ ラ ビ ン 添 加 S/S 培 地 ; 黒 四 角 印 , リ ボ フ ラ ビ ン 不 含 S /S 培 地 ） 。 (b)百 日 咳 菌 を 0.1 ×10⁹ cells/mL で 植 菌 し た と き の 増 殖 曲 線 を OD65 0で 示 す （ 白 丸 印 , リ ボ フ ラ ビ ン 加 S/S 培 地 ; 白 四 角 印 , リ ボ フ ラ ビ ン 不 含 S/S 培 地 ） 。 デ ー タ は 、 平 均 値 ±標 準 偏 差 (n =3)を 表 す 。 ア ス タ リ ス ク は 、 リ ボ フ ラ ビ ン 添 加 培 地 と リ ボ フ ラ ビ ン 不 含 培 地 に お け る 百 日 咳 菌 の 増 殖 に 有 意 差 が あ る こ と を 示 す (p<0.05)。

統 計 解 析 は 、 T wo- way ANOVA に て 解 析 後 、 ポ ス ト ホ ッ ク 検 定 と し て Bonferroni 検 定 を 行 っ た 。

Fig 12. ル ミ フ ラ ビ ン が 百 日 咳 菌 の 増 殖 促 進 作 用 に お よ ぼ す 影 響

百 日 咳 菌 東 浜 株 を 10 µg/mL リ ボ フ ラ ビ ン と 10 µg/mL ル ミ フ ラ ビ ン 添 加 S/S 培 地 4 m L に 0.01 ×10⁹ cells/mL と な る よ う に 植 菌 し 、 36.5 ℃ で 4 日 間 振 と う (2 00 rpm ) 培 養 し た 。 培 養 容 器 は 、 ガ ラ ス 試 験 管 を 使 用 し た 。 百 日 咳 菌 の 増 殖 は 培 養 4 日 後 の 培 養 液 の OD65 0で 評 価 し た (*, p<0.05;

NS, Not significant ) 。 統 計 解 析 は 、t-検 定 に て 行 っ た 。

Fig 1 3. ル ミ フ ラ ビ ン が 百 日 咳 菌 の 培 養 細 胞 へ の 付 着 性 に お よ ぼ す 影 響 百 日 咳 菌 東 浜 株 を 肺 上 皮 細 胞 ( A549 細 胞 ) 、 お よ び 気 管 支 上 皮 細 胞

(BEAS -2B 細 胞 ) に 感 染 さ せ ( MOI=5 )、 100 µ g/mL ル ミ フ ラ ビ ン 含 有

HBSS (-)中 で 5% CO2存 在 下 36.5 ℃ で 2 時 間 培 養 後 、 各 種 細 胞 に 付 着 し た 百 日 咳 菌 生 菌 数 を 算 定 し た 。 結 果 は ル ミ フ ラ ビ ン 非 添 加 群 の 付 着 菌 数 を 100%と し た と き の 割 合 で 示 し た 。