Title 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA lyase（HMGCL）遺伝子におけるMLPA法を用いた新たな遺伝子診断法の確立( 本文 (Fulltext) ) Author(s) 青山, 友佳 Report No.(Doctoral Degree) 博士(医科学) 連創博甲第29号 Issue Date 2015-09-30 Type 博士論文 Version ETD URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/53645 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
の 1. HMG-CoA lyase とは 2. HMG-CoA lyase 欠損症について 3. MLPA について 4. ACAT1 遺伝子 におけるMLPA の とその 5. Uniparental disomy について の 1. 症例 2. HMGCL 遺伝子の変異 3. MLPA ロ の 4. MLPA の 5. Long range PCR を いた欠 の
6. Comparative genomic hybridization (CGH) と Single nucleotide polymorphism (SNP)
1. 患 と の遺伝子 2. MLPA を いたHMGCL 遺伝子の 3. 症例 1 についての欠 の 4. 症例 2 での CGH とSNP 謝
ケトン体は コ スが に で産生され、 外 に まれて コ スの代 に となるため、血糖 に で る。ケト ン体は血糖 が な乳幼児期に に な を ている。 染症や な の 、 での脂肪酸のβ-酸化系が しケトン体を産生する。それ が血 を して を 外 に れて コ スに代 る として される。 性ケトン体代謝異常症はケトン体の産生障害と 障
害の2 つに でき、産生系の異常は3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA (HMG-CoA) lyase 欠損症、ミトコン アHMG-CoA synthase 欠損症、 系の異常として はβ-ケト T2 欠損症、 シ -CoA:3-ケト酸 CoA ト ンス 欠損症が る。 の異常では低ケトン性低血糖 をきたし、 の異常ではケトアシ シス をきたす。これ の が な には に ること 、 したとして 障害をきたす 性が る。し し、 期の と な が れ な が でき、 常 が で るため、これ 疾患の 期 は 変 で る。 には遺伝子 が で るが、な には 常の での 遺伝子 では変異が できない症例 する。そのような 、 ンを きな欠 や の 性が れる。 に れている変異 は、患 DNA を PCR で し、 ン にて イ トシ ン スによる で るが、この を いた遺伝子 では、 のア に ンを きな欠 や が して 、 う のア が 常で れ PCR では 常なア が されて るため、欠 や を することが
できない。このように イ トシ ンス の欠 は、 できる変異は の や bp の の や欠 けで 、 の欠 や は できないことで る。 にケトン体代謝異常症において 1 ア の変異の されて、 う のア の変異が にな ない患 はこれまでに している。こ のこと 、遺伝子 の では きな欠 や を にするための つ な が め れてきた。このような を とに、 は遺 伝子の や欠 を つ に できる たな遺伝子 として、
Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) に してきた。
この を いることで、 ンのコ の異常が にできる(1-4)。 はこれまでにT2 欠損症の 遺伝子ACAT1 にて MLPA を いて欠 と の が で る を し、 のア での変異が されてい な た患 の ン3-4 の欠 を した(1)。ACAT1 遺伝子では、これま でに Alu が する欠 や の報告がされている(5, 6)。このように、 Alu での による遺伝子の欠 は、い つ の遺伝子疾患に し ていると れる(7)。 が国のHMG-CoA lyase 欠損症患 には、 ア の の変異が さ れていない2 症例が する。HMG-CoA lyase 欠損症は 生児 スス ン の1 疾患に されてお 、 症 の 期 と が め れる 疾患で る。そこで、本 はこのHMG-CoA lyase 欠損症の遺伝子 の つとして本遺伝子のMLPA を し、遺伝子変異が できていないこの 2 症例に して、その となる変異を した。
本 は、 の を とに し
報 に した ので る。
Yuka Aoyama, Toshiyuki Yamamoto, Naomi Sakaguchi, Mika Ishige, Toju Tanaka, Tomoko Ichihara, Katsuaki Ohara, Hiroko Kouzan, Yasutomi Kinosada, Toshiyuki Fukao (2015)
Application of Multiplex ligation-dependent probe amplification, and identification of a heterozygous Alu-associated deletion and a uniparental disomy of chromosome 1 in two patients with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase deficiency. International Journal of Molecular Medicine 35, 1554-1560.
の 1. HMG-CoA lyase とは HMG-CoA lyase HMGCL; EC 4.1.3.4 は のミトコン アに する で 、ロイシンの異化 および脂肪酸β-酸化系 のHMG-CoA をア セト酢酸に代謝すること 、ロイシンの異化およびケトン体の産生に な を たしている Fig. 1 。ケトン体は 外 の な とな てお 、 に、乳幼児期の血糖 には で る。 染症な で 期の や に る には脂肪酸β-酸化が してケトン体を産生し、 にて して血糖を している。このように、HMG-CoA lyase はケトン 体の産生の に 変 な を ている(8)。 本疾患の 遺伝子HMGCL は染色体の 1p36.1 に し、この は 25kb で (9)、9 つの ン され、イントロン には23 の Alu が まれる Fig. 2 。
Fig.2 HMG-CoA lyase 欠損症の 遺伝子HMGCLとAlu
HMGCL 遺伝子の遺伝子 とイントロン の Alu を す。Alu の は
GenBank accession no. NG_013061 の をRepeat Masker http://www.repeatmasker.
org/cgi-bin/WEBRepeatMasker にて した。Alu は トの の で
い で 、 ト の 10 を める。
SINEs(short interspersed elements)の で る。この は 300 の さが
、 で るAlu I にて 識される を こと Alu と け れ
ている。Alu は に 異 に してお 、その 化の で されてきた。
い つ の ミ に れ、 いAlu はJ と Sx、 しい のは Y と
して されている。この ミ は、さ に、い つ の い系 に され
る。HMGCL遺伝子 のAlu は い 代に されたAlu Sx、Alu Jb や
2. HMG-CoA lyase 欠損症について HMG-CoA lyase 欠損症は、常染色体劣性遺伝の形式をとる。本疾患では、ロ イシン由来および脂肪酸β-酸化系由来の HMG-CoA をアセト酢酸へ代謝でき ず、ケトン体の産生が障害される。そのため、乳幼児期に嘔吐や意識障害、痙 攣等を伴う低ケトン性低血糖を引き起こす。HMG-CoA lyase 欠損症は、これま でに、さまざまな国にて100 症例以上の報告がされている(10)。海外における HMGCL 遺伝子のコモンな変異としては、ミスセンス変異の c.122G!A(p.R414)(11)や ンセンス変異の c.109G!T(p.E37 )(12)が る。 本 で これまでにい つ の症例が報告されてきたが(13, 14)、 のとこ 9 症 例が されている。この9 症例では 本 に 異 なコモンな変異は 、 また、2 症例では の 酸 にて されている のの、遺伝子 では のア での変異が されていな た Table 1 。本 では、この変異 を するため、HMGCL 遺伝子へ MLPA の を た。 ＊ ＊ ＊ ＊
3. MLPA について MLPA は とする遺伝子の ンに して 異 に する ロ を し、 イ シ ン イ で することで ンの欠 や を な として し、 れた ントの ンのコ を に す で る。MLPA ロ は とする ンに イ イ する の ロ で る。こ の ロ は、 と の した2 本の ロ で される。 ロ は PCR イ 、 イ イ シ ンシ ンス、ス シ ンスの つ つ。PCR イ は5 と3 のシ ンス へ する め れた で る。 イ イ シ ンシ ンス は とする ンの へ さ るため、 に を う で る。 ス シ ンスは ン との を すために に する Fig. 3 。この 2 本の ロ が とする ンに イ イ された に イ シ ンされ、 化した ロ の が になる。 ロ の には のPCR イ が 、 識された イ を いてPCR を うことで、 化された ロ の が れる。 それ れの ンに する ロ の は め異なる さに す るため、 ンに の さの を ることが で る。 によ 、それ れの されるシ を て、 その ンのコ を に すことができる。ア に欠 が れ ロ は 化されないため はされず、 が れ ロ はその 化されるためPCR 産 する。MLPA
を いれ 、 ンのコ の異常を にすることが となる。 MLPA が遺伝子 に する としては、 とする に 化した ロ の できる 異性、 産 の さの によ 1 の 系で の での が れる 性、そして、2 で が し を れる 性な が れる。MLPA で いる ロ は、すでに、さまざ まな疾患の遺伝子に した ロ が されてお 、 に い れてい る。代 な疾患としては シ ン ストロ が る(2, 3, 15)。 このような症例 が い疾患に してはMLPA ロ が されているため に を い ができる。し し、 な疾患については の ロ はないため、 に疾患遺伝子に する ロ を してMLPA を す る が る Fig. 4 。
4. ACAT1 遺伝子 におけるMLPA の とその
Mitochondrial acetoacetyl-CoA thiolase (T2) EC 2.3.1.9 は におい て、脂肪酸β-酸化 生 るアセトアセ CoA をアセ CoA に代謝して 外 にてケトン体を する と、イ ロイシンの 代謝に 。こ のため、T2 欠損症では 染 の や な でケトン体の産生が すると、 外 がケトン体を できないため血 に してアシ シスをきたす。 T2 欠損症は常染色体劣 遺伝の形式をとる。この疾患の 遺伝子で るACAT1 の は 27kb 、12 の ンにて されイントロンには33 の Alu を つ。これまでに報告されている ACAT1 遺伝子変異には、イントロン 1 と4 に するAlu での による ン2-4 を モ 性の欠 や(6)、イントロン と 9 に するAlu での による ン 8-9 を モ 性の (5)が報告されている。 このような ンの きな欠 や を するための として
ACAT1 遺伝子での MLPA の を た。ACAT1 遺伝子の 12 の ン に して するMLPA ロ は、GenBank accession no. NG_009888 の
ンの を にして イ イ シ ンシ ンスを した。 イ を 、 常コントロ DNA、 ン2-4 を モ 性 の欠 の患 DNA、 ン8-9 を モ 性の の患 DNA、この 2 症例のDNA を 1:1 で し ロ 性の欠 と を した ン を し、それ れMLPA を た。その 、 常コントロ のコ は 2 コ とな にコ の できた。また、 ン 2-4 の モ 性の欠 ではコ は0 コ に、 ン8-9 の モ 性の では4
コ とな 、それ れのコ が に できた。さ に、 ロ 性の欠 と を した ン では、 ン2-4 のコ は1 コ 、 ン8-9 のコ は3 コ とな た。 モ 体の と欠 および ロ 性の欠 と の が とな 、ACAT1 遺伝子においての MLPA が できた。さ にこのMLPA を いて、 イ トシ ン スではACAT1 遺伝子の ン7 にc. 602C>T (p.A201V)変異が のア で されているが、 う のア での変異が されていない患 に ついて を た。その の 、 ン3 と 4 のコ は1 コ とな 、 ン3-4 の欠 が れた。さ にLong range PCR を いて欠 の の を たとこ 、イントロン2 と 4 の Alu での で ることが にな た(1)。ACAT1 遺伝子において し たMLPA にて、 イ トシ ンス では が な ロ 性の ンの欠 を にできた。 はこのT2 欠損症に する MLPA の と ロ 性の ン 3-4 の欠 およびその の の ロ トに 、 の の に する の 、 の に 変 た。
5. Uniparental disomy について
本 ではUniparental disomy によ 引き起こされる HMG-CoA lyase 欠損 症が にな た。Uniparental disomy の 生 について する。 1 のア の2 本と が の 由来する をUniparental disomy と う。 由来する のはMaternal uniparental disomy、 の のをPaternal uniparental disomy と される。Uniparental disomy には、さ
にUniparental heterodisomy と Uniparental isodisomy の 2 つの イ が る。Uniparental heterodisomy は 1 の 染色体は の1 の染色体
本 には 性で るが、Uniparental isodisomy は の の染色体の
2 化によ て てお 、その染色体に異常が すると モ とな 、
常染色体劣性遺伝性疾患が 症する 性が で る。 トにおいて
Uniparental disomy は染色体 よ て引き起こされる。 れる な にはgamete complementation、 trisomy rescue、monosomy duplication、 somatic crossing over な が る(16, 17)。gamete complementation は、 2 本の染色体を つ 子とnullsomy の 子との 体によ 生 る。 trisomy rescue は染色体 によ の の染色体を2 本 け 、
には3 本の染色体が するが、その の で な染色体
が する。 の2 本の染色体の が すれ 常となるが、2 本
に た にはUniparental disomy を引き起こす。monosomy duplication
は染色体 によ 由来の染色体を たず、 う の に由来する染
色体が の で され、 2 本のア を つ となる。
て変異の る 染色体の が な 、 なisodisomy として れる Fig. 5 。このように、Uniparental disomy の 症 は で る。
Fig.5 Uniparental disomy の 生
Uniparental disomy の 生 について す。 の染色体を 色および 色にて
し、 色は2 つのア を して色を し変 て る。染色体の の 色
で した 色の インは変異を す。 常に染色体が される には、 ずつの
子が 体とな 体 を形 する。gamete complementation では、 2
の によ 生 た2 本の染色体が する 子とnullsomy の 子との 体
によ uniparental heterodisomy を生 る。trisomy rescue では 2 の に
染色体 によ の 2 本の染色体を け 、 にはト ミ の 体
となるが、その 、 の で な染色体が れる。2 本を け い
の2 本の染色体の が れれ uniparental disomy にはな ないが、1 本
を け い 染色体が れるとuniparental heterodisomy を引き起こす。monosomy
duplication は 2 の染色体 によるnullsomy の 子と 常な 体
の で生 、resucue のため 1 本の染色体が の で されて 染
色体を つuniparental isodisomy となる。somatic crossing over は の体 に
おける 染色体の と の に生 る。この は なisodisomy として
の 本でのHMG-CoA lyase 欠損症はこれまでに 9 症例の報告が るが、う 2 症例は の 酸 にて されている のの、遺伝子 では のア での変異が されていない。本 では、この変異を にするため、 また の 症例の遺伝子変異 のためにHMGCL 遺伝子への MLPA を し、この2 症例の遺伝子 を た。
1. 症例 症例1
13 児、血 ではない 生まれた。生 2 に低ケトン性
低血糖症をきたした。また、6、8、13 の で を生 、13
に 酸 にて3-methylglutaconate 、3-hydroxymethylglutarate、 3-hydroxy-3-methylglutarate が され、HMG-CoA lyase 欠損症と
された。患 は 、て や を している。遺伝子 では ン にc. 31C>T (p.R11 )が されたが、 う のア の変異が されていな た。 症例2 8 児、 は血 ではない。 は生 3 、上 を起 こし嘔吐と意識障害が生 た。 酸 と血 アシ ン によ HMG-CoA lyase 欠損症と された。 は4 で 、その 10 以上の低ケトン性低血糖 を生 た。 、 常に している。遺伝 子 では ン3 にc. 242G>A (p.W81 )が モ 体のように され たが、 はこの変異を てお ず、 由来のア の変異が されて いないと れた(13)。
2. HMGCL 遺伝子の変異
本 の遺伝子 は 等 の を て した。
変異 に いるDNA は 血 、Sepa Gene Kit (Sanko Junyaku Co., Ltd., Tokyo, Japan)によ を た。変異の は、 ンとイントロ ンの を を する5’ と 3’ の イ セ ト Table 2 を
Tab le 2 . Ampli fi cati on pri mer for HM GC L ex on s. Ex on Fo w ard pri m er Sequence Re ve rse pr imer Se qu en ce Pr oduct size (b p) 1 H L 1s 5' -G T GGA G C C A GC T T C G G A A G T -3' HL 1a s 5' -G GG A GGG T C C A G G A C TC C A A C G-3' 32 4 2 HL2 s 5' -A T GAA T T CG GTCTCCCTG G G A A T TG-3 ' H L 2a s 5' -T A A CTTG TGCA GA GG AATCA CATC -3 ' 27 5 3 HL 3s 5'-AT GAAT T C T G C A T T TT GAG GC T G T T T -3' HL 3a s 5'-TTTG C TGC A AC AC A G TG C T ATG -3' 32 5 4 HL4s 5' -A T GAA T T CCTGCTCTTGG T GAT G A C T-3' H L 4as 5' -G A T C A CAG A GCA G T G A G TG GC A -3 ' 31 4 5 HL5 s 5' -G A A C CCAGG A G GT G G A G G T T G C A -3 ' H L 5a 5' -A T A AG CTTGA A C G G T A C A G A G GAA AG GA -3 ' 32 9 6 H L 6s 5' -C TG GC AC TG A A T T G T AC C A T-3' H L 6a s 5' -G G G T G A A TG A A TG AAG TCA G G A -3 ' 33 6 7 HL7s 5' -A A C TG AGTGCG T CA T A CCC AGA-3' H L 7as 5' -C A G AGC TGT A C A C T T C AC A T C T G-3 ' 47 3 8 HL8 s 5' -A T GAA T T CG GCA A C A G A C G AT TGG G -3 ' H L 8a s 5' -G A G C C A C TG C G CCTGG C T AA CC-3' 36 6 9 H L 9s 5' -C C T G G TG T T GA GG G C A T AC C-3' H L 9a s 5' -T GCCA GG AG AG AC CT CT G T G T A -3 ' 30 0
3. MLPA ロ の
MLPA ロ の イ イ シ ンシ ンスに いるHMGCL 遺伝
子9 つの ンの には、NCBI イトの Reference Sequence: NG_013061 を いた。この を に、 トで るHuman MLPA probe design program(18)を いて ロ の を た。 ンに するこのMLPA
ロ は、4 の をつけて104 136 の異なる さに して
Tab le 3. M L PA probes fo r HM GCL gene. E xon Pr od uc t le ngt h (base) Pri m er nam e Length Probe sequen ce 1 104 MLP A -H M G CLEX 1L 5 0 GG GTT C CC TAAGGG TT G G A 501 6TG GA CTG C C G C G G G GG A TTC TG GG CC A A G A T MLP A -H M G CLEX 1R 5 4 504 7G G C A GC A A T G A G G A AG GC GC TTC CG CG GC GA T C TAGATT G G A T C T T G C T G G C AC 2 108 MLP A -H M G CLEX 2L 5 2 GG GTT C CC TAAGGG TT G G A 987 2CAC C T C A T C T AT GGGC ACTT TAC C A A AG CG GG T MLP A -H M G CLEX 2R 5 6 990 5G A AA A T TG T G GA A G T T GG TCC C C G A G A TGG A C T T C T A G A T T G GAT C T T G C T GGCAC 3 112 MLP A -H M G CLEX 3L 5 4 GG GTT C CC TAAGGG TT G G A 129 25G A AG CA GG A C TCT C TG T T AT A G AAACCA C CAGCTT MLP A -H M G CLEX 3R 5 8 129 60T G TGT CT CCT A AGT GGGT TCCCCAGGT G A G C CCT A TCT A GAT TGG A TCT T G C T G G C A C 4 116 MLP A -H M G CLEX 4L 5 6 GG GTT C CC TAAGGG TT G G A 137 30T T C C T GGCA T CAA C T A CC CA GT C C T G AC CC CA AA TT T MLP A -H M G CLEX 4R 6 0 137 67G AAAGG C T T C G A GGCAGCGG T A A GAGG A T A G CT T G T T TCTAGA TT G GAT CTT G CT G G CAC 5 120 MLP A -H M G CLEX 5L 5 8 GG GTT C CC TAAGGG TT G G A 161 93TTG TTC C A T A G A G G A G A G T TTTC A G A G GTT TG A C G C AA T MLP A -H M G CLEX 5R 6 2 162 32CCT GA AGG C A G C G C A G T CA GC CA A T ATT T CT G T G C G G G G T C TAGATT GGA T C TT G C T G G C A C 6 124 MLP A -H M G CLEX 6L 6 0 GG GTT C CC TAAGGG TT G G A 196 36TCA T TC C T C C C C TG TCT T CC CAC A G G TA CG TCT C C T G T GC T MLP A -H M G CLEX 6R 6 4 196 77CT TG G C T G CC CT T A TG AA G G G A A G AT CT C C C C A G CT AAA GT TCT A GA T T GGA TCT T GCT G G C A C 7 128 MLP A -H M G CLEX 7L 6 2 GG GTT C CC TAAGGG TT G G A 221 52T A CT CA A T G G GCT G CT ACGA G A T C T C CCTGGGGG A C ACCA T T G MLP A -H M G CLEX 7R 6 6 221 95G T GTGG GCA CCCCAG G G A TCATGA AAGACATGCTA TCTGCTGT T C T A GA T T GG A T CT T G C T GG C A C 8 132 MLP A -H M G CLEX 8L 6 4 GG GTT C CC TAAGGG TT G G A 259 30TCT A G A TG GG A G TG A G TG TC GTG G A C TC TTC TG TGG CA GG ACT T G MLP A -H M G CLEX 8R 6 8 259 75G A GGCT G TCCC T A CGCA CA GGG GG C A T C A G GAA A CTTG GCCA CAG T C T A GA T T GG A T CT T G C T GG CA C 9 136 MLP A -H M G CLEX 9L 6 6 GG GTT C CC TAAGGG TT G G A 279 75CT C A G G C T A C C T G T A A A CT CT G A G C C CCT T G C CC A C CT G A A G CC CT G MLP A -H M G CLEX 9R 7 0 280 22GG GA TGA TGT GG A A A T AG GG G C A C ACA C A G A T GA T T CA TGG A T G G G G TC TA G A TTG G A T C TTG CT GG CA C Le ft p rim er s eque nc e (5 '-3 '), GGGT T C CCT A A GGGT T G GA; Rig ht p ri m er se qu en ce ( 5'-3' ), TCT A GATTG GA T C T T GCTGG C AC; H yb rid iz at io n se qu en ce s are sh ow n in it ali cs .
4. MLPA の
MLPA の はMRC-Holland の MRC-Holland BV, Amsterdam, The Netherlands に いて した。 スト ン は患 DNA、
ンス ン にはHMGCL 遺伝子に異常のない 常 DNA を 3 体 いた。 変性 DNA は TE にて し20ng/ l とした。これを96well トへ5 l ずつ した。 トを イ にセ トし98 5 にてDNA 変性を た。 、 イ が25 にな たことを して、 トを した。 イ イ シ ン
HMGCL 遺伝子へ した ロ とP200-A1 ロ を probe mix とSALSA MLPA buffer の 1.5 l の を、変性さ たDNA l に し
3 l した。 イ に トをセ トし、95 1 の 変 性の 、60 16-20 で イ イ シ ンを た。 イ シ ン イ シ ンミ スは1 ン た Ligase Buffer A および B を 3 l、Ligase-65 を 1 l、 25 l にて 、 上にて した。 イ イ シ ン ロ を し、 トはセ トしたまま イ を54 に た。 イ 上で イ シ ンミ スを
well へ 32 l ずつ ン によ した 、54 15 の
イ シ ン を た。 、98 5 の 20 にて 、
イ した。
PCR:
Polymerase mix は 1well た SALSA PCR Primer Mix 2 l、SALSA Polymerase 0.5 l、 を7.5 l の とし、 は 上にて した。
イ シ ン産 の た well に Polymerase mix 10 l を
ン によ した。 トを イ にセ トしてPCR を
た。PCR は95 30 、60 30 、72 1 を35 イ い、72 20 の 、15 にて た。
Hi-Di Formamide mix は Hi-Di Formamide 9 l、Gene Scan-500 Size Standard 0.3 l で 1 た 9.3 l を した 、PCR 産 を 0.7 l て
した。86 で 2 イン ト 、 して シ
ス ABI 3130xl (Applied Biosystems, Warrington, UK)にて を い、
した ンに するDNA を した。
ント
Gene Mapper V.4.0 にて ント を た。 ンの
をExcel 2003 にて した。HMGCL ロ とP200-A1 ロ を とに した は、P200-A1 ロ での に するHMGCL ロ の の を め 化した。さ に、 ロ につい て スト ン 患 DNA と ンス ン 常 DNA の を し、 シ を し ン の 化を い、コ を た。 5. Long range PCR を いた欠 の 症例1 は、イントロン 1 と 4 の にて欠 が れたため、3 つの イ アを して の を た。 ントA は、センス イ にはイントロン1 のg.6421-6445 に したIn1s1 とアン センス イ には ン5 のg.16255-16231 に したEx5as を いて し た。 ントB は、センス イ にはイントロン1 のg.8701-8725 に したIn1s3 とアン センス イ にはEx5as を いて した。 ントC は、センス イ にはIn1s3 とアン センス イ は イントロン4 のg.15110-15088 に し した Table 4 。 イ
に いたHMGCL 遺伝子の はGenBank accession no. NG_013061 に
き した。
PCR の は、94 1 、64 2 、72 2 の に40 イ い、 イ 75 5 にて さ た。PCR には Takara PCR thermal cycler と にはTakara r-Taq (Takara Shuzo Co., Ltd., Shiga, Japan)を
USA)ࢆ⏝࠸࡚⾜ࡗࡓࠋࡑࡢᚋࠊྛࣇࣛࢢ࣓ࣥࢺࡢࢩ࣮ࢡ࢚ࣥࢫࢆ⾜ࡗࡓࠋ
6. Comparative genomic hybridization (CGH)ἲ Single nucleotide polymorphism (SNP)ゎᯒ
2 ࡛ࡣࢤࣀ࣒యࡢࢥࣆ࣮ᩘゎᯒࢆ⾜ࡗࡓࠋゎᯒࡣࠊAgilent SurePrint G3 Hmm CGH + SNP 180K Microarray Kit㸦Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA㸧ࢆ⏝࠸࡚ᵝㄝ᫂ᚑ࠸᧯సࡋࡓࠋᮎᲈ⾑ࡽᢳฟࡋࡓ DNA ࢆࢸࣥࣉ࣮ࣞࢺ ࡋ࡚⏝࠸ࡓࠋࢹ࣮ࢱࡣFeature Extraction version 9 (Agilent Technologies) ࡚ᢳ ฟࡋࠊࡑࡢ⤖ᯝࡣAgilent Genomic Workbench version 6.5 (Agilent Technologies) ࢆ⏝࠸࡚ྍどࡋࡓࠋ
Table 4. Amplification primer of deletion breakpoint characterization.
Fragment Primer Sequence Position
A In1s1 5'-ACGA ACGGTGGTA A AGAGGCA ACAG-3' g.6421-6445
Ex5as 5'-TTGGCTGACTGCGCTGCCTTCAGGA-3' g.16255-16231
B In1s3 5'-GTGATGATTCCAGGAGGTCAGA GGA-3' g.8701-8725
Ex5as 5'-TTGGCTGACTGCGCTGCCTTCAGGA-3' g.16255-16231
C In1s3 5'-GTGATGATTCCAGGAGGTCAGA GGA-3' g.8701-8725
1. 患 と の遺伝子 症例1 は ン にc. 31C>T (p.R11 )の ロ 性の変異を した。 し し、 に した は 変異を てお ず、 のア での変 異は にな な た(Fig. 6)。また、 のDNA は が で 変異の はできな た。症例 では のア に、 ン1 を な欠 を つ 性が れた。 Ŗ *
症例2 では ン3 にc. 242G>A (p.W81 )が モ 性のように さ れた。し し では、 はp.W81 の ロ 性に変異が したが、 にはp.W81 の変異が しな た(Fig. 7)。このこと 、症例2 につ いては 由来のア での ン3 を 欠 を た。 Ŗ * Ŗ
2. MLPA を いたHMGCL 遺伝子の HMGCL 遺伝子への MLPA は、9 つの ンでのコ が でき できた。3 つのコントロ てにおいて、 ンに の ン が れたこと 、患 とその でのコ が とな た。 症例1 と の では、 ン2-4 のコ が1 コ を した。その の ンのコ は2 コ で た。このこと 、 け い ア に ン2-4 を きな欠 が された。 症例2 の にて、患 はp.W81 モ、 が p.W81 へ ロ、 が 常と の遺伝形式が ないこと 、 由来の遺伝子 の欠 を い MLPA を た 、その変異を ン3 の な ず、 ての ンのコ は患 と と に2 コ で 、 で た。この を するには、この患 のHMGCL 遺伝子 がPaternal uniparental disomy で る 性を た Fig. 8 。
3. 症例 1 についての欠 の
症例1 のDNA を いた Long range PCR は、その ント 4kb の欠 が にな た Fig. 9A 。さ に、シ ンスの
は、この欠 はg.9326 g.13806 ( NG_013061) の に し、4481
bp に な欠 で ることが した。また、この欠 の はイン
トロン1 の Alu の を 、 う はイントロン4 のAlu が しない で ることが できた Fig. 9B 。
A
6.2 kb 4.2 kb 3.4 kb 2.6 kb Size marker Ȝ6 Frag m e nt A Frag m e nt B Frag m ent C Patient 14. 症例 2 での CGH とSNP
HMGCL のコ とSNP ロ イ を にするために、CGH
SNP ア イを いた イ ロア イ を た。ア イCGH は、 のコ を す。1 染色体のLog2 は 0 を し、コントロ と コ
に異常はな た。SNP は で されないア の を して
いる。 は、 てで0 2 を し Loss of heterozygosity (LOH)を した。 2 つの 、CGH ア イではHMGCL 遺伝子 を 1 染色体のコ
には異常はな たが、SNP ではHMGCL の する 染色体 てにおいてLOH で た Fig. 10 。このこと 、この患 は1 染色体 の Paternal uniparental isodisomy で ることが にな た。
本のHMGCL 欠損症 2 症例について、 ン シ ンスを いた遺伝 子 では、それ れの患 に変異を したが、さ に した の ではその変異の遺伝形式が の で していな た。 トのHMGCL 遺伝子 は 25kb のな に 23 の Alu を する遺 伝子で る。そこで、 はこの2 つの症例の変異は Alu での によ 引き起こされる ロ 体の欠 で るとの を てた。 これ の変異を するためには、HMGCL 遺伝子の ンのコ を る が た。このこと 、本 ではHMGCL 遺伝子において MLPA を いた たな の を た。 症例1 は、 のp.R11 変異を け いでいたが、 け い 変異は ン シ ンスでは できな た。MLPA を いた症例 と の では ン2-4 のコ が1 コ で 、 した 欠 が にな た。し し、この の欠 はAlu による によ 引き起こされる欠 ではな た。欠 の はイント ロン1 に るAlu Sx で 、 う はイントロン4 のAlu は し ない で た。この の には はな 、この欠 を引き起 こす は にはな な た。 症例2 では p.W81 モ 性の変異に たが、 はp.W81 ロ 性 の変異で たが、 はこの変異が め れな た。この は の遺伝形式が ず、患 の変異は けの上でのp.W81 モ 性 の変異で ると れ、この変異を するためにMLPA を いてコ
の を た。し し、MLPA では、患 、 、 にHMGCL 遺
伝子の ンのコ は 常で ることが にな た。PCR と MLPA
の 、この患 はHMGCL 遺伝子 が のア を2 つ つ
Uniparental disomy ではない と たな を てた。この変異を するため CGH+SNP ア イ を たとこ 、この患 はHMGL 遺伝子 の で な 、1 染色体 体のPaternal uniparental isodisomy で ることが
にな た。
本症例で生 た1 染色体の2 コ の 症 はmonosomy duplication が
れる。これは、 2 の に生 た の染色体 によ
nullsomy の 子が生 、 の異常遺伝子を つ 子と することで の 遺伝子のmonosomy とな 、さ に体 のmonosomy rescue によ
由来の 染色体が2 化することによ て起きたと れる。 染
色体の または 体のUniparental disomy によ 生 る疾患に、 症 (19)、 欠損症(20)、Pelizaeus-Merzbacher-like (21)、Stargardt (22)、 ン 体欠損症(23)、Rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2(24)、CD45 deficient severe combined immunodeficiency(25)な の報告が
、1 染色体が するUniparental disomy は、その によ て引き起 される疾患が き 異な ている。 本 では、HMGCL 遺伝子の PCR 、MLPA 、CGH+SNP ア イの 、症例2 が の1 染色体 体の で ることを にした。 の る 、本 での症例はUniparental disomy によ 引き起される HMGCL 欠損症の めての報告で る。
本 にてHMGCL 遺伝子へ したMLPA は、 常の遺伝子 では めて が な ロ 体の遺伝子変異の識 ができ、さ なる遺伝子 の 上に がることを した。また、MLPA はCGH のように 体を できる ではないが、 の遺伝子の ンのコ を でき、 ンを 欠 、 の に つことが にな た。 、 し される患 での遺伝子 を にする の つとなるで う。
謝 本 の および の に た 、 いた きました 報 に よ 謝いたします。 けでな としての まで ていた けたことを、 の にてし していきたいと てお ます。 本 および の 等、 に た いた きました 系 児 に 謝いたします。 では し いつ たた い を て いた きました。 識や は のこと、 することの さや に る としての な 生 ことはとて 、 とて できたと てお ます。 また、本 の に し、 および を ました 報 、 、 に 謝いたします。 本 を めるに た いた いた患 さ と 、 を さ れて る の 生 、 を いた き イ ロア イ に てUniparental disomy という を いて さいました 子 本 に お し上 ます。
遺伝子 において 系 児 の さ 、 の さまには 変お にな ました。 の に た な で けていた きました。 よ お し上 ます。 この をお して、 の を に けて れた と の そして の 生 を して れた と2 の 、 と に 謝の意を したいと います。 本 が 代謝異常症の患 さ とその への の となること を い謝 といたします。
1. Fukao, T., Aoyama, Y., Murase, K., Hori, T., Harijan, R.K., Wierenga, R.K., Boneh, A. and Kondo, N. (2013) Development of MLPA for human ACAT1 gene and identification of a heterozygous Alu-mediated deletion of exons 3 and 4 in a patient with mitochondrial acetoacetyl-CoA thiolase (T2) deficiency. Molecular genetics and metabolism, 110, 184-187.
2. Gatta, V., Scarciolla, O., Gaspari, A.R., Palka, C., De Angelis, M.V., Di Muzio, A., Guanciali-Franchi, P., Calabrese, G., Uncini, A. and Stuppia, L. (2005) Identification of deletions and duplications of the DMD gene in affected males and carrier females by multiple ligation probe amplification (MLPA). Hum Genet, 117, 92-98.
3. Janssen, B., Hartmann, C., Scholz, V., Jauch, A. and Zschocke, J. (2005) MLPA analysis for the detection of deletions, duplications and complex rearrangements in the dystrophin gene: potential and pitfalls. Neurogenetics, 6, 29-35.
4. Lalic, T., Vossen, R.H., Coffa, J., Schouten, J.P., Guc-Scekic, M., Radivojevic, D., Djurisic, M., Breuning, M.H., White, S.J. and den Dunnen, J.T. (2005) Deletion and duplication screening in the DMD gene using MLPA. European journal of human genetics : EJHG, 13, 1231-1234.
5. Fukao, T., Zhang, G., Rolland, M.O., Zabot, M.T., Guffon, N., Aoki, Y. and Kondo, N. (2007) Identification of an Alu-mediated tandem duplication of exons 8 and 9 in a patient with mitochondrial acetoacetyl-CoA thiolase (T2) deficiency. Molecular genetics and metabolism, 92, 375-378.
6. Zhang, G., Fukao, T., Sakurai, S., Yamada, K., Michael Gibson, K. and Kondo, N. (2006) Identification of Alu-mediated, large deletion-spanning exons 2-4 in a patient with mitochondrial acetoacetyl-CoA thiolase deficiency. Molecular genetics and metabolism, 89, 222-226.
7. Sen, S.K., Han, K., Wang, J., Lee, J., Wang, H., Callinan, P.A., Dyer, M., Cordaux, R., Liang, P. and Batzer, M.A. (2006) Human genomic deletions mediated by recombination between Alu elements. American journal of human genetics, 79, 41-53.
8. Fukao, T., Mitchell, G., Sass, J.O., Hori, T., Orii, K. and Aoyama, Y. (2014) Ketone body metabolism and its defects. Journal of inherited metabolic disease, 37, 541-551.
9. Wang, S.P., Robert, M.F., Gibson, K.M., Wanders, R.J. and Mitchell, G.A. (1996) 3-Hydroxy-3-methylglutaryl CoA lyase (HL): mouse and human HL gene (HMGCL) cloning and detection of large gene deletions in two unrelated HL-deficient patients. Genomics, 33, 99-104.
10. Pie, J., Lopez-Vinas, E., Puisac, B., Menao, S., Pie, A., Casale, C., Ramos, F.J., Hegardt, F.G., Gomez-Puertas, P. and Casals, N. (2007) Molecular genetics of HMG-CoA lyase deficiency. Molecular genetics and metabolism, 92, 198-209.
11. Al-Sayed, M., Imtiaz, F., Alsmadi, O.A., Rashed, M.S. and Meyer, B.F. (2006) Mutations underlying 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA lyase deficiency in the Saudi population. BMC medical genetics, 7, 86.
12. Cardoso, M.L., Rodrigues, M.R., Leao, E., Martins, E., Diogo, L., Rodrigues, E., Garcia, P., Rolland, M.O. and Vilarinho, L. (2004) The E37X is a common HMGCL mutation in Portuguese patients with 3-hydroxy-3-methylglutaric CoA lyase deficiency. Molecular genetics and metabolism, 82, 334-338.
13. Tomoko, T., Takanori, S., Kazumi, O., Miho, S., Maki, S., Kenichi, S., Hiroko, K., Katsuaki, O., Hironori, K. and Tohru, Y. (2008) A case of 3-Hydroxy-3-methylglutaryl CoA lyase deficiency. J Jpn Pediatr Soc, 112, 1249-1254.
14. Muroi, J., Yorifuji, T., Uematsu, A., Shigematsu, Y., Onigata, K., Maruyama, H., Nobutoki, T., Kitamura, A. and Nakahata, T. (2000) Molecular and clinical analysis of Japanese patients with 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA lyase (HL) deficiency. Human Genetics, 107, 320-326.
15. Lai, K.K., Lo, I.F., Tong, T.M., Cheng, L.Y. and Lam, S.T. (2006) Detecting exon deletions and duplications of the DMD gene using Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). Clinical biochemistry, 39, 367-372.
16. Ledbetter, D.H. and Engel, E. (1995) Uniparental disomy in humans: development of an imprinting map and its implications for prenatal diagnosis. Human molecular genetics, 4 Spec No, 1757-1764.
17. Spence, J.E., Perciaccante, R.G., Greig, G.M., Willard, H.F., Ledbetter, D.H., Hejtmancik, J.F., Pollack, M.S., O'Brien, W.E. and Beaudet, A.L. (1988) Uniparental disomy as a mechanism for human genetic disease. American journal of human genetics, 42, 217-226.
18. Zhi, J. and Hatchwell, E. (2008) Human MLPA Probe Design (H-MAPD): a probe design tool for both electrophoresis-based and bead-coupled human multiplex ligation-dependent probe amplification assays. BMC genomics, 9, 407.
19. Wassink, T.H., Losh, M., Frantz, R.S., Vieland, V.J., Goedken, R., Piven, J. and Sheffield, V.C. (2005) A case of autism and uniparental disomy of chromosome 1. Hum Genet, 117, 200-206.
20. Zeng, W.Q., Gao, H., Brueton, L., Hutchin, T., Gray, G., Chakrapani, A., Olpin, S. and Shih, V.E. (2006) Fumarase deficiency caused by homozygous P131R mutation and paternal partial isodisomy of chromosome 1. American journal of medical genetics. Part A, 140, 1004-1009.
21. Shimojima, K., Tanaka, R., Shimada, S., Sangu, N., Nakayama, J., Iwasaki, N. and Yamamoto, T. (2013) A novel homozygous mutation of GJC2 derived from maternal uniparental disomy in a female patient with Pelizaeus-Merzbacher-like disease. Journal of the neurological sciences, 330, 123-126.
22. Riveiro-Alvarez, R., Valverde, D., Lorda-Sanchez, I., Trujillo-Tiebas, M.J., Cantalapiedra, D., Vallespin, E., Aguirre-Lamban, J., Ramos, C. and Ayuso, C. (2007) Partial paternal uniparental disomy (UPD) of chromosome 1 in a patient with Stargardt disease. Molecular vision, 13, 96-101.
23. Le Beyec, J., Cugnet-Anceau, C., Pepin, D., Alili, R., Cotillard, A., Lacorte, J.M., Basdevant, A., Laville, M. and Clement, K. (2013) Homozygous leptin receptor mutation due to uniparental disomy of chromosome 1: response to bariatric surgery. The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 98, E397-402.
24. Nimmo, G., Monsonego, S., Descartes, M., Franklin, J., Steinberg, S. and Braverman, N. (2010) Rhizomelic chrondrodysplasia punctata type 2 resulting from paternal isodisomy of chromosome 1. American journal of medical genetics. Part A, 152a, 1812-1817.
25. Roberts, J.L., Buckley, R.H., Luo, B., Pei, J., Lapidus, A., Peri, S., Wei, Q., Shin, J., Parrott, R.E., Dunbrack, R.L., Jr. et al. (2012) CD45-deficient severe combined immunodeficiency caused by uniparental disomy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 109, 10456-10461.
の となる
1. Yuka Aoyama, Toshiyuki Yamamoto, Naomi Sakaguchi, Mika Ishige, Toju Tanaka, Tomoko Ichihara, Katsuaki Ohara, Hiroko Kouzan, Yasutomi Kinosada, Toshiyuki Fukao (2015) Application of Multiplex ligation-dependent probe amplification, and identification of a heterozygous Alu-associated deletion and a uniparental disomy of chromosome 1 in two patients with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase deficiency. International Journal of Molecular Medicine 35, 1554-1560.
その の
1. Vatanavicharn N, Yamada K, Aoyama Y, Fukao T, Densupsoontorn N, Jirapinyo P, Sathienkijkanchai A, Yamaguchi S, Wasant P (2015) Carnitine-acylcarnitine translocase deficiency: Two neonatal cases with common splicing mutation and in vitro bezafibrate response. Brain Development, 37, 1554-1560.
2. Fukao T, Akiba K, Goto M, Kuwayama N, Morita M, Hori T, Aoyama Y, Venkatesan R, Wierenga R, Moriyama Y, Hashimoto T, Usuda N, Murayama K, Ohtake A, Hasegawa Y, Shigematsu Y, Hasegawa Y (2014) The first case in Asia of 2-methyl-3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase deficiency (HSD10 disease) with atypical presentation. Journal of Human Genetics, 59, 609-614. 3. Fukao T, Mitchell G, Sass JO, Hori T, Orii K, Aoyama Y (2014) Ketone body metabolism and its defects. Journal of Inherited Metabolic Disease, 37, 541-551.
4. Akella RR, Aoyama Y, Mori C, Lingappa L, Cariappa R, Fukao T (2014) Metabolic encephalopathy in beta-ketothiolase deficiency: the first report from India. Brain Development, 36, 537-540.
5. Fukao T, Aoyama Y, Murase K, Hori T, Harijan RK, Wierenga RK, Boneh A, Kondo N (2013) Development of MLPA for human ACAT1 gene and identification of a heterozygous Alu-mediated deletion of exons 3 and 4 in a patient with mitochondrial acetoacetyl-CoA thiolase (T2) deficiency. Molecular Genetics and Metabolism, 110, 184-187.
